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Les bactéries sont capables d’habiter presque tous les environnements sur Terre, de la toundra désertique aux forêts tropicales humides. Cette capacité à coloniser des niches très différentes est due à leur adaptabilité et à leur grande diversité métabolique, ce qui leur permet d’utiliser une grande variété de molécules pour la production d’énergie. C’est cette grande diversité qui conduit au phénomène selon lequel moins de 1 % des espèces bactériennes de la planète sont considérées comme cultivables et que cela n’est possible que grâce à une compréhension de leurs besoins métaboliques et environnementaux spécifiques.
Effectuer des manipulations des milieux et de l’environnement en laboratoire permet non seulement aux chercheurs d’expérimenter pour trouver les conditions optimales pour la culture d’une espèce d’intérêt, mais aussi de permettre l’enrichissement, le processus de modification des conditions pour sélectionner des espèces spécifiques à partir d’une culture mixte. Certaines espèces microbiennes sont généralistes et capables de tolérer une grande variété d’états ou d’environnements. De tels organismes peuvent se développer facilement dans des conditions de laboratoire, mais ils peuvent également être empêchés de croître si on leur donne un habitat extrême - ce qui peut aider si l’objectif est d’enrichir pour les organismes d’une culture mixte qui sont tolérants à cette condition.
Les organismes exigeants peuvent être cultivés, mais seulement lorsque des conditions spécifiques sont remplies. Les espèces Neisseria ou Haemophilus, par exemple, nécessitent des milieux contenant des globules rouges partiellement décomposés et une concentration élevée de dioxyde de carbone, ce qui peut également décourager la croissance d’autres espèces. Les extrêmophiles sont nommés ainsi en raison de leur préférence pour les conditions extrêmes, telles que les températures très basses ou élevées, les conditions réduites ou l’absence d’oxygène, ou en présence d’une forte teneur en sel. Ces conditions sont probablement intolérables pour la plupart des autres microbes.
Pour enrichir davantage un organisme d’intérêt, certains types de milieux contiennent des indicateurs qui donnent un aperçu du métabolisme de l’organisme. L’agar-gélose au sel de mannitol inhibe la croissance des organismes sensibles à la teneur élevée en sel. Les bactéries à Gram négatif ne peuvent généralement pas survivre, mais le genre Staphylococcus à Gram positif est capable de prospérer. De plus, la gélose MSA indique toutes les colonies capables de fermenter le mannitol, car les sous-produits acides de la fermentation transformeront l’indicateur rouge méthyle dans le milieu en un jaune vif. Cela peut permettre une sélection plus spécifique d’une espèce.
Un autre moyen d’enrichissement courant, le bleu de méthylène éosine, contient des colorants éosine et bleu de méthylène, qui sont toxiques pour les organismes à Gram positif. Il contient également du lactose et des bactéries sur ces plaques qui peuvent fermenter, ce qui produira des acides qui abaissent le pH, favorisant l’absorption des colorants. Ces colonies absorbent de grandes quantités de pigments et apparaissent sombres et métalliques. Dans ce laboratoire, vous allez cultiver quatre organismes d’essai différents dans trois conditions de milieux différents, puis dans des conditions aérobies ou anaérobies avant d’observer leur développement.
Avant de commencer l’expérience, lavez-vous soigneusement les mains et séchez-les, avant de mettre des gants de laboratoire de taille appropriée. Ensuite, stérilisez la surface de travail avec 5 % d’eau de Javel, en l’essuyant soigneusement. Ensuite, prenez une anse d’inoculation stérile et placez-la dans une fiole vide de 125 millilitres afin qu’elle ne touche pas la surface de la paillasse. Ensuite, du réfrigérateur, rassemblez quatre assiettes de gélose au sel de mannitol, ou MSA, quatre plaques de gélose au bleu de méthylène éosine, EMB et huit plaques de gélose tryptique de soja, ou TSA. Le milieu TSA est un milieu de croissance non sélectif qui sera utilisé pour les deux conditions environnementales différentes. Enfin, rassemblez vos cultures d’intérêt dans un support de tubes. Ici, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis et Proteus vulgaris seront cultivés.
