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Advanced Biology

Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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Immunology

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Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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11:48 min

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April 30, 2023

Overview

Source : Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3, et Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Microbiologie, immunologie et programme d’études supérieures en biologie du cancer, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Center for Immunology, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Département d’urologie, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centre du cancer maçonnique, Université du Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Une des principales fonctions des cellules du système immunitaire est d’enlever les cellules cibles qui ont été infectées par des virus ou ont subi une transformation en une cellule tumorale. Les tests in vitro pour mesurer la capacité cytotoxique des cellules immunitaires sont un aliment de base dans les laboratoires depuis de nombreuses années. Ces essais ont été utilisés pour déterminer la capacité des lymphocytes T, des cellules NK, ou de toute autre cellule immunitaire à tuer les cellules cibles d’une manière spécifique à l’antigène ou non spécifique. Les ligands de la mort (p. ex. Fas ligand ou TRAIL), les cytokines (p. ex. IFNg ou TNF) ou les granules cytotoxiques (p. ex., perforine/granzyme B) exprimés par les cellules effectrices sont quelques façons d’intenter l’induit de la mort cellulaire cible. Avec l’explosion de la recherche d’immunothérapie de tumeur ces dernières années, il y a l’intérêt croissant dans trouver des agents pour augmenter l’activité cytotoxique des cellules immunitaires pour améliorer des résultats patients. Inversement, certaines maladies sont marquées par l’activité surexubérante de l’activité cytotoxique des cellules immunitaires, ce qui entraîne des efforts pour identifier les agents pour tempérer ces réponses. Ainsi, avoir un test dans lequel l’utilisateur peut facilement intégrer un certain nombre de cellules effectrices différentes, cellules cibles, et / ou modificateurs de réponse dans la conception expérimentale peut servir de moyen précieux d’évaluer rapidement la capacité cytotoxique des cellules effectrices et / ou la réactivité de la cellule cible.

Ces essais in vitro impliquent le mélange de différentes populations cellulaires, ainsi que l’utilisation d’un nombre relativement faible de cellules effectrices et cibles. Ainsi, l’une des nécessités de l’analyse est d’étiqueter les cellules cibles d’une manière qui peut facilement être détectée et quantit, permettant à l’utilisateur de déterminer ensuite la « lyse spécifique pour cent » médiée par les cellules effectrices. La radioactivité – en particulier, le chrome 51 (⁵¹Cr) sous la forme de Na₂⁵¹CrO₄– est un moyen peu coûteux d’étiqueter rapidement et non spécifiquement les protéines cellulaires dans les cellules cibles (1). L’étiquetage court et les temps d’assiduité total réduisent le risque de changements significatifs dans le nombre et/ou le phénotype des cellules cibles, ce qui pourrait influencer le résultat de l’effort. Lors de la perte de l’intégrité de la membrane des cellules cibles en raison de l’activité cytotoxique des cellules effectrices, les ⁵¹protéines cellulaires étiquetées Cr dans les cellules cibles sont libérées dans le supernatant de culture, devenant disponibles pour Quantification. Comme avec tout analyse examinant la fonction des cellules immunitaires in vitro,il ya un certain nombre de considérations importantes à envisager d’améliorer la performance de l’expérience. Une des caractéristiques les plus critiques est d’utiliser l’effecteur sain (pour l’activité cytotoxique maximale) et la cible (pour la réactivité maximale et la mort spontanée minimale /⁵¹Cr libération) cellules. Le contact entre l’effet et les cellules cibles est nécessaire (ce qui conduit à l’utilisation courante de plaques rondes de 96 puits pour encourager le contact cellule-cellule) (2). Enfin, l’analyse des données dépend de l’inclusion de populations de cellules cibles de contrôle positives et négatives.

Le protocole suivant exposera les étapes pour effectuer un jeu standard de libération ^{de 51}Cr pour mesurer la capacité cytotoxique d’une population de cellules effectrices, bien qu’une version non radioactive utilisant europium ait été récemment développée. ^{51 Annonces} Cr est un puissant émetteur de rayonnement. Par conséquent, l’utilisation de cet analyse nécessite une formation appropriée en matière de sécurité des rayonnements, un espace de laboratoire dédié, un compteur gamma et l’élimination d’échantillons radioactifs.

