Name: Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez la détection et l'isolement de cellules T IL-17-sécrétrices de souris viables en immunologie. Cette méthode utilise l'assay de sécrétion de cytokines pour identifier les lymphocytes TH17 actifs.

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Préparation des réactifs <ol><li> Faire un tampon contenant du PBS avec BSA (0,5%), et 2 mM d&#39;EDTA. Parce que les bulles d&#39;air peuvent bloquer les colonnes de séparation MACS, le tampon doit être dégazée et stocké à 2-8 ° C avant utilisation. </li><li> Nous utilisons un milieu RPMI 1640 contenant du sérum de souris de 5%. Le milieu de culture ne doit pas contenir de BSA ou FCS, car ces composés va modifier la spécificité de la stimulation cellulaire. </li><li> L&#39;IL-17 Souris Assay sécrétion - enrichissement cellulaire et le kit de détection de Miltenyi-Biotec. Le kit contient les éléments suivants: l&#39;IL-17 Réactif Catch, l&#39;IL-17 anticorps de détection (biotine), l&#39;anti-biotine-PE, et les microbilles anti-PE. </li></ol> Stimuler les splénocytes <ol><li> Ce protocole est effectuée en présence d&#39;un contrôle positif et négatif, comme splénocytes non stimulées et une contre-coloration des cellules T. Ce protocole est réalisé en utilisant une technique stérile. </li><li> Préparer une suspension cellulaire unique de splénocytes de souris qui ont été isolés en utilisant les dissociateur gentleMACS ™. La concentration des cellules devraient être prédéterminés par le comptage des cellules. Pellet les cellules à 200 g pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Après la centrifugation, aspirer le surnageant hors du culot à l&#39;aide d&#39;une pipette. Ne pas transvaser le tube pour éviter la perte de la pastille. </li><li> Maintenant, remettre en suspension les cellules dans le milieu de culture et ensuite ajouter à un puits. Ajouter moyennes suffisante pour une concentration de dix millions de cellules par ml et cinq millions de cellules par cm carré. </li><li> Afin de stimuler une réponse immunitaire dans nos cellules en suspension, nous ajoutons ionomycine (1 pg / ml) et PMA (10 ng / mL) à l&#39;échantillon et mélanger la solution par un léger pipetage de haut en bas. Puis les puits sont étiquetés en conséquence. </li><li> Maintenant, nous allons incubation de nos cellules pour 3 heures à 37 ° C sans mélange de commencer la période de stimulation. Passez à l&#39;IL-17 à 3 heures de l&#39;analyse du début de la stimulation, afin de planifier en conséquence. </li><li> Pour arrêter la sécrétion, les cellules sont placées sur la glace et nous recueillons les cellules stimulées par un léger pipetage de haut en bas avec le tampon froid. Les cellules sont ensuite transférées à partir du puits d&#39;un tube et sont lavés une seconde fois. </li><li> Afin de s&#39;assurer que toutes les cellules sont recueillies, c&#39;est une bonne idée de vérifier votre plat sous un microscope. Si les cellules restent encore attachés, vous pouvez collecter les cellules restantes en rinçant la vaisselle avec du tampon froid. Tout amas de cellules dans votre suspension cellulaire peut être enlevé en utilisant les filtres de pré-séparation. </li></ol> Marquage des cellules avec le réactif Catch <ol><li> Il est primordial de noter que ce test fonctionne de manière optimale si moins de 2% de l&#39;IL-17-cellules sécrétrices sont présents. </li><li> Si la concentration de cellules sécrétant de l&#39;IL-17 devrait être supérieure à 2% des volumes d&#39;ajuster en conséquence. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Figure 8" width="500" height="162" /></li><li> Un écueil potentiel de cette procédure est la contamination croisée des réactifs Catch, qui peuvent survenir lors de l&#39;étiquetage lorsque l&#39;anticorps bi-spécifique se lie à une cellule T non sécrétant et des pièges de l&#39;IL-17 sécrétée par un lymphocyte voisins, générant ainsi des faux positifs. </li><li> Afin de contourner ce problème, il est essentiel de cellules refroidir avant de l&#39;étiquetage et à travailler avec tampon froid pour ralentir la diffusion de l&#39;IL-17 et d&#39;éviter cette contamination croisée. En plus de maintenir les cellules froides, ils doivent être maintenus à une concentration définie. </li><li> Pour commencer la procédure de labellisation, nous utilisons dix millions de cellules dans un tube de 15 ml refermable. Si le nombre de cellules supérieur doivent être utilisés, il suffit de l&#39;échelle de tous les volumes en conséquence. Une fois la concentration cellulaire optimale a été obtenue, laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon froid. </li><li> Isoler les cellules à 300 g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée (2-8 ° C). </li><li> Après la centrifugation, aspirer le surnageant complètement en utilisant une pipette. Ne pas transvaser le surnageant que cela mènera à la perte de cellules et les volumes imprécis. Répéter l&#39;étape de lavage qui consiste à ajouter 10 ml de tampon froid, centrifugation, et l&#39;aspiration. </li><li> Maintenant que nous avons une pastille de pureté désirée, remettre en suspension les cellules dans 80 uL de milieu de culture froide. Pour eux, l&#39;étiquette, nous allons maintenant ajouter 20 ul de souris IL-17 Réactif Catch. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 minutes sur la glace. </li><li> Après la période d&#39;incubation de 5 minutes sur la glace, enlever le tube et diluer les cellules dans 10 ml de 37 ° C mi-chaud. Fixez ensuite le tube sur le Tube Rotator MACSmix et incuber le tube à 37 ° C pendant 45 min sous un mouvement continu. Augmenter la température à 37 ° C redémarre sécrétion de cytokines. </li></ol> Marquage des cellules avec l&#39;anticorps de détection IL-17 (biotine) et anti-biotine-PE <ol><li> Après la période de sécrétion de 45 minutes à 37 ° C, placer le tube immédiatement sur la glace. Cela va arrêter la sécrétion de cytokines. A partir de là il est essentiel de garder les cellules sur la glace.Travailler avec le tampon froid va éviter la contamination croisée du réactif de capture. </li><li> Remplir le tube avec tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. Aspirer le surnageant complètement. Répéter l&#39;étape de lavage une fois de plus. </li><li> Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 ul de tampon froid et le tube est mis sur la glace. </li><li> Afin d&#39;éviter une liaison non spécifique de l&#39;anticorps, nous recommandons l&#39;ajout de réactif FcR 10 ul de blocage et incuber sur glace pendant 5 min. Puis nous ajoutons 20 ul de souris IL-17 anticorps de détection (biotine) qui est conjugué à la biotine et incuber pendant 10 minutes sur la glace. </li><li> Encore une fois, se laver les cellules que nous avons fait avant en ajoutant 10 ml de tampon froid et centrifuger à 300xg à 2-8 ° C pendant 10 min. </li><li> Maintenant aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 80 ul de tampon froid. </li><li> Ajouter 20 uL de nos anticorps secondaire, anti-biotine-PE. </li><li> Mélanger les cellules et une solution d&#39;anticorps secondaire, et à nouveau incuber le tube pendant 10 minutes sur la glace. </li><li> Une fois cette seconde incubation est terminée, laver les cellules avec 10 ml de tampon froid et centrifuger. </li><li> Le culot peut désormais être remis en suspension dans 500 ul de tampon froid. </li><li> Si les cellules doivent être séparées pour l&#39;analyse plus loin en aval, elles peuvent être marquées magnétiquement avec l&#39;Anti-PE-microbilles et séparés manuellement ou automatisées à l&#39;aide de colonnes MACS et séparateurs MACS. </li><li> Nous avons maintenant terminé l&#39;étiquetage des splénocytes et sont prêtes pour l&#39;analyse. </li></ol> Analyse par FACS <ol><li> Pour notre analyse, nous allons comparer les splénocytes stimulés et non stimulés par cytométrie en flux. </li><li> Avant l&#39;analyse par cytométrie en flux, les cellules sont colorées avec de l&#39;iodure de propidium à 0,5 pg / mL à la porte des cellules mortes. L&#39;analyseur de MACSQuant ™ a été chargé avec 200 000 cellules pour chaque échantillon et nous sommes maintenant allons regarder les diagrammes de dispersion de la réactivité des anticorps par rapport dans les échantillons. Deux considérations importantes pour l&#39;analyse de cellules rares - comme l&#39;IL-17 cellules positives - par cytométrie en flux sont: <ul><li> la fixation d&#39;un porte sur les lymphocytes dans la diffusion vers l&#39;avant par rapport nuage de côté </li><li> et gating sur les cellules mortes (colorées à l&#39;iodure de propidium) et des cellules B (qui peut causer des taches de fond non spécifique) pour améliorer encore la sensibilité de détection </li></ul></li><li> Nous avons utilisé CD4-APC anticorps pour détecter les cellules T et l&#39;anticorps pour détecter CD45R/B220-PerCP les cellules B. Nous voyons les propriétés de diffusion vers l&#39;avant et latérales des échantillons et d&#39;appliquer une grille sur la population de lymphocytes. </li><li> Une deuxième porte a été appliquée pour voir les cellules colorées et les cellules mortes B teinté (axe Y). Ces cellules sont exclus de l&#39;analyse des cellules T. </li><li> Dans cet exemple, qui est essentiellement de notre contrôle négatif, nous pouvons voir qu&#39;il ya très peu d&#39;IL-17 CD4 sécrétant positifs dans les échantillons de cellules T non stimulées - environ 0,003% (figure 4). En regardant la population des cellules T stimulées, on peut voir un nombre important de cellules CD4 positives des cellules T qui sécrètent l&#39;IL-17 - environ 0,367% (figure 5A) avant la séparation et 60,76% après la séparation magnétique avec la technologie MACS (figure 5B). </li></ol>

