Test de mort cellulaire : libération du chromium pour mesurer la cytotoxicité

Dans cette vidéo, vous allez voir comment effectuer le test de libération de chrome et déterminer le potentiel cytotoxique des cellules effectrices.

Les cellules immunitaires sont responsables de l’identification et de l’élimination des cellules potentiellement nocives, comme le cancer ou les cellules infectées par un virus, du corps, qui font partie intégrante de la réponse immunitaire. Plusieurs cellules immunitaires, comme les cellules T et les cellules NK, possèdent une propriété connue sous le nom de potentiel cytotoxique, qui est la capacité d’identifier les cellules cibles et de sécréter des protéines qui induisent la dégradation, la lyse et la mort des protéines de ces cellules cibles. La quantification du potentiel cytotoxique est essentielle pour mesurer l’activation et la puissance des cellules immunitaires, et le test de libération de chrome est couramment utilisé à cette fin.

Cette méthode permet aux utilisateurs de comparer la cytotoxicité induite par des types spécifiques de cellules immunitaires dans différentes conditions, ce qui est précieux pour l’étude de l’immunothérapie du cancer et des maladies liées à l’immunité. Pour commencer, les cellules cibles, comme les cellules cancéreuses, sont incubées avec un isotope radioactif, le chrome 51, qui est absorbé par les cellules. Ensuite, ces cellules radiomarquées sont co-cultivées avec les cellules immunitaires isolées d’intérêt, également appelées cellules effectrices, dans une plaque à fond rond à 96 puits pour faciliter l’interaction entre les deux types de cellules.

La configuration globale du test implique l’incubation d’un nombre spécifique de cellules cibles avec différentes concentrations de cellules immunitaires, ainsi que des contrôles appropriés. La co-culture permet aux cellules effectrices d’induire l’apoptose et la lyse dans les cellules cibles, ce qui entraîne la libération du chrome 51 intracellulaire dans le surnageant. Ensuite, à un moment pré-optimisé, le surnageant contenant le chrome libéré est récolté dans tous les puits. Le chrome 51, étant radioactif, subit spontanément une désintégration radioactive pour émettre un rayonnement gamma. Les niveaux de rayonnement gamma dans les surnageants de tous les puits de la plaque d’essai représentent un résultat quantifiable de la lyse des cellules cibles. Celui-ci est mesuré à l’aide d’un compteur gamma, qui est ensuite utilisé pour déterminer le potentiel cytotoxique des cellules immunitaires.

Pour commencer, les cellules cibles, la lignée cellulaire de mélanome humain WM793 dans cet exemple, sont préparées dans une suspension unicellulaire. Pour ce faire, retirez d’abord le milieu du flacon de culture tissulaire et lavez les cellules avec cinq millilitres de 1X PBS. Décanter le PBS, puis ajouter un millilitre de trypsine dans la plaque pendant environ deux minutes. Tapotez doucement le ballon pour détacher les cellules de la surface du ballon, puis ajoutez cinq millilitres de média RPMI dans le ballon. Pipetez le média de haut en bas pour recueillir les cellules et ajoutez cette suspension dans un tube conique de 15 millilitres.

Placez le tube dans la centrifugeuse pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Ensuite, retirez le média du tube en veillant à ne pas perturber la pastille de cellule. Effleurez doucement le bas du tube pour perturber la pastille cellulaire et ajoutez 10 millilitres de média dans le tube. Ensuite, pipetez doucement le média de haut en bas pour mettre les cellules en suspension. Ensuite, déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et transférez deux millilitres de la suspension cellulaire d’origine dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Placez le tube dans une centrifugeuse et granulez les cellules à 12 cents tr/min pendant cinq minutes. Après la centrifugation, versez l’excédent de fluide hors du tube dans un conteneur à déchets. Vortex brièvement le tube pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans le petit volume de milieu laissé derrière.

Ensuite, préparez-vous à utiliser le chrome 51 en vous déplaçant vers un espace de laboratoire dédié à cette radioactivité particulière. Il doit y avoir un blindage en plomb suffisant pour le stockage et l’utilisation en toute sécurité du chrome 51 pendant toutes les étapes, ainsi qu’une signalisation appropriée pour indiquer où les échantillons contenant du chrome 51 sont conservés. Un compteur Geiger équipé d’une sonde à crêpes est également nécessaire pour servir dans l’espace pour une éventuelle contamination.

Une fois configuré pour l’utilisation correcte de la radioactivité, ajoutez 100 microcuries de chrome 51 directement dans la suspension de cellules cibles. Ensuite, ajoutez un petit morceau de ruban radioactif dans le tube pour indiquer que l’échantillon et le tube sont maintenant radioactifs. Placez le tube dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un bouclier en plomb et incubez pendant une heure, en retournant le tube toutes les 15 à 20 minutes.

Pendant que les cellules cibles sont marquées, préparez une suspension cellulaire unique de cellules effectrices. Dans cet exemple, les cellules mononucléées du sang périphérique humain, ou PDMC, ont été isolées du sang total par centrifugation à gradient de densité standard à une concentration de 5 fois 10 puissance 6. Transférez cette suspension de cellule effectrice dans un réservoir de réactif jetable, puis ajoutez 200 microlitres de cette suspension dans chaque puits de la rangée B dans une plaque à fond rond de 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de RPMI dans chaque puits des rangées C à G de la plaque.