La séquence générale des événements dans cet état d’œil est la suivante : 1) préparer ⁵¹cibles étiquetées Cr; 2) préparer les cellules effectrices et les ajouter à la plaque pendant que les cellules cibles sont étiquetées; 3) ajouter des cibles étiquetées à la plaque; 4) plaque incubée; 5) les supernatants de récolte ; et 6) analyser les données après l’exécution d’échantillons sur le comptoir. Les échantillons sont généralement préparés en triple, puis en moyenne pour tenir compte de toute différence subtile de pipetage.

Un EPI approprié est important pour cet avertissement. Plus précisément, l’utilisateur doit porter une blouse de laboratoire et des gants. Des lunettes de sécurité peuvent être requises en fonction du laboratoire ou de l’établissement. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage sûr et l’utilisation de la ⁵¹Cr pendant toutes les étapes. Enfin, il devrait y avoir un espace de laboratoire et de l’équipement dédiés réservés à l’utilisation de ⁵¹Cr, y compris toutes les signalisations appropriées pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés et un compteur Geiger équipé d’une sonde gamma pour étudier l’espace pour possible contamination.

Dans cet exercice de laboratoire, nous déterminerons la capacité des cellules mononucléaires périphériques humaines de sang (PBMCs), (CpG stimulées contre non stimulées) pour tuer des cellules de mélanome, utilisant la ligne humaine de cellules de mélanome WM793 comme modèle et l’essai de libération de chrome.

Procedure

Aperçu de la procédure

Le typique ⁵¹Cr-release pour mesurer la mort cellulaire implique les étapes suivantes:

Tout d’abord, les cellules cibles sont étiquetées avec Na₂[⁵¹Cr]O₄. Cela les distingue des cellules effectrices dans l’assay.
Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, les cellules effectrices sont collectées et, en utilisant la technique de dilution en série, une titration décroissante des cellules effectrices est générée dans une plaque d’essais de 96 puits en bas rond.
À la fin de l’étiquetage des cellules cibles, les cellules sont d’abord lavées, puis un nombre fixe de cellules sont ajoutés à la plaque d’assay qui contient déjà une série de dilutions de cellules effectrices.
Ensuite, le mélange de cellules cibles-effecteurs est incubé pendant une période de temps définie afin de permettre une interaction cellulaire suffisante avec les cellules cibles, afin de médiatiser la lyse cellulaire.
Enfin, les supernatants de culture sont récoltés et récoltés dans des tubes. La quantité de ⁵¹Cr est quantitée à l’aide d’un compteur gamma.
À la fin, les données sont recueillies et utilisées pour calculer la « lyse cellulaire spécifique au pourcentage » des cellules cibles.

1. Étiquetage des cellules cibles avec ⁵¹Cr

Pour commencer, préparer les cellules cibles, (ici- ligne cellulaire du mélanome humain WM793), dans une suspension de cellule unique.
Pour ce faire, d’abord retirer les médias de la flacon de culture tissulaire.
Ensuite, lavez les cellules avec 5 ml de 1X PBS.
Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine à la plaque pendant 2 min.
Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon.
Ajouter 5 ml de milieu RPMI au flacon et pipet le milieu de haut en bas pour détacher les cellules.
Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min. Decant le supernatant.
Ajouter 10 ml de support à la pastille et légèrement pipet le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.
Déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
Transférer 1×10⁶cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.
Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min et décant le supernatant.
Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.
Ajouter 100 ‘Ci de ⁵¹Cr directement à la suspension de la cellule cible WM793.
Note: Il devrait y avoir un espace de laboratoire dédié mis en place pour la radioactivité particulière. En outre, il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage et une utilisation sécuritaires du ⁵¹Cr pendant toutes les étapes ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire, pour l’arpentage de l’espace pour une contamination possible.
Ajouter un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que le tube est maintenant radioactif.
Placez le tube dans un incubateur à 37 oC avec un bouclier de plomb et incubez pendant 1 h. Faites glisser le tube toutes les 15-20 minutes pour augmenter l’apport cellulaire cible du chrome.
Après la période d’incubation, laver les cellules cibles avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min. Décant radioactif FBS laver dans un conteneur de déchets approprié.
Resuspendre la pastille et laver une deuxième fois avec FBS. Vérifiez la radioactivité incorporée à l’aide d’un compteur Geiger.
Resuspendre la pastille dans un milieu complet de 10 ml, ce qui lui a procuré une concentration cellulaire de 10⁵ cellules/ml.
Note: L’étape de comptage cellulaire après l’étiquetage ⁵¹Cr est omise ici en grande partie pour des raisons de sécurité. On peut supposer que la concentration de cellules WM793 est la même qu’avant l’étiquetage ⁵¹Cr.