Tous les protocoles et fiches techniques sont disponibles à www.miltenyibiotec.com. Avertissements Les réactifs contiennent de l&#39;azide de sodium. Dans des conditions acides azide de sodium, produit l&#39;acide, ce qui est extrêmement toxique. Azides doivent être dilués avec de l&#39;eau courante avant de les jeter. Ces précautions sont recommandées pour éviter les dépôts dans les canalisations des conditions explosives peuvent se développer.

Cellules TH17 jouent un rôle essentiel dans l&#39;immunité adaptative et la réponse inflammatoire et sont un élément clé dans la conduite inflammation auto-immune. Ce document vidéo comment utiliser la souris Miltenyi de l&#39;IL-17 Assay sécrétion - enrichissement cellulaire et le kit de détection (PE). Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d&#39;avoir une estimation de la fréquence de l&#39;IL-17-cellules sécrétant dans votre préparation de cellules de départ. La concentration cellulaire appropriée pendant la période de l&#39;étiquetage et la sécrétion de cytokine empêche la contamination croisée par d&#39;autres cellules de votre suspension et assure des résultats fiables.

<table><tbody><tr><td>Kits de dosage et d'enrichissement des cellules sécrétant l'IL-17 de souris (PE)</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Milieu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solution d'iodure de propidium</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Réactif de blocage des récepteurs Fc, souris</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kits de suppression des cellules mortes</td><td>Réactif</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif pour tubes MACSmix</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissociateur gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kits de démarrage autoMACS Pro</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Colonnes MACS</td><td>Outil</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Séparateur MACS</td><td>Outil</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détection et isolement des cellules de souris viables t il-17-sécrétrices

