Transfert adoptif de cellules : introduction de splénocytes d'une souris donneuse vers une souris hôte et évaluation du taux de succès au FACS

1. Préparation

1. Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
2. Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis sécher à fond.
3. Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

1. À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez la souris par hypoxie. Fixez la souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine et effectuez une laparotomie longitudinale à l'aide de ciseaux et de forceps.
2. L'utilisation de forceps déplacer les intestins et l'estomac sur le côté droit de l'abdomen pour exposer l'estomac et la rate. La rate est attachée à l'estomac.
3. À l'aide de forceps, détachez soigneusement la rate de l'estomac et placez-la sur le plat Petri contenant 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

1. Déposer la rate sur une passoire cellulaire de 40 m au-dessus du plat Petri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier.
2. Récupérer les cellules adhérentes en rinçant le piston et la passoire avec 1 ml de HBSS 2% FCS.
3. Transférer la rate dissociée et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
4. Laver le plat Petri avec 5 millilitres de HBSS 2% FCS et transférer le liquide dans le tube de 15 ml.
5. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
6. Resuspendre la pastille dans 2 ml de pipide de chlorure d'ammonium de potassium de haut en bas pour resuspendre la pastille et lyser les érythrocytes.
7. Attendez 2 min et ajoutez HBSS 2% FCS à la pastille remise en suspension pour obtenir le volume jusqu'à 14 ml.
8. Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS par pipetting de haut en bas.
9. Comptez les cellules à l'aide de l'essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Transfert d'adoption

1. Transférer 2 ml de suspension cellulaire obtenue dans un tube de collecte de 5 ml.
2. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter le supernatant.
3. Resuspendre la pastille dans 2 ml de PBS et centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC.
4. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 200 L de PBS.
5. À l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 29 G injecte 200 l de suspension cellulaire dans la souris expérimentale par voie intraveineuse dans le sinus sanguin rétro-orbital.
6. En tant que contrôle, injectez une deuxième souris dans le même sinus sanguin avec 200 l de phosphate tamponné salin.

5. Récolte et coloration des cellules

1. Quatre jours après le transfert d'adoption, euthanasiez les souris et enlevez la rate.
2. Récoltez les splenocytes tels que décrits à la section 3.
3. Transférer 100 l de suspensions cellulaires de chaque souris dans deux tubes FACS, étiquetés « contrôle » et « transféré ».
4. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter les supernatants.
5. Préparer un mélange contenant les quatre anticorps aux dilutions énumérées dans le tableau 1.

Anticorps	Fluorochrome	dilution
CD45.1	BV711 (en anglais seulement)	1/200
CD45.2	APCCy7 (en anglais)	1/400
CD4 (en)	BV786 (en anglais seulement)	1/1600
CD3 (en)	BV421 BV421 (bv421)	1/200

Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Préparation de quatre cocktails d'anticorps utilisant des conjugates concentrés anticorps-fluorescents et HBSS.

6. Ajouter 100 l de mélange à chaque tube, puis couver pendant 20 min sur glace dans l'obscurité.
7. Ajouter 1 ml de HBSS 2%FCS, puis centrifuger les tubes à 370 x g pendant 3 min à 10oC.
8. Jetez les supernatants et suspendez les granulés dans 200 L de HBSS 2% FCS.
9. Transférer les cellules suspendues dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.
10. L'utilisation de la cytométrie de flux, comme indiqué dans le protocole FACS, évaluer la présence de lymphocytes positifs CD45.2.

6. Analyse des données

1. Ouvrez le logiciel "FlowJo" et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre "All sample".
2. Double clic sur le fichier "transféré" pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l'avant "SSC-A" sur l'axe Y et la diffusion latérale "FSC-A" sur l'axe X.
3. Cliquez sur «polygone» et créez une stratégie de gating pour sélectionner les lymphocytes, puis distinguez les cellules du donneur et de l'hôte à l'aide de marqueurs de surface cellulaire (CD45.1, CD45.2), puis caractérisent la population^de cellules CD45.2 (CD3, CD4).
4. Répétez les étapes d'analyse avec le fichier «souris de contrôle».
5. Pour visualiser une population cellulaire, cliquez sur "Layout editor".
6. Faites glisser les "cellules transférées" et les "cellules CD4 transférées" population de "transféré" et "contrôle" fichiers dans le " LayoutEditor tab".
7. Une parcelle de point représentant les cellules CD45.2^et les lymphocytes CD4 apparaîtra.
8. Les cellules transférées CD45.2 ne doivent apparaître que dans la parcelle de point «souris transférée».