2. Préparation des cellules effectrices

Une variété de cellules effectrices peuvent être utilisées, telles que les lymphocytes T humains ou de souris et les cellules NK. Dans cet exemple, des PBMC, isolés du sang entier par centrifugation standard de gradient de densité (à une concentration de 5×10^6),ont été utilisés.
Pour commencer, ajoutez 100 l de milieu de culture tissulaire à chaque puits de l’une des rangées (ici rangée A, Voir tableau 1) d’une plaque à fond rond de 96 puits. Ici, aucune cellule effectrice n’est ajoutée, et elles serviront de « blanc » pour déterminer la « libération minimale/spontanée ^{de 51}Cr » des cellules cibles.

Tableau 1 : ⁵¹Cr release assay layout: Row A- Target cells (10⁴ cells/ 100 ‘L) incubated with media only (generates ‘blank’ for determining the “minimum/spontaneous ⁵¹Cr release”). Lignes B à C- puits contenant différents effecteurs : ratios de cellules cibles (E:T), allant de 50:1 à 1,5:1. Ligne H- cellules cibles (10⁴ cellules/100 l) incubées avec 1% NP-40 (NP-40 lyses les cellules cibles, générant “maximum ou total ⁵¹Cr libération”). Chaque rapport E:T est testé en triplicate pour chaque condition expérimentale. Colonne 1-3- PBMC non stimulés et colonne 4-6- CPG-stimulé PBMCs.

Ensuite, générer une dilution des cellules sérielles 2X des PBMC (en triple pour chaque condition expérimentale), pour obtenir une concentration de cellules effectrices allant de 5×10⁵ à 15 625 cellules/100 L de médias (ici les lignes B à G).
Note: Dans cet exemple, l’effecteur de départ : le ratio de cellule cible (E : T) est de 50:1. Toutefois, ce ratio peut être ajusté en fonction des spécificités expérimentales.
Laissez la dernière rangée vide (ici la rangée H) en n’ajoutant aucune cellule effectrice à ces puits. (Cette ligne sera utilisée pour générer le « nombre total de comptes/min, ou (c. p. m) » ou le « communiqué maximum ⁵¹Cr »).
Placez la plaque dans un incubateur à 37 oC jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

3. Ajout de ⁵¹cellules cibles WM793 étiquetées Cr à l’Assay

Après la période d’incubation, retirer les cellules cibles de l’incubateur et laver avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min, à l’aide d’une centrifugeuse désignée.
Retirez le lavage FBS (supernatant radioactif) dans un contenant de déchets approprié.
Répétez l’étape de lavage en rependant la pastille dans un frais de 5 ml de FBS.
Centrifuger les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 min.
Enfin, resuspendre la pastille en 10 ml de milieu complet.
Verser la suspension cellulaire WM793 ⁵¹étiquetée Cr (10⁵ cellules/mL) dans un réservoir de réactif jetable.
Ensuite, ajoutez 100 L de ces cellules cibles étiquetées, à chaque puits de la plaque de cellules effectrice s’il y a 96 puits, à l’aide d’une pipette multicanal.
Ensuite, ajoutez 100 OL de 1 % De NP-40 (dans l’eau) à la rangée de puits dépourvus de toute cellule effectrice (ici rangée H). 1% NP-40 lysera les cellules cibles, et donc ces puits serviront de contrôles pour déterminer le “nombre total / min, ou (c. p. m)” ou le maximum ⁵¹Cr libération.
Fixez le couvercle à la plaque en ajoutant un petit morceau de ruban perméable au gaz de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient ⁵¹Cr.
En bref, centrifuger la plaque à 1200 tr/min. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d’équilibre à la centrifugeuse.
Note: Il est important d’utiliser une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs.
Retirer la plaque de la centrifugeuse.
Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC avec un petit morceau de plomb protégeant la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 h pour permettre la lyse cellulaire cible.
Note: La période d’incubation peut varier de 4 à 18 h selon les cellules effectrices utilisées et le mécanisme potentiel de mise à mort utilisé.

