5.12: Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Aperçu de la procédure

Le typique ⁵¹Cr-release pour mesurer la mort cellulaire implique les étapes suivantes:

1. Tout d'abord, les cellules cibles sont étiquetées avec Na₂[⁵¹Cr]O₄. Cela les distingue des cellules effectrices dans l'assay.
2. Pendant que les cellules cibles sont étiquetées, les cellules effectrices sont collectées et, en utilisant la technique de dilution en série, une titration décroissante des cellules effectrices est générée dans une plaque d'essais de 96 puits en bas rond.
3. À la fin de l'étiquetage des cellules cibles, les cellules sont d'abord lavées, puis un nombre fixe de cellules sont ajoutés à la plaque d'assay qui contient déjà une série de dilutions de cellules effectrices.
4. Ensuite, le mélange de cellules cibles-effecteurs est incubé pendant une période de temps définie afin de permettre une interaction cellulaire suffisante avec les cellules cibles, afin de médiatiser la lyse cellulaire.
5. Enfin, les supernatants de culture sont récoltés et récoltés dans des tubes. La quantité de ⁵¹Cr est quantitée à l'aide d'un compteur gamma.
6. À la fin, les données sont recueillies et utilisées pour calculer la « lyse cellulaire spécifique au pourcentage » des cellules cibles.

1. Étiquetage des cellules cibles avec ⁵¹Cr

1. Pour commencer, préparer les cellules cibles, (ici- ligne cellulaire du mélanome humain WM793), dans une suspension de cellule unique.
2. Pour ce faire, d'abord retirer les médias de la flacon de culture tissulaire.
3. Ensuite, lavez les cellules avec 5 ml de 1X PBS.
4. Trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine à la plaque pendant 2 min.
5. Appuyez doucement sur le flacon pour desserrer les cellules de la surface du flacon.
6. Ajouter 5 ml de milieu RPMI au flacon et pipet le milieu de haut en bas pour détacher les cellules.
7. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min. Decant le supernatant.
8. Ajouter 10 ml de support à la pastille et légèrement pipet le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.
9. Déterminer la concentration cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.
10. Transférer 1x10⁶ cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.
11. Centrifugelant la suspension cellulaire pendant 5 min à 1200 tr/min et décant le supernatant.
12. Vortex brièvement le tube pour resuspendre la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.
13. Ajouter 100 'Ci de ⁵¹Cr directement à la suspension de la cellule cible WM793.
    Note: Il devrait y avoir un espace de laboratoire dédié mis en place pour la radioactivité particulière. En outre, il devrait y avoir un large blindage au plomb pour un stockage et une utilisation sécuritaires du ⁵¹Cr pendant toutes les étapes ainsi qu'une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons avec ⁵¹Cr sont conservés. Un compteur Geiger équipé d'une sonde à crêpes est également nécessaire, pour l'arpentage de l'espace pour une contamination possible.
14. Ajouter un petit morceau de ruban radioactif au tube pour indiquer que le tube est maintenant radioactif.
15. Placez le tube dans un incubateur à 37 oC avec un bouclier de plomb et incubez pendant 1 h. Faites glisser le tube toutes les 15-20 minutes pour augmenter l'apport cellulaire cible du chrome.
16. Après la période d'incubation, laver les cellules cibles avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
17. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min. Décant radioactif FBS laver dans un conteneur de déchets approprié.
18. Resuspendre la pastille et laver une deuxième fois avec FBS. Vérifiez la radioactivité incorporée à l'aide d'un compteur Geiger.
19. Resuspendre la pastille dans un milieu complet de 10 ml, ce qui lui a procuré une concentration cellulaire de 10⁵ cellules/ml.
    Note: L'étape de comptage cellulaire après l'étiquetage ⁵¹Cr est omise ici en grande partie pour des raisons de sécurité. On peut supposer que la concentration de cellules WM793 est la même qu'avant l'étiquetage ⁵¹Cr.