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

La cytokine MACS sécrétion de technologie de dosage permet la détection des cytokines sécrétées au niveau de la cellule unique et isolée sensible de viabilité des cellules sécrétant des cytokines. Afin de marquer l&#39;IL-17 cellules sécrétrices, une suspension cellulaire unique de splénocytes de souris est préparé et stimulé à 37 ° C avec PMA / ionomycine pour induire la sécrétion de cytokines. Pour arrêter la sécrétion des cellules sont ensuite placés sur la glace et sont exposées à l&#39;IL-17 Réactif Catch un anticorps bi-spécifique qui se lie à CD45 sur la surface des cellules de leucocytes et de l&#39;IL-17 comme il est sécrétée et pris près de la surface cellulaire. La sécrétion est alors relancée par l&#39;augmentation de la température à 37 ° C et de l&#39;IL-17 est piégé par le réactif de capture. La sécrétion est ensuite arrêté de nouveau, en plaçant les cellules sur la glace. Pour détecter l&#39;IL-17 pris au piège, les cellules sont incubées avec un IL-17-second anticorps spécifiques conjugué à la biotine et un anticorps anti-biotine-PE. Les cellules peuvent désormais être directement analysées par cytométrie en flux ou préparés pour l&#39;isolement et l&#39;enrichissement par étiquetage ultérieur avec anti-PE microbilles conjuguées.

Cette procédure décrit la détection et l&#39;isolement des leucocytes TH17 souris qui sécrètent activement l&#39;IL-17 après stimulation.

Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices

La technologie de l'essai de sécrétion de cytokines MACS permet la détection des cytokines sécrétées à l'échelle de la cellule unique et l'isolement sensible de cellules viables...