4. Récolte des Supernatants

À la fin de la période d’incubation, retirer soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirer le couvercle.
Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque, en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Cela assurera la collecte d’un supernatant sans cellules.
Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits.
Après environ 10 secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube.
Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire.
Enfin, chargez les tubes FACS sur le compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de ⁵¹Cr libérées dans chaque condition. Les échantillons sont généralement mesurés pendant 1 minute, ce qui permet une détermination facile des « comptes/minute ».
Enregistrez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

5. Analyse des données

Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux trois premières colonnes, et des PBMC stimulés par le CpG (CpG ODN, (1 g/mL) pendant 24 h) ont été ajoutés aux colonnes 4-6. Voir tableau 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
un	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
gr	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H (en)	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Ⅰ	Moyenne de A1,A2,A3 -gt;		1164.67	Spontané c.p.m		1058.33
J	Moyenne de B1,B2,B3 -gt;		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Moyenne de C1,C2,C3 -Gt;		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
l	Moyenne de D1,D2,D3 -Gt;		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
m	Moyenne de E1,E2,E3 -Gt;		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
n	Moyenne de F1,F2,F3 -Gt;		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
ô	Moyenne de G1,G2,G3 -gt;		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
page	Moyenne de H1,H2,H3 -Gt;		8884.67	Maximum c.p.m		8885.67
				PBMC Unstim			CPG-stim PBMC	Ratio E:T

Tableau 2 : ⁵¹données d’analyse de sortie Cr : Valeurs de données ‘comptes par minute’ / ‘c. p. m’, valeurs moyennes c. p. m, et valeurs de lyse spécifiques pour cent calculées.

Les données recueillies (comptes par minute, c.-à-d. c.p.m) ont été saisies dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine.
Tout d’abord, les moyennes des tripliciats ont été calculées. Tableau 2 – cellules I3 à P3, pour les PBMC non stimulés et les cellules I6 à P6, pour les PBMC stimulés par le CpG.
Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition a été calculé à l’aide de la formule suivante-
Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé pour chaque condition (tableau 2 – cellules J4 à O4, pour les PBMC non stimulés et J7 à O7, pour les PBMC non stimulés).

Dans cette vidéo, vous observerez comment effectuer l’analyse de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices.

Les cellules immunitaires sont responsables de l’identification et de l’élimination des cellules potentiellement nocives, comme le cancer ou les cellules infectées par le virus, du corps, qui fait partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les lymphocytes T et les cellules NK, possèdent une propriété connue sous le nom de potentiel cytotoxique, qui est la capacité d’identifier les cellules cibles et de sécréte des protéines qui induisent la dégradation des protéines, la lyse et la mort de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l’activation et la puissance des cellules immunitaires, et l’analyse de libération de chrome est couramment utilisée à cette fin.

Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans des conditions différentes, ce qui est précieux pour l’étude de l’immunothérapie contre le cancer et les maladies liées à l’immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est pris par les cellules. Ensuite, ces cellules étiquetées par radio sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d’intérêt, également appelées les cellules effectrices, dans un fond rond, 96-puits plaque pour faciliter l’interaction entre les deux types de cellules.

La configuration globale de l’analyse implique l’incubation d’un nombre spécifique de cellules cibles avec des concentrations différentes des cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d’induire l’apoptose et la lyse dans les cellules cibles, ce qui entraîne la libération du chrome intracellulaire 51 dans le supernatant. Puis, à un moment préoptimisé, le supernatant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre des radiations gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les supernatants de tous les puits de la plaque d’analyse représentent une sortie quantifiable de la lyse des cellules cibles. Ceci est mesuré à l’aide d’un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires.

Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire du mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées en une suspension cellulaire unique. Pour ce faire, d’abord retirer le support de la flacon de culture tissulaire et laver les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décant le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine à la plaque pendant environ deux minutes. Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon, puis ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI au flacon. Pipette le média de haut en bas pour recueillir les cellules et ajouter cette suspension à un tube conique de 15 millilitres.

Placer le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le support du tube en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire. Faites glisser doucement le fond du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajouter 10 millilitres de support au tube. Ensuite, pipette doucement le média de haut en bas pour amener les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d’origine à un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placer le tube dans une centrifugeuse et granuler les cellules à 12 cents tr/min pendant cinq minutes. Après centrifugation, verser l’excès de support du tube dans un contenant à déchets. Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.

Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en déménageant dans un laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il devrait y avoir un large blindage au plomb pour le stockage et l’utilisation sécuritaires du Chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l’espace pour une contamination possible.

Une fois mis en place pour l’utilisation appropriée de la radioactivité, ajouter 100 microcuries de chrome 51 directement à la suspension de la cellule cible. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que l’échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec un bouclier de plomb et incubez pendant une heure, en faisant glisser le tube toutes les 15 à 20 minutes.

Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, préparez une suspension cellulaire unique des cellules effectrices. Dans cet exemple, les cellules nucléaires périphériques humaines de sang, ou PDMCs, ont été isolées du sang entier par la centrifugation standard de gradient de densité à une concentration de 5 fois 10 au 6ème. Transférer cette suspension de cellules effector dans un réservoir de réactif jetable, puis ajouter 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque de 96 puits à fond rond. Ensuite, ajouter 100 microlitres de RPMI à chaque puits dans la rangée C à travers G de la plaque.

Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC s’acquiescent à une gamme de nombres de cellules effectrices en enlevant d’abord 100 microlitres des cellules dans les puits de la rangée B et en l’ajoutant à la rangée C. Ensuite, diluer davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Continuer la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacez 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire aux puits de la rangée A pour servir de contrôle pour la libération spontanée de chrome 51 des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne devrait être ajoutée à cette ligne. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

Après la période d’incubation, retirer les cellules cibles de l’incubateur et laver avec 5 millilitres de FBS pour enlever tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif de FBS dans un récipient approprié de déchet et répétez l’étape de lavage en rependant le granule dans un frais 5 millilitres de FBS. Placer le tube dans une centrifugeuse désignée et faire tourner les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez la radioactivité incorporée à l’aide d’un compteur Geiger. Enfin, resuspendre la pastille en 10 millilitres de milieu complet et verser le Chrome 51 étiqueté, suspension de cellule cible dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles étiquetées à chaque puits de la plaque de cellules effectrices de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 1% NP-40 dans l’eau aux puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de chaque rangée. Ces puits seront utilisés comme un contrôle pour déterminer le nombre total par minute, ou cpm.

Maintenant que la plaque est préparée, fixer le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placer un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d’équilibre à la centrifugeuse. Mettre la centrifugeuse à 1200 tr/min et mettre la plaque à jour. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirer la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius avec un petit morceau de plomb protégeant sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyse.

À la fin de la période d’incubation, retirez soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après environ dix secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Enregistrez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des CBP stimulés par le CGP ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptes par minute ont été entrés dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine et les moyennes des triplicats ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, les cellules A1, A2 et A3 ont été moyennes dans la cellule I3. Une fois que les moyennes sont déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l’aide de cette formule. Par exemple, pour calculer la lyse spécifique pour cent pour les cellules non stimulées qui ont eu un rapport de 50 pour 1 cellules effectrices aux cellules cibles le CPM spontané, qui dans cet exemple, est 1164.67, a été soustrait du CPM expérimental, 1129. 67. Ce nombre peut alors être divisé par la différence entre le CPM maximum et le CPM spontané, puis multiplié par 100 pour donner la lyse spécifique pour cent. Ceci est ensuite calculé pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être graphiques pour montrer la comparaison du rapport E/T avec la lyse spécifique pour cent pour les PBMC non stimulés, et le CPG stimulé PBMCs. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec cPG ont plus efficacement tué les cellules cibles à mesure que le rapport des cellules effectrices aux cellules cibles augmentait. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation du CPG est nécessaire pour l’augmentation observée de la lyse cellulaire cible.

Results

Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées par le CpG (figure 1, cercles noirs)ont tué les cellules cibles plus efficacement, à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés(cercles blancs),ce qui indique que la stimulation du CpG est nécessaire pour l’augmentation observée de la lyse cellulaire cible.

Figure 1: ⁵¹Cr essai scatter plot: Activité tumoricidale par les PBMCs humains, non stimulés (cercles blancs) et après stimulation avec CpG (cercles noirs), testé s’est effectué à l’effecteur différent: ratios de cellules cibles (E: T) ratios (allant de . 50:1 à 1.5:1).

Applications and Summary

Le spoque décrit ici a une flexibilité considérable, comme une variété de cellules effectrices et cibles peuvent être utilisés en fonction de la question posée. Par exemple, la spécificité des cellules effectrices peut être déterminée en utilisant différentes cellules cibles ou le mécanisme de l’abattage des cellules effectrices peut être déterminé en utilisant des cellules déficientes en protéines spécifiques ou en utilisant des inhibiteurs spécifiques des protéines. Un problème majeur avec l’assay de libération ^{de 51}Cr est le potentiel pour un taux de libération spontanée élevé par les cellules cibles. Lorsqu’il est cultivé seul (sans cellules effectrices), la libération spontanée de ⁵¹Cr par les cellules cibles ne devrait idéalement pas dépasser 30 % de la libération totale (« maximale ») par les cellules cibles immédiatement lyse. Des taux de libération spontanée plus élevés peuvent être dus à l’utilisation de cellules cibles malsaines, soit en raison d’une mauvaise santé (p. ex., culture prolongée d’une lignée cellulaire) ou d’une période d’étiquetage trop longue.

References

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Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

Transcript

In this video you will observe how to perform the chromium release assay and determine the cytotoxic potential of the effector cells.

Immune cells are responsible for identifying and removing potentially harmful cells, like cancer or virus-infected cells, from the body, which is an integral part of the immune response. Several immune cells, like T-cells and NK cells, possess a property known as cytotoxic potential, which is the ability to identify target cells and secrete proteins that induce protein degradation, lysis, and death of those target cells. Quantifying cytotoxic potential is critical for measuring immune cell activation and potency, and the chromium release assay is commonly used for this purpose.

This method enables users to compare cytoxicity induced by specific types of immune cells under different conditions, which is valuable for studying cancer immunotherapy and immunity related diseases. To begin, the target cells, like cancer cells, are incubated with a radioactive isotope, chromium 51, which is taken up by the cells. Next, these radio labeled cells are co-cultured with the isolated immune cells of interest, also called the effector cells, in a round bottom, 96- well plate to facilitate interaction between the two cell types.

The overall setup of the assay involves incubating a specific number of target cells with different concentrations of the immune cells, along with appropriate controls. The co-culture allows the effector cells to induce apoptosis and lysis in the target cells, resulting in the release of the intracellular chromium 51 into the supernatant. Then, at a preoptimized time point, the supernatant containing the released chromium is harvested from all the wells. The chromium 51, being radioactive, spontaneously undergoes radioactive decay to emit gamma radiation. The gamma radiation levels in the supernatants from all the wells in the assay plate represent a quantifiable output of the lysis of the target cells. This is measured using a gamma counter, which is then used to determine the cytotoxic potential of the immune cells.

To begin, the target cells, human melanoma cell line WM793 in this example, are prepared into a single cell suspension. To do this, first remove the media from the tissue culture flask and wash the cells with five milliliters of 1X PBS. Decant the PBS and then add one milliliter of trypsin to the plate for approximately two minutes. Gently tap the flask to loosen the cells from the flask surface and then add five milliliters of RPMI media to the flask. Pipette the media up and down to collect the cells and add this suspension to a 15 milliliter conical tube.

Place the tube in the centrifuge for five minutes at 1200 RPM. Next, remove the media from the tube making sure not to disrupt the cell pellet. Gently flick the bottom of the tube to disrupt the cell pellet and add 10 milliliters of media to the tube. Then, gently pipette the media up and down to bring the cells into suspension. Next, determine the cell concentration using a hemocytometer and transfer two milliliters of the original cell suspension to a new 15 milliliter conical tube. Place the tube into a centrifuge and pellet the cells at 12 hundred RPM for five minutes. After centrifugation, pour the excess media out of the tube into a waste container. Briefly vortex the tube to resuspend the cell pellet in the small volume of medium left behind.

Next, prepare to use Chromium 51 by moving to a lab space dedicated for this particular radioactivity. There should be ample lead shielding for safe storage and use of the Chromium 51 during all steps, as well as proper signage to indicate where samples with Chromium 51 are being kept. A Geiger counter equipped with a pancake probe is also necessary to serve in the space for possible contamination.

Once set up for the proper use of radioactivity, add 100 microcuries of Chromium 51 directly to the target cell suspension. Then, add a small piece of radioactive tape to the tube to indicate that the sample and tube are now radioactive. Place the tube in a 37 degree celsius incubator with a lead shield and incubate for an hour, flicking the tube every 15 to 20 minutes.

