1. Mise en place
2. Préparation des médias
3. Préparation diluante
4. Cultivation de l'organisme cible
5. Dilution en série
6. Spread Plating
7. Streaking
8. Analyse des données et résultats
Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, et Christopher P. Corbo1
1 Département des sciences biologiques, Wagner College, 1 Campus Road, Staten I…
1. Mise en place
2. Préparation des médias
3. Préparation diluante
4. Cultivation de l'organisme cible
5. Dilution en série
6. Spread Plating
7. Streaking
8. Analyse des données et résultats
Parfois, pour identifier et étudier les bactéries, nous devons d’abord les isoler et les enrichir à partir d’un échantillon. Par exemple, les échantillons obtenus à partir d’une colonne de Winogradsky sont mélangés, ce qui signifie qu’ils contiennent plusieurs espèces ou souches de bactéries, de sorte qu’il peut être difficile d’étudier une bactérie individuelle ou d’énumérer les différents types présents. À cette fin, des techniques de dilution et de placage en série sont généralement utilisées pour quantifier de manière fiable la charge bactérienne et isoler les colonies individuelles.
La dilution en série est un processus par lequel la concentration d’un organisme, une bactérie dans cet exemple, est systématiquement réduite par des remises en suspension successives dans des volumes fixes de diluant liquide. Habituellement, le volume du diluant est un multiple de 10 pour faciliter la réduction logarithmique de l’organisme de l’échantillon. Par exemple, un gramme de sédiment est d’abord retiré de la zone d’intérêt Winogradsky et ajouté à 10 millilitres d’un milieu liquide approprié. Ensuite, un millilitre de cette première dilution est ajouté à un autre tube contenant neuf millilitres de fluide. Le processus peut être répété jusqu’à ce que plusieurs concentrations différentes de bactéries aient été préparées. La dilution en série est la clé du dénombrement des bactéries dans cet exemple, car les échantillons mixtes d’une colonne de Winogradsky contiennent un nombre inconnu, souvent important, de bactéries.
Ensuite, le placage strié et le placage étalé permettent respectivement l’isolement et le dénombrement des bactéries dans un échantillon. Le striage est accompli en introduisant un échantillon dilué dans une section du milieu solide complété par des nutriments, qui est divisé en tiers. Cet inoculum est ensuite étalé sur chaque tiers de la plaque en zigzag. Au fur et à mesure que différentes sections de la plaque sont striées, ne se croisant qu’une seule fois à partir de l’échantillon précédent, l’échantillon est étalé plus finement. Cela signifie que vous n’aurez peut-être besoin de faire des stries qu’à partir d’une seule dilution pour obtenir des colonies individuelles dans les sections ultérieures. Après l’incubation, les plaques striées permettent d’observer la morphologie de la colonie, des informations qui peuvent aider à différencier les différentes espèces bactériennes.
Alternativement, si l’objectif principal est le dénombrement des bactéries dans l’épandage de l’échantillon, un placage peut être utilisé. Dans le placage par étalement, une aliquote d’un seul échantillon est répartie uniformément sur toute la surface du milieu solide. En règle générale, comme nous ne connaissons pas le nombre de bactéries dans l’échantillon mélangé, une plaque d’épandage est fabriquée pour chacune des dilutions ou un échantillon représentatif de celles-ci. Après l’incubation, le dénombrement peut être effectué à l’aide de ces plaques étalées. Toutes les plaques dont le nombre de colonies est inférieur à 30 doivent être jetées, car les petits nombres sont sujets à une plus grande erreur. De même, tout dénombrement supérieur à 300 doit être écarté, car l’encombrement et le chevauchement des colonies peuvent entraîner une sous-estimation du nombre de colonies. Si le nombre de colonies de chacune de ces boîtes restantes est enregistré et multiplié par le facteur de dilution, puis divisé par le volume plaqué, on obtient les unités formant colonies, ou UFC, par millilitre de suspension. Dans cette vidéo, vous apprendrez à évaluer qualitativement et quantitativement un échantillon contenant une bactérie connue et les communautés microbiennes contenues dans diverses régions d’une colonne de Winogradsky par dilution en série, placage étalé et placage de stries.
