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La microscopie est une méthode largement utilisée pour imager la structure détaillée des échantillons. Les microscopes optiques, qui focalisent la lumière à travers une série de lentilles pour grossir les échantillons, sont utilisés depuis des siècles, le premier microscope composé étant apparu au 17ème siècle. Au cours de cette période, Antonie van Leeuwenhoek a été le premier à observer les bactéries, les levures, les globules rouges et la circulation dans les vaisseaux capillaires, apportant d’importantes contributions scientifiques et ouvrant la voie à des avancées microscopiques.
Les microscopes optiques sont encore largement utilisés aujourd’hui dans la recherche et les milieux cliniques pour le diagnostic médical. Cependant, au cours des 60 dernières années, la microscopie confocale a émergé et éclaire l’échantillon à travers un sténopé pour augmenter la résolution optique et le contraste.
Cette vidéo illustrera les principes de fonctionnement de la microscopie optique et confocale, démontrera comment les images à haute résolution sont analysées et discutera de plusieurs applications de la microscopie dans le domaine de l’ingénierie biomédicale.
Commençons par discuter des principes fondamentaux de la microscopie confocale. La microscopie optique est basée sur le principe de focaliser la lumière sur un échantillon pour imager sa structure détaillée. Un microscope est formé de deux composants de grossissement ; la lentille de l’objectif, qui focalise une image réelle d’un objet, et l’oculaire, qui focalise une image virtuelle agrandie avant qu’elle ne soit reçue par l’œil. Le grossissement total est obtenu en multipliant les grossissements de ces deux lentilles.
La focalisation de la lumière donne un plan de mise au point spécifié où le grossissement et la lumière de la lampe se rencontrent tous au même point, ce qui donne la meilleure résolution de l’image. Lorsqu’il est en dehors du plan focal, la zone d’éclairage est plus grande et les faisceaux lumineux interfèrent avec d’autres parties de l’échantillon, ce qui rend l’image floue. Alors que les microscopes optiques éclairent et imagent l’ensemble de l’échantillon visible, un microscope confocal utilise un trou d’épingle entre l’étage de l’échantillon et le détecteur, de sorte que seul un petit faisceau lumineux est focalisé à une profondeur étroite à la fois.
Par conséquent, la seule zone visible de l’échantillon est le point de mise au point, fournissant une image bien résolue. Cependant, avec une résolution plus élevée, seule une petite partie de cet échantillon est imagée à la fois. En déplaçant l’échantillon dans le plan X-Y, un balayage matriciel de sa surface peut être effectué. Pour chaque point du balayage, la mise au point est optimisée en ajustant la hauteur Z pour accéder à différents plans focaux. Cela garantit une résolution maximale point par point de l’échantillon d’image.
Utilisons maintenant ces principes de microscopie et de résolution d’image pour imager le cerveau d’une souris à l’aide d’un microscope confocal et d’un microscope optique.
Après avoir rappelé les grands principes de la microscopie, effectuons maintenant une mesure à l’aide d’un microscope confocal. Tout d’abord, allumez le microscope sur le poste de travail de l’ordinateur. Ensuite, chargez l’échantillon sur la platine et centrez-le sous l’objectif. Ouvrez maintenant le logiciel d’imagerie et sélectionnez créer une nouvelle tâche. Allez dans la colonne de topographie et choisissez le bouton de l’assistant. Sélectionnez le grossissement le plus bas, qui pour ce microscope, est de 2,5x. Utilisez ensuite le manipulateur de microscope 3D pour ajuster la position Z de l’échantillon et faire la mise au point sur l’échantillon. Appuyez sur le bouton sur le côté pour qu’une lumière bleue apparaisse sur les bords. Cela permet un mouvement et une mise au point Z plus fins. Capturez maintenant une image d’ensemble.
Augmentez lentement le grossissement de l’objectif et ajustez l’intensité de la lumière et la mise au point pour obtenir le grossissement souhaité. Utilisez le manipulateur 3D dans les directions X et Y pour sélectionner différentes zones d’intérêt sur l’échantillon. Une fois qu’une image est prise à faible grossissement, appuyez sur Suivant pour prendre un point de référence. Utilisez le point de référence par défaut ou spécifiez-en un nouveau dans le coin de l’échantillon, puis appuyez sur Suivant. Changez maintenant progressivement l’objectif à la résolution souhaitée pour l’échantillon. Pour cet échantillon, un objectif 20x est utilisé pour visualiser les cellules dans le tissu cérébral de la souris. Assurez-vous qu’il y a de la place pour réduire la distance de travail.
