Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Aperçu de la procédure

Le typique ⁵¹Cr-release pour mesurer la mort cellulaire implique les étapes suivantes:

1. Tout d'abord, les cellules cibles sont étiquetées avec Na₂[⁵¹Cr]O₄. Cela les distingue des cellules effectrices dans l'assay.
2. Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, les cellules effectrices sont collectées et, en utilisant la technique de dilution en série, une titration décroissante des cellules effectrices est générée dans une plaque d'essais de 96 puits en bas rond.
3. À la fin de l'étiquetage des cellules cibles, les cellules sont d'abord lavées, puis un nombre fixe de cellules sont ajoutés à la plaque d'assay qui contient déjà une série de dilutions de cellules effectrices.
4. Ensuite, le mélange de cellules cibles-effecteurs est incubé pendant une période de temps définie afin de permettre une interaction cellulaire suffisante avec les cellules cibles, afin de médiatiser la lyse cellulaire.
5. Enfin, les supernatants de culture sont récoltés et récoltés dans des tubes. La quantité de ⁵¹Cr est quantitée à l'aide d'un compteur gamma.
6. À la fin, les données sont recueillies et utilisées pour calculer la « lyse cellulaire spécifique au pourcentage » des cellules cibles.

1. Étiquetage des cellules cibles avec ⁵¹Cr

1. Pour commencer, préparer les cellules cibles, (ici- ligne cellulaire du mélanome humain WM793), dans une suspension de cellule unique.
2. Pour ce faire, d'abord retirer les médias de la flacon de culture tissulaire.
3. Ensuite, lavez les cellules avec 5 ml de 1X PBS.
4. Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine à la plaque pendant 2 min.
5. Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon.
6. Ajouter 5 ml de milieu RPMI au flacon et pipet le milieu de haut en bas pour détacher les cellules.
7. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min. Decant le supernatant.
8. Ajouter 10 ml de support à la pastille et légèrement pipet le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.
9. Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.
10. Transférer 1x10⁶ cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.
11. Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min et décant le supernatant.
12. Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.
13. Ajouter 100 'Ci de ⁵¹Cr directement à la suspension de la cellule cible WM793.
    Note: Il devrait y avoir un espace de laboratoire dédié mis en place pour la radioactivité particulière. En outre, il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage et une utilisation sécuritaires du ⁵¹Cr pendant toutes les étapes ainsi qu'une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés. Un compteur Geiger équipé d'une sonde à crêpes est également nécessaire, pour l'arpentage de l'espace pour une contamination possible.
14. Ajouter un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que le tube est maintenant radioactif.
15. Placez le tube dans un incubateur à 37 oC avec un bouclier de plomb et incubez pendant 1 h. Faites glisser le tube toutes les 15-20 minutes pour augmenter l'apport cellulaire cible du chrome.
16. Après la période d'incubation, laver les cellules cibles avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
17. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min. Décant radioactif FBS laver dans un conteneur de déchets approprié.
18. Resuspendre la pastille et laver une deuxième fois avec FBS. Vérifiez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur Geiger.
19. Resuspendre la pastille dans un milieu complet de 10 ml, ce qui lui a procuré une concentration cellulaire de 10⁵ cellules/ml.
    Note: L'étape de comptage cellulaire après l'étiquetage ⁵¹Cr est omise ici en grande partie pour des raisons de sécurité. On peut supposer que la concentration de cellules WM793 est la même qu'avant l'étiquetage ⁵¹Cr.

2. Préparation des cellules effectrices

1. Une variété de cellules effectrices peuvent être utilisées, telles que les lymphocytes T humains ou de souris et les cellules NK. Dans cet exemple, des PBMC, isolés du sang entier par centrifugation standard de gradient de densité (à une concentration de 5x10^6),ont été utilisés.
2. Pour commencer, ajoutez 100 l de milieu de culture tissulaire à chaque puits de l'une des rangées (ici rangée A, Voir tableau 1) d'une plaque à fond rond de 96 puits. Ici, aucune cellule effectrice n'est ajoutée, et elles serviront de « blanc » pour déterminer la « libération minimale/spontanée ^{de 51}Cr » des cellules cibles.

Tableau 1 : ⁵¹Cr release assay layout: Row A- Target cells (10⁴ cells/ 100 'L) incubated with media only (generates 'blank' for determining the "minimum/spontaneous ⁵¹Cr release"). Lignes B à C- puits contenant différents effecteurs : ratios de cellules cibles (E:T), allant de 50:1 à 1,5:1. Ligne H- cellules cibles (10⁴ cellules/100 l) incubées avec 1% NP-40 (NP-40 lyses les cellules cibles, générant "maximum ou total ⁵¹Cr libération"). Chaque rapport E:T est testé en triplicate pour chaque condition expérimentale. Colonne 1-3- PBMC non stimulés et colonne 4-6- CPG-stimulé PBMCs.