Pour commencer, allumez un bec Bunsen, qui sera utilisé pour stériliser les outils. Ensuite, placez une plaque MSA, une plaque EMB et deux plaques TSA à portée de main. Ensuite, sélectionnez l’une des cultures bactériennes. Vous inoculerez ces quatre plaques avec la première culture. Avec votre main libre, prenez la boucle d’inoculation, puis stérilisez-la dans la flamme du brûleur jusqu’à ce qu’elle brille en orange pendant quelques secondes. Laissez la boucle refroidir dans l’air. Ensuite, ouvrez le tube de culture de bouillon et allumez rapidement l’ouverture à la flamme. Trempez la boucle dans la culture, puis striez l’organisme sur le premier quadrant de la première plaque. Ensuite, stérilisez à nouveau la boucle à la flamme et striez le deuxième quadrant. Répétez cette action de stérilisation à la flamme, puis de stries pour compléter les troisième et quatrième quadrants. Les stries de cette manière devraient donner des colonies isolées et permettre également de confirmer que la culture n’est pas contaminée.
Maintenant, remettez le couvercle et étiquetez le fond de l’assiette avec le nom de la bactérie, le type de support, la date et vos initiales. Ensuite, répétez le placage en utilisant la même culture bactérienne pour chacune des trois plaques restantes en prenant soin de les étiqueter à chaque fois. Maintenant que la première culture a été striée, répétez ces étapes pour les autres bactéries afin d’obtenir une plaque MSA inoculée, une plaque EMB et deux plaques TSA pour chaque espèce. Une fois que tous les organismes ont été transférés, allumez la boucle une dernière fois.
Pour déterminer quels organismes peuvent se développer dans un environnement à oxygène réduit, ouvrez un système de chambre à gaz scellé et placez un ensemble de quatre plaques antibactériennes TSA à l’intérieur. Ensuite, placez un sachet d’état anaérobie dans la chambre et fermez-le hermétiquement. Enfin, placez toutes les plaques, y compris celles à l’intérieur du système de chambre à gaz scellé, dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. À l’avenir, vérifiez les plaques toutes les 24 à 48 heures pour donner aux colonies le temps de croître et de métaboliser tous les réactifs indicateurs.
Pour évaluer la façon dont les différentes espèces bactériennes ont réagi à chaque condition de croissance, examinez d’abord la croissance des plaques et enregistrez quelles espèces ont été capables de produire des colonies sur chaque type de milieu et dans des conditions anaérobies ou aérobies. Notez la couleur des organismes en croissance ainsi que la taille et la forme des colonies.
Le milieu de gélose au sel mannitol est sélectif pour les organismes à Gram positif qui sont capables de survivre dans 6. Chlorure de sodium à 5 %. Dans cette expérience, cela signifie que les E. coli et P. vulgaris à Gram négatif ne se sont pas développés en raison des fortes concentrations de sel. S. epidermis et S. aureus ont cependant pu se développer, confirmant qu’ils sont à Gram positif. De plus, il existe une nette différence entre les deux espèces car le S. aureus est capable de fermenter le mannitol en transformant l’indicateur rouge de méthyle dans le milieu en un jaune vif en raison des sous-produits acides de la fermentation. Cela n’a pas été observé dans le cas de S. epidermis.
Le milieu EMB, en revanche, est sélectif pour les organismes à Gram négatif, car les colorants éosine et bleu de méthylène sont toxiques pour les cellules à Gram positif. La membrane externe des bactéries à Gram négatif empêche ces colorants toxiques de pénétrer dans les cellules, ce qui signifie qu’elles sont capables de se développer. De plus, ce milieu indique si les espèces bactériennes présentes sont capables de fermenter le lactose. Ici, les colonies d’E. coli prennent une couleur violet foncé, parfois avec un éclat métallique vert indiquant la fermentation. P. vulgaris pousse sur ce milieu mais ne fermente pas le lactose et apparaît donc d’un rose pâle à violet en présence du colorant. Dans l’état anaérobie, les espèces bactériennes sur les milieux TSA devraient encore se développer, mais peuvent le faire très mal par rapport à celles qui ont beaucoup d’oxygène. En effet, aucune des espèces testées n’est un anaérobie obligatoire.
Des expériences comme celle-ci pour enrichir l’environnement de croissance peuvent aider à favoriser et à isoler une espèce spécifique à partir d’un échantillon mixte. Ils peuvent également aider à déterminer les conditions de croissance optimales pour différentes espèces bactériennes en laboratoire, contribuant ainsi à la poursuite des recherches.