Maintenant, commencez à effectuer des dilutions en série des PBMC pour avoir une gamme de nombres de cellules effectrices en retirant d’abord 100 microlitres de cellules dans les puits de la rangée B et en l’ajoutant à la ligne C. Ensuite, diluez davantage les cellules effectrices en transférant 100 microlitres de cellules de la rangée C à la rangée D. Continuez la dilution en série. Une fois la rangée G atteinte, déplacez 100 microlitres des puits pour laisser un volume final de 100 microlitres dans chaque puits de cette rangée. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture tissulaire dans les puits de la rangée A pour servir de contrôle contre la libération spontanée de chrome 51 à partir des cellules cibles, car aucune cellule effectrice ne doit être ajoutée à cette rangée. Ensuite, placez une plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules cibles soient prêtes à être ajoutées.

Après la période d’incubation, retirez les cellules cibles de l’incubateur et lavez-les avec 5 millilitres de FBS pour éliminer tout excès de chrome 51. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse désignée et tournez à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le lavage radioactif FBS dans un conteneur à déchets approprié et répétez l’étape de lavage en remettant la pastille en suspension dans 5 millilitres de FBS frais. Placez le tube dans une centrifugeuse désignée et faites tourner à nouveau les cellules à 1200 tr/min pendant 5 minutes. Retirez le deuxième lavage et vérifiez que la pastille n’est pas contaminée à l’aide d’un compteur Geiger. Enfin, remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de milieu complet et versez la suspension de cellules cibles marquée au chrome 51 dans un réservoir de réactif jetable. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de ces cellules cibles marquées à chaque puits de la plaque cellulaire effectrice à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de NP-40 à 1 % dans l’eau dans les puits de la rangée H pour lyser toutes les cellules cibles de chaque rangée. Ces puits seront utilisés comme contrôle pour déterminer le nombre total de comptages par minute, ou cpm.

Maintenant que la plaque est prête, fixez le couvercle en ajoutant un petit morceau de ruban adhésif de chaque côté de la plaque et placez un morceau de ruban radioactif sur le couvercle pour indiquer qu’il contient du chrome 51. Ensuite, placez la plaque dans une centrifugeuse marquée pour manipuler des échantillons radioactifs. Si une seule plaque expérimentale est utilisée, ajoutez une plaque d’équilibrage à la centrifugeuse. Réglez la centrifugeuse à 1200 tr/min et mettez la plaque à la vitesse. Une fois à la vitesse, arrêtez la machine. Retirez la plaque de la centrifugeuse. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec un petit morceau de blindage en plomb sur la plaque pour plus de sécurité. Incuber pendant 16 heures pour permettre aux cellules cibles de lyser.

À la fin de la période d’incubation, retirez soigneusement le ruban adhésif autour du bord de la plaque et retirez le couvercle. Ensuite, placez le cadre de récolte sur la plaque en vous assurant de confirmer que les petits disques filtrants sont en place pour chacun des bouchons de coton. Maintenant, appuyez lentement et doucement sur les bouchons de coton dans les puits. Après une dizaine de secondes, relâchez la pression sur les bouchons de coton, puis transférez les bouchons de coton sur des bandes de tube. Placez chacun de ces tubes dans un tube FACS secondaire. Enfin, chargez les tubes FACS sur un compteur gamma et analysez les échantillons pour quantifier la quantité de chrome 51 libérée dans chaque condition. Notez soigneusement l’ordre dans lequel les tubes ont été chargés dans le compteur.

Ici, des PBMC non stimulés ont été ajoutés aux 3 premières voies et des PMBC stimulés par des CPG ont été ajoutés aux voies 4 à 6. Dans cet exemple, les comptages par minute ont été saisis dans les cellules d’une feuille de calcul de la même manière que les échantillons ont été disposés dans la plaque d’origine et que les moyennes des triplets ont été calculées. Par exemple, pour la première condition, la moyenne des cellules A1, A2 et A3 a été calculée dans la cellule I3. Une fois les moyennes déterminées, le pourcentage de lyse spécifique pour chaque condition peut être calculé à l’aide de cette formule. Par exemple, pour calculer le pourcentage de lyse spécifique pour les cellules non stimulées qui avaient un rapport de 50 à 1 cellules effectrices par rapport aux cellules cibles, le CPM spontané, qui dans cet exemple, est 1164,67, a été soustrait du CPM expérimental, 1129. 67. Ce nombre peut ensuite être divisé par la différence entre le CPM maximum et le CPM spontané, puis multiplié par 100 pour obtenir le pourcentage de lyse spécifique. Celle-ci est ensuite calculée pour chaque condition. Ces données peuvent ensuite être représentées graphiquement pour montrer la comparaison du rapport E/T avec le pourcentage de lyse spécifique pour les PBMC non stimulés et les PBMC stimulés par CPG. Dans cet exemple, les cellules effectrices stimulées avec CPG ont tué plus efficacement les cellules cibles à mesure que le rapport entre les cellules effectrices et les cellules cibles augmentait. Cette augmentation n’a pas été observée dans les PBMC non stimulés, ce qui indique que la stimulation CPG est nécessaire pour l’augmentation observée de la lyse des cellules cibles.