While the target cells are labeling, prepare a single cell suspension of effector cells. In this example, human peripheral blood mono nuclear cells, or PDMCs, were isolated from whole blood by standard density gradient centrifugation to a concentration of 5 times 10 to the 6th. Transfer this effector cell suspension into a disposable reagent reservoir and then add 200 microliters of this suspension into each well of row B in a 96-well round-bottom plate. Next, add 100 microliters of RPMI to each well in row C through G of the plate.

Now, begin performing serial dilutions of the PBMCs to have a range of effector cell numbers by first removing 100 microliters of the cells in the wells in row B and adding this to row C. Then, further dilute the effector cells by transferring 100 microliters of cells from row C to row D. Continue the serial dilution. Once row G is reached, move 100 microliters from the wells to leave a final volume of 100 microliters in each well in that row. Next, add 100 microliters of tissue culture medium to the wells in row A to serve as a control for the spontaneous release of Chromium 51 from the target cells, as no effector cells should be added to this row. Then, place a plate into a 37 degree celsius incubator until the target cells are ready to be added.

After the incubation period, remove the target cells from the incubator and wash with 5 milliliters of FBS to remove any excess Chromium 51. Then, place the tube in a designated centrifuge and spin at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the radioactive FBS wash into an appropriate waste container and repeat the wash step by resuspending the pellet in a fresh 5 milliliters of FBS. Place the tube in a designated centrifuge and spin the cells again at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the second wash and check the pellet for incorporated radioactivity using a Geiger counter. Finally, Resuspend the pellet in 10 milliliters of complete medium and pour the Chromium 51 labeled, target cell suspension into a disposable reagent reservoir. Then, add 100 microliters of these labeled target cells to every well of the 96-well effector cell plate. Next, add 100 microliters of 1% NP-40 in water to the wells in row H to lyse all the target cells this each row. These wells will be used as a control to determine the total counts per minute, or cpm.

Now that the plate is prepared, secure the lid by adding a small piece of tape to the each side of the plate and place a piece of radioactive tape on the lid to indicate it contains chromium 51. Then, place the plate in a centrifuge marked to handle radioactive samples. If only one experimental plate is being used, add a balance plate to the centrifuge. Set the centrifuge to 1200 rpm, and bring the plate up to speed. Once at the speed, stop the machine. Remove the plate from the centrifuge. Then, place the plate in a 37 degree celsius incubator with a small piece of lead shielding over the plate for additional safety. Incubate for 16 hours to allow the target cells to lyse.

At the end of the incubation period, carefully remove the tape around the edge of the plate, and remove the lid. Next, place the harvesting frame on the plate making sure to confirm the small filter discs are in place for each of the cotton plugs. Now, slowly and gently press the cotton plugs into the wells. After approximately ten seconds, release the pressure on the cotton plugs, and then transfer the cotton plugs to tube strips. Place each of these tubes into a secondary FACS tube. Finally, load the FACS tubes onto a gamma counter and run the samples to quantitate the amount of chromium 51 released in each condition. Carefully record the order in which the tubes were loaded into the counter.

Here, unstimulated PBMCs were added to the first 3 lanes and CPG stimulated PMBCs were added to lanes 4 through 6. In this example, the counts per minute were entered into the cells of a spreadsheet in the same manner as the samples were laid out in the original plate and the averages of the triplicates were calculated. For example, for the first condition, cells A1, A2, and A3 were averaged in cell I3. Once the averages are determined, the percent of specific lysis for each condition can be calculated using this formula. For example, to calculate the percent specific lysis for the unstimulated cells that had a ratio of 50 to 1 effector cells to target cells the spontaneous CPM, which in this example, is 1164.67, was subtracted from the experimental CPM, 1129. 67. This number can then be divided by the difference between the maximum CPM and the spontaneous CPM, and then multiplied by 100 to give the percent specific lysis. This is then calculated for each condition. These data can then be graphed to show comparison of the E to T ratio with the percent specific lysis for both the unstimulated PBMCs, and the CPG stimulated PBMCs. In this example, effector cells stimulated with CPG more effectively killed target cells as the ratio of effector cells to target cells increased. This increase was not observed in the unstimulated PBMCs, indicating that CPG stimulation is necessary for the observed increase in target cell lysis.

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