Pour définir la distance à laquelle collecter les tranches, rendez-vous d’abord sur la page de définition de la plage de mesure et utilisez le manipulateur 3D pour enfin ajuster l’échantillon dans la direction Z. Cliquez sur Définir en dernier lorsque le haut de l’échantillon est actif et cliquez sur Définir en premier lorsque le bas de l’échantillon est net. Assurez-vous que le nombre de tranches calculées ne dépasse pas 1 000, sinon le programme échouera. Vérifiez qu’il n’y a pas de pixels rouges, ce qui indique que l’intensité de la lumière est sursaturée.
Enfin, appuyez sur fait pour prendre l’image de la tomographie. Lorsque le logiciel de tomographie s’ouvre, sélectionnez l’onglet études pour visualiser les données en 3D et prendre des mesures 2D et 3D.
Prenons maintenant une image à l’aide d’un microscope optique numérique. Tout d’abord, allumez le microscope et ouvrez le logiciel d’imagerie. Ensuite, chargez l’échantillon sur la platine et centrez-le sous l’objectif. Lorsque le logiciel d’imagerie est ouvert, sélectionnez une tâche dans la liste des modèles ou choisissez l’examen libre. Ensuite, obtenez une image d’ensemble qui montre l’ensemble de l’étape. Utilisez le contrôleur pour modifier la mise au point et la position de l’image.
Une fois l’acquisition terminée, placez un système de coordonnées sur l’image. Le système de coordonnées par défaut se trouve au milieu de la scène. Pour plus de flexibilité, les coordonnées peuvent être modifiées manuellement.
Ensuite, nommez l’échantillon et sélectionnez le bouton de l’appareil photo. Appuyez sur le bouton Live pendant que vous naviguez dans l’échantillon et déplacez la mise au point vers le bas jusqu’à ce que l’échantillon soit clairement net. Si nécessaire, utilisez la languette d’éclairage et d’ouverture pour régler l’éclairage. Acquérez ensuite une image de l’échantillon.
Utilisez les outils du panneau d’optimisation de l’image, tels que l’inclinaison de l’objectif, les niveaux d’éclairage de l’échantillon, ainsi que la luminosité et le contraste de l’image pour optimiser l’image jusqu’à la netteté souhaitée. Appuyez maintenant sur l’outil crayon pour effectuer des mesures. Utilisez les outils de distance et de surface pour mesurer la taille des cellules de l’échantillon.
Enfin, rendez-vous dans l’onglet flux de travail des résultats et configurez la mise en page du rapport. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer le travail afin une analyse plus approfondie.
Analysons maintenant les images du cerveau d’une souris qui ont été prises avec des microscopes optiques confocaux et numériques. L’image confocale à un grossissement de 50x est haute résolution et fournit une mise au point profonde avec différents niveaux de profondeur d’information.
Sur la carte tomographique, la hauteur de cet échantillon varie de un à neuf microns. Des caractéristiques telles que l’amplitude, le profil de rugosité et les paramètres de courbe peuvent être analysées plus en détail. Cependant, l’ensemble de la lame du tissu cérébral sectionné peut être imagé à l’aide d’un microscope optique numérique.
En zoomant sur une section, on voit plus de détails de l’échantillon, mais à une résolution beaucoup plus faible que celle obtenue avec un microscope confocal. Cet échantillon a été obtenu à un grossissement de 300x. Un logiciel dédié offre des outils pour mesurer les dimensions de la section, telles que le diamètre, ainsi que pour calculer la surface interne de la section.
La microscopie numérique, optique et confocale sont des outils standard utilisés dans diverses applications biomédicales. L’ophtalmoscopie laser à balayage ou SLO est une technique d’imagerie non invasive largement utilisée en ophtalmologie clinique pour diagnostiquer et surveiller le développement des maladies de la rétine.
SLO produit des images stéréoscopiques à contraste élevé qui visualisent la microglie. Les macrophages résidents de la rétine, qui sont impliqués dans plusieurs maladies rétiniennes. La microscopie confocale est également utilisée dans l’imagerie des cellules vivantes, ce qui permet aux chercheurs de visualiser la fonction des cellules biologiques microscopiques en temps réel.
Cette technique est utilisée pour étudier la migration et la prolifération cellulaires et la dynamique des protéines, entre autres. Ici, les récepteurs transmembranaires et les lysosomes ont été marqués avec des colorants fluorescents et leur colocalisation a été analysée à l’aide de l’imagerie timelapse pour étudier l’internalisation des récepteurs.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la microscopie numérique, optique et confocale. Vous devez maintenant comprendre les principes de la microscopie et de la résolution d’image, comment utiliser des microscopes optiques et confocaux pour imager des échantillons biologiques, et plusieurs applications de leur utilisation dans le domaine de l’ingénierie biomédicale.
Merci d’avoir regardé.
