Biodistribution des nanomédicaments : Application de la microscopie à balayage électronique

1. Injection de nanoparticules et récolte d'organes

1. Injecter des nanoparticules dans une souris anesthésiée par voie intraveineuse pour permettre un ciblage passif.
2. Aux moments souhaités, c'est-à-dire 1, 4 et 8 semaines, après l'injection, euthanasier les souris avec humanité selon les lignes directrices de l'American Veterinary Medical Association (AVMA).
3. Ouvrez la cavité du corps et retirez chirurgicalement les organes d'intérêt. Placer les organes dans une formaline tamponnée de phosphate de 10 % dans un contenant de polypropylène jusqu'à la préparation de l'échantillon.

2. Préparation d'échantillons de tissus

1. Utilisez des forceps pour transférer le tissu de la souris du fixatif en saline tamponnée par phosphate (PBS). Rock l'échantillon pendant 30 min, en remplaçant le PBS toutes les 10 min.
2. Retirer le tissu et sécher à l'un des kimwipe. Placez-le ensuite dans un moule en plastique contenant un composé optimal de température de coupe (OCT). Conserver à -80 oC toute la nuit.
3. Le lendemain, transférer l'échantillon au cryostat et fixer la température à -23 oC.
4. Étiquetez les diapositives avec le type d'organe et la taille des nanoparticules, et placez-les sur une étagère dans le cryostat.
5. Couvrir le mandrin cryostat avec OCT et placer l'échantillon sur le dessus. Baisser le piston extracteur sur l'échantillon et lui permettre d'équilibrer pendant 3-5 min.
6. Montez le mandrin sur le porte-échantillon et orientez-le de sorte que la lame puisse couper directement à travers l'échantillon congelé. Amener l'échantillon près de la lame pour un revêtement rugueux. Fixer l'épaisseur à 30 m et trancher plusieurs sections jusqu'à ce qu'une tranche coupée uniformément soit produite.
7. Passer à la face fine en diminuant l'épaisseur de la section à 7-8 m. Recueillir une section tranchée en appuyant sur une lame de verre étiquetée sur la tranche. Placez deux diapositives sur chaque toboggan et conservez-les dans un toboggan. Laisser sécher à température ambiante.
8. Une fois secs, déshydrater les échantillons en trempant le glacière dans 50 % d'éthanol pendant 3 min pour enlever l'OCT. Transférer ensuite le support à 80% d'éthanol pendant 3 min avant de placer le rack dans un rapport de 1:1 de méthanol froid en acétone pendant 10 min à -20 oC.
9. Retirez le toboggan et égouttez l'excédent de solvant sur un essuie-tout. Après 20 à 30 min, placez les glissières dans une boîte à glissières et conservez-les dans un congélateur à -20 oC jusqu'à l'imagerie.

3. Imagerie haute résolution à l'aide de SEM et EDS

1. Préparer l'échantillon tel que décrit dans « SEM Imaging of Biological Samples ». Ensuite, chargez l'échantillon dans le SEM.
2. Allumez le SEM et ajustez la distance de travail à environ 5 mm et la tension et le courant de faisceau accélérant à 25 keV, ce qui serait normalement trop élevé pour un échantillon biologique. Cependant, l'échantillon est enduit pour la conductivité et la protection.
3. Commencez l'imagerie et zoomez sur un grossissement d'environ 1 000 à 2 000 X pour voir les structures qui contiendraient les nanoparticules. Notez que sans détection de rétrodiffusion (BSD), on ne peut pas les distinguer en dessous d'une certaine profondeur.
4. Insérez le BSD sous les mêmes paramètres et déplacez la scène dans la direction z à la même distance de travail qu'auparavant.
5. Commencez l'imagerie à environ le même grossissement et vérifiez que vous êtes en mesure de voir un contraste élevé en présence de nanoparticules. Enregistrer les images.
6. Utilisez différentes configurations BSD (où les charges sur le détecteur s'alignent) pour choisir celle qui montre le contraste le plus élevé pour les nanoparticules.
7. Zoom-in sur une zone de contraste élevé montrant une nanoparticule ou un amas de nanoparticules.
8. Ouvrez la caméra 2^nd de la chambre et regardez pendant que vous insérez l'EDS dans le système en appuyant sur le bouton vers le bas sur la pièce jointe SEM. Une fois que l'EDS est proche, mais ne touche pas le BSD ou le pistolet, relâchez le bouton.
9. Ouvrez le programme aztèque sur l'ordinateur EDS (toujours au poste de travail) et acquérez une image de la SEM. Utilisez la méthode « point and shoot » pour cliquer sur une zone très dense en contraste et en nanoparticules.
10. L'EDS montrera le spectre des rayons X caractéristiques à partir de ce point. Recherchez les pics de baryum et de titane à identifier sur le graphique. Cela confirme que ce que vous regardez sont en effet les nanoparticules et pas n'importe quel type de contamination.
11. Retournez à l'échantillon et utilisez le logiciel Atlas pour cartographier les bordures de l'organe sur la diapositive. Sélectionnez le protocole "Organ" pour créer une image mosaïque de la zone, et laissez-le fonctionner (cela peut prendre quelques heures tout au plus).
12. Une fois que l'image composite est créée et cousue par le logiciel, exportez-la comme un fichier Tif.
13. Ouvrez le fichier Tif dans ImageJ, un logiciel open source, et ajustez les valeurs de seuil de contraste pour mettre en évidence les zones de contraste très élevé (c.-à-d. les nanoparticules). Utilisez des fonctions intégrées pour quantifier le volume de nanoparticules à l'aide de la taille de pixels définie dans le protocole Organ (devrait être d'environ 100 nm).
14. Bien que cette procédure se réfère uniquement à l'échantillon d'une semaine du poumon de souris, cette procédure est répétée avec les échantillons d'autres semaines et d'autres organes pour compiler un graphique montrant la distribution.
15. Après avoir calculé la biodistribution de chaque organe pour chaque semaine, les graphiques de biodistribution montreront les changements dans la biodistribution et la concentration des nanoparticules au cours des 8 semaines. Ceux-ci montrent la concentration maximale et fournissent également des informations sur le temps qu'il faut pour que les nanoparticules se dégagent de l'organe.