2. Préparation des cellules effectrices

1. Une variété de cellules effectrices peuvent être utilisées, telles que les lymphocytes T humains ou de souris et les cellules NK. Dans cet exemple, des PBMC, isolés du sang entier par centrifugation standard de gradient de densité (à une concentration de 5x10^6),ont été utilisés.
2. Pour commencer, ajoutez 100 l de milieu de culture tissulaire à chaque puits de l'une des rangées (ici rangée A, Voir tableau 1) d'une plaque à fond rond de 96 puits. Ici, aucune cellule effectrice n'est ajoutée, et elles serviront de « blanc » pour déterminer la « libération minimale/spontanée ^{de 51}Cr » des cellules cibles.

Tableau 1 : ⁵¹Cr release assay layout: Row A- Target cells (10⁴ cells/ 100 'L) incubated with media only (generates 'blank' for determining the "minimum/spontaneous ⁵¹Cr release"). Lignes B à C- puits contenant différents effecteurs : ratios de cellules cibles (E:T), allant de 50:1 à 1,5:1. Ligne H- cellules cibles (10⁴ cellules/100 l) incubées avec 1% NP-40 (NP-40 lyses les cellules cibles, générant "maximum ou total ⁵¹Cr libération"). Chaque rapport E:T est testé en triplicate pour chaque condition expérimentale. Colonne 1-3- PBMC non stimulés et colonne 4-6- CPG-stimulé PBMCs.

3. Ensuite, générer une dilution des cellules sérielles 2X des PBMC (en triple pour chaque condition expérimentale), pour obtenir une concentration de cellules effectrices allant de 5x10⁵ à 15 625 cellules/100 L de médias (ici les lignes B à G).
   Note: Dans cet exemple, l'effecteur de départ : le ratio de cellule cible (E : T) est de 50:1. Toutefois, ce ratio peut être ajusté en fonction des spécificités expérimentales.
4. Laissez la dernière rangée vide (ici la rangée H) en n'ajoutant aucune cellule effectrice à ces puits. (Cette ligne sera utilisée pour générer le « nombre total de comptes/min, ou (c. p. m) » ou le « communiqué maximum ⁵¹Cr »).
5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 oC jusqu'à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

3. Ajout de ⁵¹cellules cibles WM793 étiquetées Cr à l'Assay

1. Après la période d'incubation, retirer les cellules cibles de l'incubateur et laver avec 5 ml de FBS pour enlever tout excès ^{de 51}Cr.
2. Centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant 5 min, à l'aide d'une centrifugeuse désignée.
3. Retirez le lavage FBS (supernatant radioactif) dans un contenant de déchets approprié.
4. Répétez l'étape de lavage en rependant la pastille dans un frais de 5 ml de FBS.
5. Centrifuger les cellules à nouveau à 1200 tr/min pendant 5 min.
6. Enfin, resuspendre la pastille en 10 ml de milieu complet.
7. Verser la suspension cellulaire WM793 ⁵¹étiquetée Cr (10⁵ cellules/mL) dans un réservoir de réactif jetable.
8. Ensuite, ajoutez 100 L de ces cellules cibles étiquetées, à chaque puits de la plaque de cellules effectrice s'il y a 96 puits, à l'aide d'une pipette multicanal.
9. Ensuite, ajoutez 100 OL de 1 % De NP-40 (dans l'eau) à la rangée de puits dépourvus de toute cellule effectrice (ici rangée H). 1% NP-40 lysera les cellules cibles, et donc ces puits serviront de contrôles pour déterminer le "nombre total / min, ou (c. p. m)" ou le maximum ⁵¹Cr libération.
10. Fixez le couvercle à la plaque en ajoutant un petit morceau de ruban perméable au gaz de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu'il contient ⁵¹Cr.
11. En bref, centrifuger la plaque à 1200 tr/min. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajouter une plaque d'équilibre à la centrifugeuse.
    Note: Il est important d'utiliser une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs.
12. Retirer la plaque de la centrifugeuse.
13. Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC avec un petit morceau de plomb protégeant la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 h pour permettre la lyse cellulaire cible.
    Note: La période d'incubation peut varier de 4 à 18 h selon les cellules effectrices utilisées et le mécanisme potentiel de mise à mort utilisé.

4. Récolte des Supernatants

1. À la fin de la période d'incubation, retirer soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirer le couvercle.
2. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque, en veillant à confirmer que les petits disques de filtre sont en place pour chacun des bouchons de coton. Cela assurera la collecte d'un supernatant sans cellules.
3. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits.
4. Après environ 10 secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des lanières de tube.
5. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire.
6. Enfin, chargez les tubes FACS sur le compteur gamma et exécutez les échantillons pour quantifier la quantité de ⁵¹Cr libérées dans chaque condition. Les échantillons sont généralement mesurés pendant 1 minute, ce qui permet une détermination facile des « comptes/minute ».
7. Enregistrez soigneusement l'ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le comptoir.

5. Analyse des données

1. Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux trois premières colonnes, et des PBMC stimulés par le CpG (CpG ODN, (1 g/mL) pendant 24 h) ont été ajoutés aux colonnes 4-6. Voir tableau 2.

Tableau 2 : ⁵¹données d'analyse de sortie Cr : Valeurs de données 'comptes par minute' / 'c. p. m', valeurs moyennes c. p. m, et valeurs de lyse spécifiques pour cent calculées.

2. Les données recueillies (comptes par minute, c.-à-d. c.p.m) ont été saisies dans les cellules d'une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d'origine.
3. Tout d'abord, les moyennes des tripliciats ont été calculées. Tableau 2 - cellules I3 à P3, pour les PBMC non stimulés et les cellules I6 à P6, pour les PBMC stimulés par le CpG.
4. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition a été calculé à l'aide de la formule suivante-
   
   
5. Le pourcentage de lyse spécifique a été calculé pour chaque condition (tableau 2 - cellules J4 à O4, pour les PBMC non stimulés et J7 à O7, pour les PBMC non stimulés).

Dans cette vidéo, vous allez voir comment effectuer le test de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices.

Les cellules immunitaires sont responsables de l’identification et de l’élimination des cellules potentiellement nocives, comme le cancer ou les cellules infectées par un virus, du corps, qui font partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les cellules T et les cellules NK, possèdent une propriété connue sous le nom de potentiel cytotoxique, qui est la capacité d’identifier les cellules cibles et de sécréter des protéines qui induisent la dégradation, la lyse et la mort des protéines de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l’activation et la puissance des cellules immunitaires, et le test de libération de chrome est couramment utilisé à cette fin.

Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytotoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans différentes conditions, ce qui est précieux pour l’étude de l’immunothérapie du cancer et des maladies liées à l’immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est absorbé par les cellules. Ensuite, ces cellules radiomarquées sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d’intérêt, également appelées cellules effectrices, dans une plaque à fond rond à 96 puits pour faciliter l’interaction entre les deux types de cellules.

La configuration globale du test implique l’incubation d’un nombre spécifique de cellules cibles avec différentes concentrations de cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d’induire l’apoptose et la lyse dans les cellules cibles, ce qui entraîne la libération du chrome 51 intracellulaire dans le surnageant. Ensuite, à un moment pré-optimisé, le surnageant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, étant radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre un rayonnement gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les surnageants de tous les puits de la plaque d’essai représentent un résultat quantifiable de la lyse des cellules cibles. Celui-ci est mesuré à l’aide d’un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires.

Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire de mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées dans une suspension unicellulaire. Pour ce faire, retirez d’abord le milieu du flacon de culture tissulaire et lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décanter le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine dans la plaque pendant environ deux minutes. Tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules de la surface du ballon, puis ajoutez cinq millilitres de média RPMI dans le ballon. Pipetez le média de haut en bas pour recueillir les cellules et ajoutez cette suspension dans un tube conique de 15 millilitres.