La technologie de dosage de la sécrétion maximale de cytokines permet la détection des cytokines sécrétées au niveau de la cellule unique et l'isolement sensible de cellules viables sécrétant des cytokines afin de marquer les cellules sécrétant l'IL-17. Une suspension monocellulaire de leucocytes de souris est préparée et stimulée à 37 degrés Celsius avec du PMA et de l'ionomycine pour induire la sécrétion de cytokines, puis la sécrétion est interrompue. Les cellules sont ensuite placées sur de la glace, où elles sont exposées au réactif de capture de l'IL-17.Une fois la sécrétion réinitialisée en augmentant la température à 37 degrés Celsius, l'IL-17 est piégée par le réactif de capture. Un anticorps bispécifique qui se lie au CD45 à la surface des leucocytes et à l'IL-17 au fur et à mesure de sa sécrétion et de son piégeage près de la surface cellulaire est ensuite utilisé ; la sécrétion est de nouveau interrompue en plaçant les cellules sur de la glace. Pour détecter les cellules ayant piégé l'IL-17, celles-ci sont incubées avec un second anticorps spécifique de l'IL-17, conjugué à la biotine, puis avec un anticorps anti-biotine marqué au PE. Les cellules peuvent désormais être analysées directement par cytométrie en flux ou préparées pour une isolation et un enrichissement ultérieurs par marquage supplémentaire avec des microbilles conjuguées à l'anti-PE. Bonjour, je m'appelle Ellie Rankin, l'une des scientifiques de Mill Tenney Biotech.Aujourd'hui, je vais vous montrer une procédure permettant d'isoler et de détecter les leucocytes TH17, qui, lorsqu'ils sont stimulés, sécrètent l'IL17. L'IL17 joue un rôle important dans l'immunité adaptative et la réponse inflammatoire, et contribue également à l'inflammation auto-immune. Laissez-moi vous montrer comment réaliser ce test. Pour le protocole d'aujourd'hui, nous devons d'abord préparer un tampon contenant du PBS avec du BSA et 2 millimolaires d'EDTA, car les bulles d'air peuvent obstruer les colonnes de séparation MagniSort ; le tampon doit donc être dégazé et conservé entre 2 et 8 degrés Celsius avant utilisation.Deuxièmement, nous utilisons un milieu RPMI 1640 contenant 5 % de sérum de souris. Le milieu de culture ne doit pas contenir de BSA ni de SFC, car ces composés modifient la spécificité de la stimulation cellulaire. Enfin, vous aurez besoin du kit de purification et de détection des cellules sécrétant l'IL-17 chez la souris de MIL 10 E Biotech.Le kit contient les composants suivants : le réactif de capture de l'IL-17, l'anticorps de détection de l'IL-17, la biotine, l'anti-biotine PE et les microbilles anti-PE. Logiquement, vous réaliserez ce protocole avec un contrôle négatif et un contrôle positif, tels que des cellules non stimulées, des cellules PLE et une coloration de contre-marquage pour les lymphocytes T. Pour notre démonstration, nous nous concentrerons uniquement sur les cellules stimulées.Ce protocole sera réalisé en utilisant une technique stérile. Notre protocole commence par une suspension monocellulaire de cytes SP de souris isolés à l’aide de l’associateur gentle max. La concentration des cellules doit être déterminée au préalable par comptage cellulaire.Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, nous aspirons le surnageant du culot à l’aide d’une pipette. Ne pas verser le tube afin d’éviter la perte du culot. Les cellules doivent maintenant être resuspendues dans notre milieu de culture, puis on ajoute suffisamment de milieu pour obtenir une concentration de 10 millions de cellules par millilitre et de 5 millions de cellules par centimètre carré.Pour stimuler une réponse immunitaire dans nos cellules remises en suspension, nous ajoutons de l'ionomycine et de la PMA à l'échantillon et homogénéisons la solution en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ensuite, les puits sont étiquetés en conséquence. Nous allons maintenant incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius sans mélange pour commencer la période de stimulation.Passez à l'analyse de l'IL-17 trois heures après le début de la stimulation. Planifiez-vous en conséquence. Ici, nous observons des cellules spléniques de souris stimulées.Veuillez noter la morphologie distincte et le regroupement cellulaire des cellules stimulées. Par souci de clarté, nous suivrons uniquement les cellules stimulées. À partir de ce point et pour arrêter la sécrétion, nous recueillons les cellules stimulées en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.Les cellules sont ensuite transférées à l'aide d'un tampon froid depuis la cavité vers un tube et sont lavées une deuxième fois. Pour s'assurer que toutes les cellules sont récupérées, il est conseillé d'examiner votre boîte au microscope. Si des cellules restent encore attachées, vous pouvez récupérer les cellules résiduelles en rinçant la boîte.Avec un tampon froid, les agrégats cellulaires présents dans votre suspension cellulaire peuvent être éliminés à l’aide de filtres de pré-participation. Un écueil potentiel de cette procédure est la contamination croisée par le réactif de capture, qui peut survenir lors de l’étiquetage. Lorsque l’anticorps bispécifique se lie à un lymphocyte T non sécrétant et piège l’IL-17 sécrétée par un lymphocyte voisin, cela génère des faux positifs. Pour éviter ce problème, il est essentiel de refroidir les cellules avant l’étiquetage et de manipuler les échantillons avec un tampon froid afin de limiter la sécrétion et ralentir la diffusion de l’IL-17, et ainsi prévenir cette contamination croisée.Il est primordial de noter qu'une contamination croisée peut également survenir si plus de 2 % des cellules sécrétant l'IL-17 sont présentes. Si l'on s'attend à ce que la concentration de cellules sécrétant l'IL-17 soit supérieure à 2 %, ajustez les volumes en conséquence. Par conséquent, en plus de maintenir les cellules au froid, elles doivent être conservées à une concentration définie.Pour commencer la procédure de marquage, nous utilisons 10 millions de cellules dans un tube fermable de 15 millilitres. Si un nombre plus élevé de cellules doit être utilisé, il suffit d'augmenter proportionnellement tous les volumes. Une fois la concentration optimale de cellules obtenue, laver les cellules en ajoutant 10 millilitres de tampon froid.Faites maintenant centrifuger les cellules à 300 G pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée. Après la centrifugation, aspirez complètement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ne pas verser le surnageant, car cela entraînerait une perte cellulaire et des volumes imprécis. Répétez l’étape de lavage, qui consiste à ajouter 10 millilitres de tampon froid, suivie de la centrifugation et de l’aspiration.