3. Ensuite, générer une dilution des cellules sérielles 2X des PBMC (en triple pour chaque condition expérimentale), pour obtenir une concentration de cellules effectrices allant de 5x10⁵ à 15 625 cellules/100 L de médias (ici les lignes B à G).
   Note: Dans cet exemple, l'effecteur de départ : le ratio de cellule cible (E : T) est de 50:1. Toutefois, ce ratio peut être ajusté en fonction des spécificités expérimentales.
4. Laissez la dernière rangée vide (ici la rangée H) en n'ajoutant aucune cellule effectrice à ces puits. (Cette ligne sera utilisée pour générer le « nombre total de comptes/min, ou (c. p. m) » ou le « communiqué maximum ⁵¹Cr »).
5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 oC jusqu'à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

3. Ajout de ⁵¹cellules cibles WM793 étiquetées Cr à l'Assay

1. Après la période d'incubation, retirer les cellules cibles de l'incubateur et laver avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
2. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min, à l'aide d'une centrifugeuse désignée.
3. Retirez le lavage FBS (supernatant radioactif) dans un contenant de déchets approprié.
4. Répétez l'étape de lavage en rependant la pastille dans un frais de 5 ml de FBS.
5. Centrifuger les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 min.
6. Enfin, resuspendre la pastille en 10 ml de milieu complet.
7. Verser la suspension cellulaire WM793 ⁵¹étiquetée Cr (10⁵ cellules/mL) dans un réservoir de réactif jetable.
8. Ensuite, ajoutez 100 L de ces cellules cibles étiquetées, à chaque puits de la plaque de cellules effectrice s'il y a 96 puits, à l'aide d'une pipette multicanal.
9. Ensuite, ajoutez 100 OL de 1 % De NP-40 (dans l'eau) à la rangée de puits dépourvus de toute cellule effectrice (ici rangée H). 1% NP-40 lysera les cellules cibles, et donc ces puits serviront de contrôles pour déterminer le "nombre total / min, ou (c. p. m)" ou le maximum ⁵¹Cr libération.
10. Fixez le couvercle à la plaque en ajoutant un petit morceau de ruban perméable au gaz de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu'il contient ⁵¹Cr.
11. En bref, centrifuger la plaque à 1200 tr/min. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d'équilibre à la centrifugeuse.
    Note: Il est important d'utiliser une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs.
12. Retirer la plaque de la centrifugeuse.
13. Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC avec un petit morceau de plomb protégeant la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 h pour permettre la lyse cellulaire cible.
    Note: La période d'incubation peut varier de 4 à 18 h selon les cellules effectrices utilisées et le mécanisme potentiel de mise à mort utilisé.

4. Récolte des Supernatants

1. À la fin de la période d'incubation, retirer soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirer le couvercle.
2. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque, en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Cela assurera la collecte d'un supernatant sans cellules.
3. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits.
4. Après environ 10 secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube.
5. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire.
6. Enfin, chargez les tubes FACS sur le compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de ⁵¹Cr libérées dans chaque condition. Les échantillons sont généralement mesurés pendant 1 minute, ce qui permet une détermination facile des « comptes/minute ».
7. Enregistrez soigneusement l'ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

5. Analyse des données

1. Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux trois premières colonnes, et des PBMC stimulés par le CpG (CpG ODN, (1 g/mL) pendant 24 h) ont été ajoutés aux colonnes 4-6. Voir tableau 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
un	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
gr	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H (en)	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Ⅰ	Moyenne de A1,A2,A3 -gt;		1164.67	Spontané c.p.m		1058.33
J	Moyenne de B1,B2,B3 -gt;		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Moyenne de C1,C2,C3 -Gt;		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
l	Moyenne de D1,D2,D3 -Gt;		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
m	Moyenne de E1,E2,E3 -Gt;		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
n	Moyenne de F1,F2,F3 -Gt;		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
ô	Moyenne de G1,G2,G3 -gt;		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
page	Moyenne de H1,H2,H3 -Gt;		8884.67	Maximum c.p.m		8885.67
				PBMC Unstim			CPG-stim PBMC	Ratio E:T

Tableau 2 : ⁵¹données d'analyse de sortie Cr : Valeurs de données 'comptes par minute' / 'c. p. m', valeurs moyennes c. p. m, et valeurs de lyse spécifiques pour cent calculées.

2. Les données recueillies (comptes par minute, c.-à-d. c.p.m) ont été saisies dans les cellules d'une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d'origine.
3. Tout d'abord, les moyennes des tripliciats ont été calculées. Tableau 2 - cellules I3 à P3, pour les PBMC non stimulés et les cellules I6 à P6, pour les PBMC stimulés par le CpG.
4. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition a été calculé à l'aide de la formule suivante-
   
   
5. Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé pour chaque condition (tableau 2 - cellules J4 à O4, pour les PBMC non stimulés et J7 à O7, pour les PBMC non stimulés).