Tout d’abord, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 % et essuyez la surface. Ensuite, rassemblez deux fioles Erlenmeyer de 500 millilitres et étiquetez un bouillon et l’autre agar-agar. Pour préparer une solution de gélose LB, mélangez environ 6,25 grammes de gélose LB, trois grammes de gélose technique et 250 millilitres d’eau distillée dans le flacon étiqueté agar-agar.
Ensuite, préparez le bouillon LB en mélangeant 2. 5 grammes de milieu LB et 100 millilitres d’eau distillée dans le bouillon étiqueté du ballon. Après avoir autoclavé les flacons, utilisez un gant résistant à la chaleur pour retirer les flacons de l’autoclave et placez-les dans un bain-marie à 40 à 50 degrés Celsius. Une fois que les flacons sont à 50 degrés Celsius, préparez soigneusement trois aliquotes de 100 millilitres de la solution de bouillon et étiquetez chaque solution aliquote zéro. Ensuite, rassemblez 10 boîtes de Pétri stériles et étiquetez-les avec la date, le nom, le type de milieu utilisé et la zone de la colonne Winogradsky dans laquelle les organismes seront récoltés. Pipeter 15 millilitres de gélose de la fiole d’agar dans chaque boîte de Pétri. Ensuite, utilisez la pointe de la pipette pour éliminer les bulles, replacez les couvercles des plaques et laissez-les se solidifier sur la paillasse pendant la nuit.
Le lendemain, essuyez le plan de travail avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, étiquetez 10 tubes à essai de 20 millilitres T1 à T10 et placez-les dans un support. Pipetez neuf millilitres de solution saline à 0,45 % dans chaque tube. Maintenant, couvrez chacun des 10 tubes à essai sans serrer avec leurs capuchons et transférez-les dans un support de tube à essai compatible avec l’autoclave. Une fois le cycle terminé, retirez les flans de solution saline à l’aide de gants résistants à la chaleur et laissez-les refroidir. Conservez les tubes à température ambiante jusqu’à ce qu’ils aient atteint environ 22 degrés Celsius.
Pour cultiver un organisme cible connu, E. coli dans cet exemple, inoculez 100 millilitres de solution zéro avec une seule colonie à partir d’une plaque préalablement striée. Ensuite, couvrez le tube et incubez-le pendant une nuit à 37 degrés Celsius. Pour évaluer les régions d’une colonne de Winogradsky, ajoutez environ un gramme de matériau de la zone aérobie à T1 et remettez en suspension par vortex. Ensuite, répétez ce processus avec un gramme de matériau de la zone anaérobie.
Retirez le tube contenant la solution zéro inoculée avec E. coli de l’incubateur et secouez-le. Ensuite, pipetez un millilitre de la solution dans un tube à essai T1 et vortex pour mélanger. Retirez un millilitre de solution de T1 et transférez-le dans T2, en tourbillonnant pour mélanger. Répétez ce processus à travers le tube T10. Pour évaluer les zones aérobie et anaérobie de la colonne de Winogradsky, prélevez un millilitre de solution de chacun des tubes T1 préalablement préparés et transférez-le dans les tubes T2 appropriés. Ensuite, continuez les dilutions en série à travers les tubes T10 comme démontré précédemment.