À présent que nous avons un culot de la pureté souhaitée, resuspendez les cellules dans un volume quelconque de milieu de culture froid afin de les marquer. Nous allons maintenant ajouter 20 microlitres de réactif de capture de l'IL-17 de souris. Incubez les cellules pendant cinq minutes sur de la glace.Après une période d'incubation de cinq minutes sur de la glace, retirez le tube et diluez les cellules dans 10 millilitres de milieu préchauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, fixez le tube sur le rotateur de tubes Max Mix et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.En maintenant un mouvement continu, augmentez la température à 37 degrés Celsius pour relancer la sécrétion de cytokines après la période de sécrétion de 45 minutes à 37 degrés Celsius. Placez immédiatement le tube sur de la glace. Cela interrompra la sécrétion de cytokines.À partir de ce moment, il est essentiel de maintenir les cellules sur de la glace. L'utilisation d'un tampon froid permettra d'éviter la contamination croisée du réactif de capture. Remplir le tube avec du tampon froid et centrifuger à 300 Gs à une température comprise entre 2 et 8 degrés Celsius pendant 10 minutes.Aspirez complètement le surnageant. Répétez l'étape de lavage une fois supplémentaire. Le culot cellulaire est resuspendu dans 80 microlitres de tampon froid et le tube est placé sur de la glace.Pour éviter la liaison non spécifique de l'anticorps, nous recommandons d'ajouter 10 microlitres de réactif de blocage FCR et d'incuber sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, nous ajoutons 20 microlitres d'anticorps de détection de l'IL-17 de souris conjugué à la biotine et incubons pendant 10 minutes sur de la glace. Encore une fois, laver les cellules comme nous l'avons fait précédemment en ajoutant 10 millilitres de tampon froid et en centrifugeant à 300 G à une température de deux à huit degrés Celsius pendant 10 minutes.Aspirez maintenant le surnageant et resuspendez le culot cellulaire dans 80 µL de tampon froid, puis ajoutez 20 µL de notre anticorps secondaire. Anti-biotine PE. Mélangez les cellules et la solution d’anticorps secondaire, puis incubez à nouveau le tube pendant 10 minutes sur de la glace.Une fois la seconde incubation terminée, laver les cellules avec 10 millilitres de tampon froid et centrifuger. Le culot peut désormais être resuspendu dans 500 microlitres de tampon froid. Si les cellules doivent être séparées pour une analyse en aval ultérieure, elles peuvent être marquées magnétiquement avec des microbilles anti-PE et séparées manuellement ou de manière automatisée à l’aide de colonnes Max et de séparateurs Max.Nous avons maintenant terminé le marquage de nos splucytes et sommes prêts pour l'analyse. Nous comparerons les splucytes stimulés et non stimulés par cytométrie en flux avant l'exécution. Les cellules Fact sont marquées avec de l'iodure de propidium à 0,5 microgramme par millilitre afin d'exclure les cellules mortes.Le cytomètre en flux a été chargé avec 200 000 cellules pour chaque échantillon et nous allons maintenant examiner les diagrammes de dispersion de la réactivité relative des anticorps dans les échantillons. Deux points importants à prendre en compte lors de l'analyse de cellules rares, telles que les cellules positives pour l'IL-17, par cytométrie en flux consistent à définir une fenêtre sur les lymphocytes dans le diagramme de dispersion avant par rapport au diagramme de dispersion latéral, et à exclure les cellules mortes marquées par l'iodure de propidium ainsi que les cellules B, qui pourraient provoquer une coloration de fond non spécifique. Afin d'améliorer davantage la sensibilité de détection.Ici, nous utilisons un anticorps anti-CD4 APC pour détecter les cellules T dans l'anticorps anti-CD45RB220. Pour détecter les cellules B, nous analysons les propriétés de diffusion avant et latérale des échantillons et appliquons un tri sur la population de lymphocytes. Un deuxième tri a été appliqué pour visualiser les cellules mortes marquées et les cellules B marquées sur l'axe des ordonnées.Ces cellules sont exclues de l'analyse des lymphocytes T. Dans cet exemple, qui constitue essentiellement notre contrôle négatif, on observe qu'il y a très peu de lymphocytes T CD4 positifs sécrétant l'IL-17 dans les échantillons non stimulés, environ 0,003 %. En examinant la population de lymphocytes T stimulés, on constate un nombre important de lymphocytes T CD4 positifs sécrétant l'IL-17, environ 0,367 % avant la séparation et 60,76 % après la séparation magnétique avec la technologie MACS. Nous venons de vous montrer par le biais d'une documentation vidéo comment utiliser le test de sécrétion d'IL-17 pour souris de Miltenyi Biotec, destiné à l'enrichissement et à la détection cellulaire, en utilisant le PE.La partie la plus importante de cette procédure consiste à avoir une idée de la fréquence des cellules sécrétant l'IL-17 présentes dans la population initiale. La concentration cellulaire correcte permettra de réduire la contamination croisée pendant l'étiquetage et la période de sécrétion des cytokines, garantissant ainsi des résultats fiables. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Cette vidéo illustre une méthode permettant d’isoler des lymphocytes T tueurs naturels invariants, également connus sous le nom de cellules iNKT. La procédure commence par l’injection d’un glycolipide synthétique dans une souris pour stimuler l’activation et la prolifération des cellules iNKT dans la rate. Par la suite, des suspensions unicellulaires sont préparées à partir de la rate et incubées avec des complexes de reconnaissance des cellules iNKT marqués avec des fluorophores, suivis d’une...

