5.11: Transfert adoptif de cellules : introduction de splénocytes d'une souris donneuse vers une souris hôte et évaluation du taux de succès au FACS

1. Préparation

1. Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
2. Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis sécher à fond.
3. Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

1. À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez la souris par hypoxie. Fixez la souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine et effectuez une laparotomie longitudinale à l'aide de ciseaux et de forceps.
2. L'utilisation de forceps déplacer les intestins et l'estomac sur le côté droit de l'abdomen pour exposer l'estomac et la rate. La rate est attachée à l'estomac.
3. À l'aide de forceps, détachez soigneusement la rate de l'estomac et placez-la sur le plat Petri contenant 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

1. Déposer la rate sur une passoire cellulaire de 40 m au-dessus du plat Petri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier.
2. Récupérer les cellules adhérentes en rinçant le piston et la passoire avec 1 ml de HBSS 2% FCS.
3. Transférer la rate dissociée et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
4. Laver le plat Petri avec 5 millilitres de HBSS 2% FCS et transférer le liquide dans le tube de 15 ml.
5. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
6. Resuspendre la pastille dans 2 ml de pipide de chlorure d'ammonium de potassium de haut en bas pour resuspendre la pastille et lyser les érythrocytes.
7. Attendez 2 min et ajoutez HBSS 2% FCS à la pastille remise en suspension pour obtenir le volume jusqu'à 14 ml.
8. Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS par pipetting de haut en bas.
9. Comptez les cellules à l'aide de l'essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Transfert d'adoption

1. Transférer 2 ml de suspension cellulaire obtenue dans un tube de collecte de 5 ml.
2. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter le supernatant.
3. Resuspendre la pastille dans 2 ml de PBS et centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC.
4. Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 200 L de PBS.
5. À l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 29 G injecte 200 l de suspension cellulaire dans la souris expérimentale par voie intraveineuse dans le sinus sanguin rétro-orbital.
6. En tant que contrôle, injectez une deuxième souris dans le même sinus sanguin avec 200 l de phosphate tamponné salin.

5. Récolte et coloration des cellules

1. Quatre jours après le transfert d'adoption, euthanasiez les souris et enlevez la rate.
2. Récoltez les splenocytes tels que décrits à la section 3.
3. Transférer 100 l de suspensions cellulaires de chaque souris dans deux tubes FACS, étiquetés « contrôle » et « transféré ».
4. Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter les supernatants.
5. Préparer un mélange contenant les quatre anticorps aux dilutions énumérées dans le tableau 1.

Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Préparation de quatre cocktails d'anticorps utilisant des conjugates concentrés anticorps-fluorescents et HBSS.

6. Ajouter 100 l de mélange à chaque tube, puis couver pendant 20 min sur glace dans l'obscurité.
7. Ajouter 1 ml de HBSS 2%FCS, puis centrifuger les tubes à 370 x g pendant 3 min à 10oC.
8. Jetez les supernatants et suspendez les granulés dans 200 L de HBSS 2% FCS.
9. Transférer les cellules suspendues dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.
10. L'utilisation de la cytométrie de flux, comme indiqué dans le protocole FACS, évaluer la présence de lymphocytes positifs CD45.2.

6. Analyse des données

1. Ouvrez le logiciel "FlowJo" et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre "All sample".
2. Double clic sur le fichier "transféré" pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l'avant "SSC-A" sur l'axe Y et la diffusion latérale "FSC-A" sur l'axe X.
3. Cliquez sur «polygone» et créez une stratégie de gating pour sélectionner les lymphocytes, puis distinguez les cellules du donneur et de l'hôte à l'aide de marqueurs de surface cellulaire (CD45.1, CD45.2), puis caractérisent la population^de cellules CD45.2 (CD3, CD4).
4. Répétez les étapes d'analyse avec le fichier «souris de contrôle».
5. Pour visualiser une population cellulaire, cliquez sur "Layout editor".
6. Faites glisser les "cellules transférées" et les "cellules CD4 transférées" population de "transféré" et "contrôle" fichiers dans le " LayoutEditor tab".
7. Une parcelle de point représentant les cellules CD45.2^et les lymphocytes CD4 apparaîtra.
8. Les cellules transférées CD45.2 ne doivent apparaître que dans la parcelle de point «souris transférée».

Le transfert de cellules adoptives est une méthode permettant d’introduire des cellules d’intérêt dans un organisme. Il s’agit d’une technique puissante pour étudier divers mécanismes biologiques, y compris l’action de classes spécifiques de cellules immunitaires. De plus, le transfert adoptif est un nouveau traitement prometteur pour de nombreuses affections, telles que celles nécessitant des greffes de moelle osseuse ou des traitements contre le cancer où les propres cellules T d’un patient peuvent être extraites, modifiées pour reconnaître et détruire les cellules cancéreuses, puis renvoyées dans le corps pour combattre les tumeurs.

En laboratoire, les modèles animaux sont souvent utilisés pour étudier le transfert adoptif. Par exemple, les souris CD45.1 Rag gamma-c knock-out manquent de récepteurs fondamentaux pour de nombreuses cytokines, qui sont essentielles à la différenciation normale des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes. En conséquence, les souris knock-out ont un développement lymphocytaire compromis et n’ont pas de cellules tueuses naturelles, ou NK, de cellules T ou de cellules B.

Le transfert adoptif peut être utilisé pour introduire les cellules immunitaires manquantes dans ces souris compromises, en récoltant d’abord des tissus de souris donneurs contenant de fortes concentrations de cellules immunitaires, telles que la rate. Le tissu est ensuite dissocié et une variété de cellules de la rate, y compris les cellules immunitaires, sont isolées. Ensuite, les érythrocytes indésirables, ou globules rouges, peuvent être lysés par l’ajout de tampon de lyse de potassium de chlorure d’ammonium et les globules blancs restants, ou splénocytes, sont ensuite séparés des débris cellulaires par centrifugation.

Enfin, les splénocytes purifiés sont injectés dans les souris immunodéprimées, ce qui facilite l’étude détaillée des fonctions de ces cellules. Plusieurs jours plus tard, le succès du transfert de cellules immunitaires adoptives peut être confirmé en isolant et en préparant d’abord les splénoncytes de l’hôte de la même manière que le tissu du donneur. Ensuite, ces cellules sont colorées à l’aide d’anticorps marqués contre les marqueurs de cellules immunitaires du donneur afin qu’elles puissent être vérifiées et triées à l’aide de FACS.

Pour commencer, mettez des gants de laboratoire et l’équipement de protection approprié. Ensuite, lavez une paire de pinces et de ciseaux à disséquer d’abord avec un détergent, puis avec de l’éthanol à 70 %, puis séchez-les avec une serviette en papier propre. Préparez 50 millilitres de solution saline équilibrée Hank’s, ou HBSS, avec 2 % de sérum de veau fœtal, ou FCS, en combinant un millilitre de FCS avec 49 millilitres de HBSS dans un tube de 50 millilitres. Mélangez en pipetant doucement la solution de haut en bas environ 10 fois.

Disséquez la souris euthanasiée et retirez sa rate comme démontré dans la technologie FACS du protocole vidéo JoVE pour la séparation des lymphocytes B spléniques. Pour isoler les cellules immunitaires, placez d’abord la rate sur une passoire cellulaire de 40 micromètres dans une boîte de Pétri. Écrasez la rate à l’aide d’un piston pour la dissocier dans le plat. Récupérez les cellules collées en rinçant le piston et la passoire avec 1 millilitre de HBSS 2 % FCS. Ensuite, pipetez la rate dissociée et le liquide de la boîte de Pétri dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Lavez la boîte de Pétri avec 5 millilitres de HBSS 2 % FCS et transférez le liquide dans le tube de 15 millilitres.

Centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis récupérez le tube avec précaution pour ne pas déranger la pastille. Maintenant, retirez le surnageant sans déranger la pastille et jetez le liquide dans un récipient à déchets approprié. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse de potassium de chlorure d’ammonium dans le tube de centrifugation et pipetez de haut en bas pour remettre la pastille en suspension et lyser les érythrocytes. Attendez deux minutes, puis ajoutez HBSS 2 % FCS au granulé remis en suspension pour obtenir une valeur totale de 14 millilitres. Répétez la centrifugation. Récupérez le tube avec précaution et jetez le surnageant. Ensuite, remettre en suspension la pastille dans 5 millilitres HBSS 2 % FCS en pipetant de haut en bas. Ensuite, comptez les cellules en suspension. Ajoutez cinq microlitres de bleu trypan à cinq microlitres de suspension cellulaire et mélangez bien par pipetage. Ensuite, déposez doucement une goutte de cinq microlitres de suspension cellulaire diluée entre le verre de couverture et la lame Malassez. Avec le microscope réglé sur un grossissement de 40X, comptez le nombre de cellules. Ajustez la concentration des cellules à 10 à sept cellules par millilitre en ajoutant le volume approprié de HBSS 2 % FCS.