Placez le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le média du tube en veillant à ne pas perturber la pastille de cellule. Effleurez doucement le bas du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajoutez 10 millilitres de média dans le tube. Ensuite, pipetez doucement le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d’origine dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placez le tube dans une centrifugeuse et granulez les cellules à 12 cents tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, versez l’excédent de fluide hors du tube dans un conteneur à déchets. Vortex brièvement le tube pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.

Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en vous déplaçant vers un espace de laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il doit y avoir un blindage en plomb suffisant pour le stockage et l’utilisation en toute sécurité du chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons contenant du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l’espace pour une éventuelle contamination.

Une fois configuré pour l’utilisation correcte de la radioactivité, ajoutez 100 microcuries de chrome 51 directement dans la suspension de cellules cibles. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban radioactif dans le tube pour indiquer que l’échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un bouclier en plomb et incubez pendant une heure, en retournant le tube toutes les 15 à 20 minutes.

Pendant que les cellules cibles sont marquées, préparez une suspension cellulaire unique de cellules effectrices. Dans cet exemple, les cellules mononucléées du sang périphérique humain, ou PDMC, ont été isolées du sang total par centrifugation à gradient de densité standard à une concentration de 5 fois 10 puissance 6. Transférez cette suspension de cellule effectrice dans un réservoir de réactif jetable, puis ajoutez 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de RPMI dans chaque puits des rangées C à G de la plaque.

Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC pour avoir une gamme de nombres de cellules effectrices en retirant d’abord 100 microlitres de cellules dans les puits de la rangée B et en l’ajoutant à la ligne C. Ensuite, diluez davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Continuez la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacez 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire dans les puits de la rangée A pour servir de contrôle contre la libération spontanée de chrome 51 à partir des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne doit être ajoutée à cette rangée. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

Après la période d’incubation, retirez les cellules cibles de l’incubateur et lavez-les avec 5 millilitres de FBS pour éliminer tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et tournez à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif FBS dans un conteneur à déchets approprié et répétez l’étape de lavage en remettant la pastille en suspension dans 5 millilitres de FBS frais. Placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à nouveau les cellules à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez que la pastille n’est pas contaminée à l’aide d’un compteur Geiger. Enfin, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu complet et versez la suspension de cellules cibles marquée au chrome 51 dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles marquées à chaque puits de la plaque cellulaire effectrice à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de NP-40 à 1 % dans l’eau dans les puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de chaque rangée. Ces puits seront utilisés comme contrôle pour déterminer le nombre total de comptages par minute, ou cpm.

Maintenant que la plaque est prête, fixez le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajoutez une plaque d’équilibrage à la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 1200 tr/min et mettez la plaque à la vitesse. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirez la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un petit morceau de blindage en plomb sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyser.

À la fin de la période d’incubation, retirez soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en vous assurant de confirmer que les petits disques filtrants sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après une dizaine de secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des bandes de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et analysez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Notez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le compteur.

Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des PMBC stimulés par des CPG ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptages par minute ont été saisis dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine et que les moyennes des triplets ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, la moyenne des cellules A1, A2 et A3 a été calculée dans la cellule I3. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l’aide de cette formule. Par exemple, pour calculer le pourcentage de lyse spécifique pour les cellules non stimulées qui avaient un rapport de 50 à 1 cellules effectrices par rapport aux cellules cibles, le CPM spontané, qui dans cet exemple, est 1164,67, a été soustrait du CPM expérimental, 1129. 67. Ce nombre peut ensuite être divisé par la différence entre le CPM maximum et le CPM spontané, puis multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage de lyse spécifique. Celle-ci est ensuite calculée pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être représentées graphiquement pour montrer la comparaison du rapport E/T avec le pourcentage de lyse spécifique pour les PBMC non stimulés et les PBMC stimulés par CPG. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec CPG ont tué plus efficacement les cellules cibles à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation CPG est nécessaire pour l’augmentation observée de la lyse des cellules cibles.