Isolement de lymphocytes T tueurs naturels invariants à partir d’un modèle murin

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

L’analyse in vitro de la recombinaison de commutation de classe chez la souris est difficile en raison des molécules d’IgE cytophiles liées aux récepteurs Fc à la surface des lymphocytes B.  Nous décrivons une méthode de détection des IgE utilisant le clivage médié par la trypsine des IgE liées à la surface avant la fixation et la perméabilisation pour la coloration par fluorescence cytoplasmique.

Détection de True IgE exprimant Souris B cellules de la lignée

Les lymphocytes T CD4+ naïfs se polarisent en divers sous-ensembles en fonction de l’environnement au moment de l’activation.  La différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en divers sous-ensembles effecteurs peut être réalisée in vitro par l’ajout de stimuli des récepteurs des lymphocytes T et de signaux spécifiques de cytokines.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser le phénotype des cellules T régulatrices (Treg) isolées de souris naïves et chroniques infectées par le virus de la chorioméningite lymphoïde. De plus, nous proposons un processus pour évaluer l’activité suppressive des cellules Treg.

Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T activées Regulatory Isolés de chorioméningite lymphocytaire Souris infectées par le virus chroniques

Nous décrivons ici un modèle de souris rapporteure transgénique pour visualiser les cellules productrices d’IL-22 à l’intérieur de différents tissus de souris. Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’emplacement d’autres cytokines ou protéines de secrétaire chez la souris.

Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris

Les cellules lymphoïdes innées du groupe 2 (ILC2), impliquées dans l’inflammation de type 2, participent principalement à la réponse à l’infection par les helminthes, aux maladies allergiques, à l’homéostasie métabolique et à la réparation des tissus. Dans cette étude, une procédure pour isoler les ILC2 de la muqueuse nasale murine et détecter l’expression de CD226 est démontrée.

Isolement de cellules lymphoïdes innées du groupe 2 de la muqueuse nasale de souris pour détecter l’expression de CD226

Ce protocole décrit la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Th17 pathogènes in vitro. Plus précisément, lorsqu’il est combiné à une approche basée sur la cytométrie en flux multiparamétrique, une pureté de 90 % de cellules Th17 pathogènes peut être obtenue à partir de cellules T CD4+ naïves en utilisant cette méthode de différenciation.

Différenciation in vitro de lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes Th17 pathogènes chez la souris

L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.

Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu

Nous fournissons un protocole détaillé pour isoler et identifier des populations rares de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les poumons de souris grâce à l’enrichissement des lymphocytes T à base de billes magnétiques et aux tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH).

Identification de lymphocytes T rares spécifiques de l’antigène dans des poumons de souris avec un peptide : tétramères du complexe majeur d’histocompatibilité

Découvrez la détection et l'isolement de cellules T IL-17-sécrétrices de souris viables en immunologie. Cette méthode utilise l'assay de sécrétion de cytokines pour identifier les lymphocytes TH17 actifs.

Détection et isolement des cellules de souris viables T IL-17-sécrétrices

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