Pour commencer le transfert adoptif, transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans un tube de collecte de cinq millilitres. Centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jetez le surnageant. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate et centrifugez le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez le surnageant. Ensuite, remettre en suspension la pastille dans 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. À l’aide d’une seringue de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 29, injectez 200 microlitres de suspension cellulaire dans la souris expérimentale par voie intraveineuse dans le sinus sanguin rétro-orbitaire.

Quatre jours après le transfert adoptif, euthanasiez les souris et enlevez la rate. Ensuite, récoltez les cellules immunitaires comme décrit dans la troisième section. Ensuite, transférez 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque souris dans deux tubes FACS étiquetés de contrôle et transférés. Centrifugez les tubes à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jetez les surnageants. Maintenant, préparez un mélange contenant les quatre anticorps à la dilution indiquée dans le tableau un. Ajoutez 100 microlitres du mélange dans chaque tube, puis incubez pendant 20 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2 % FCS dans chaque tube, puis centrifugez les tubes à 370 fois g pendant trois minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les surnageants puis remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de HBSS 2 % FCS. Transférez les cellules remises en suspension dans de nouveaux tubes FACS étiquetés. Maintenant, utilisez la cytométrie en flux comme indiqué dans le protocole FACS pour évaluer la présence de CD45. 2 lymphocytes positifs.

Maintenant, nous allons déterminer la présence de lymphocytes CD45.2 qui ont été isolés à partir du CD45. 1 spleen de l’hôte. Pour commencer, double-cliquez sur l’icône FlowJo et faites glisser les fichiers de chaque tube dans la fenêtre de tous les échantillons. Ensuite, double-cliquez sur le fichier transféré pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur un graphique à points qui affiche la diffusion vers l’avant FSCA sur l’axe des x et la diffusion latérale SSCA sur l’axe des y. Cliquez sur le polygone pour encercler les populations de lymphocytes. Une nouvelle fenêtre d’identification de sous-population apparaît. Cliquez sur OK. Maintenant, réglez l’axe des y sur FSC-W et l’axe des x sur FSC-A. Sélectionnez la population de cellules uniques à l’aide de l’outil Polygone, comme illustré précédemment.

Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre pour les cellules sélectionnées. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD45.2 sur le Y et CD45.1 sur le X. Cliquez sur l’icône T et personnalisez l’axe pour agrandir le tracé. Ensuite, cliquez sur polygone pour encercler les cellules positives CD45.2. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez les cellules transférées de votre population cellulaire et cliquez sur OK. Dans la même fenêtre, cliquez sur le rectangle pour sélectionner les cellules négatives CD45.2. Dans la fenêtre d’identification de la sous-population, nommez les cellules hôtes de votre population cellulaire et cliquez sur OK. Ensuite, double-cliquez sur la population encerclée CD45.2, population transférée, pour créer une nouvelle fenêtre pour les cellules sélectionnées. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD3 sur le Y et CD4 sur le X.

Ensuite, cliquez sur le polygone pour entourer les cellules CD3 positives du CD4. Dans cette fenêtre d’identification de sous-population, nommez votre population cellulaire de cellules CD4 transférées. Ensuite, répétez les étapes d’analyse précédentes avec le fichier de souris de contrôle. Enfin, pour visualiser vos populations de cellules, cliquez sur Éditeur de mise en page. Faites glisser les cellules transférées et la population de cellules CD4 transférées à partir des fichiers transférés et de contrôle vers l’onglet Éditeur de modèle. Un diagramme à points représentant les cellules CD45.2 positives et les lymphocytes CD4 apparaîtra. CD45. 2 Les cellules transférées ne doivent apparaître que dans le graphique à points de la souris transféré.