Pour étaler la plaque, pipetez 100 microlitres de l’échantillon dilué de chaque tube T3 dans la boîte de Pétri correspondante. Ensuite, à l’aide d’une tige d’épandage stérile, répartissez délicatement l’échantillon sur la boîte de Pétri et replacez le couvercle de la plaque. Répétez ce processus pour les dilutions T6 et T9, comme démontré précédemment. Incuber les plaques contenant des organismes aérobies dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Incuber les plaques contenant des organismes anaérobies dans une chambre anaérobie réglée à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Le lendemain, retirez les plaques de dilution T3, T6 et T9 de l’incubateur et de la chambre anaérobie et transférez-les sur la paillasse. En travaillant avec une plaque à la fois, faites glisser une boucle d’inoculation stérile sur le dessus du milieu en zigzag. Ensuite, remettez le couvercle de la boîte de Pétri. Ensuite, faites pivoter la plaque de 1/3 et stérilisez la boucle pour réduire la fréquence du motif en zigzag précédemment fait. Encore une fois, après avoir stérilisé la boucle, tournez la plaque de 1/3, réduisez une dernière fois la fréquence du motif en zigzag et replacez le couvercle. Répétez cette méthode de stries pour les plaques restantes, comme indiqué précédemment. Ensuite, placez les plaques striées contenant des organismes aérobies dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit et les plaques striées contenant des organismes anaérobies dans une chambre anaérobie réglée à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Les cultures ont été récoltées dans les zones aérobies et anaérobies d’une colonne Winogradsky de sept jours. Ensuite, les cultures ont été diluées en série avant d’être stries et étalées sur des plaques de gélose LB. Les traînées ont révélé une population mixte de chacune des zones Winogradsky évaluées, et les plaques étalées ont produit des résultats similaires. Une plaque striée à partir d’une population mixte donnera lieu à des colonies bactériennes de formes, de tailles, de textures et de couleurs différentes. En revanche, les plaques striées et étalées contenant l’organisme connu, E. coli, ont montré une population homologue. En général, il est préférable de calculer les UFC par millilitre en utilisant le nombre moyen de colonies de trois plaques réparties avec le même échantillon et le même facteur de dilution. Multipliez le nombre moyen de colonies par le facteur de dilution et divisez par la quantité aliquote. Enfin, des colonies isolées choisies dans chaque plaque peuvent être utilisées dans d’autres essais d’enrichissement pour déterminer l’identité de l’espèce.
Q1: What is serial dilution and why is it used in microbiology?
Serial dilution is a systematic reduction of bacterial concentration through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent, typically in multiples of 10 for logarithmic reduction. It enables microbiologists to obtain manageable concentrations of organisms from samples containing unknown, often large numbers of bacteria, making enumeration and isolation feasible.
Q2: How does streak plating differ from spread plating?
Streak plating introduces a diluted sample to solid medium in a zig-zag pattern across thirds of the plate, progressively thinning the sample to isolate individual colonies and observe colony morphology. Spread plating distributes an aliquot evenly across the entire plate surface for quantitative enumeration rather than isolation.
Q3: What colony counts are considered valid for CFU calculation?
Plates with fewer than 30 colonies are discarded as too few to count due to greater statistical error. Plates with more than 300 colonies are discarded as too numerous to count because crowding and overlapping lead to underestimation. Valid counts fall between 30 and 300 colonies.
Q4: How do you calculate colony forming units per milliliter?
Average the colony count from three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average by the dilution factor and divide by the volume plated. This yields CFU/mL, which can be used to generate growth curves using colony forming units and optical density measurements for further analysis.
Q5: Why are Winogradsky Column samples suitable for serial dilution and plating?
Winogradsky Column samples contain mixed populations with multiple bacterial species and strains at unknown concentrations. Serial dilution and plating techniques allow researchers to isolate individual colonies, observe different morphologies, and quantify the diverse microbial communities present in aerobic and anaerobic zones.
Q6: What information can colony morphology reveal about bacterial populations?
Colony morphology—including shape, size, texture, and color—helps differentiate between bacterial species and strains. A homologous population of a single organism produces uniform colonies, while a mixed population displays colonies with varied characteristics, indicating the presence of different bacterial species or strains in the sample.
Q7: What is the significance of using 0.45% saline as a diluent in serial dilution?
Saline blanks serve as the standardized liquid diluent for successive resuspension steps in serial dilution. The 0.45% saline composition maintains osmotic balance and provides a consistent medium for diluting bacterial samples while preserving cell viability and enabling accurate enumeration and isolation of microorganisms.
Videos from this collection: