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Sur une boîte de Pétri, si une seule bactérie subit plusieurs cycles de reproduction asexuée, cela conduira à la formation d’une colonie clonale. Cependant, il peut être difficile d’obtenir une seule bactérie à partir d’un échantillon mixte, comme une suspension de sol. Si l’on prend une boucle de cette culture hétérogène, elle peut contenir jusqu’à un billion de bactéries individuelles. Pour répandre autant de bactéries à la surface d’une plaque de gélose et obtenir une seule colonie, même en utilisant un motif en zigzag, la boucle devrait être traînée en continu sur la surface d’un nombre suffisant de plaques placées côte à côte pour encercler l’ensemble de Liberty Island. De toute évidence, les scientifiques n’utilisent pas vraiment autant de plaques. Au lieu de cela, ils utilisent une technique appelée placage de stries.
La technique de la plaque striée est basée sur la dilution progressive d’un échantillon bactérien, et elle est réalisée sur la surface solide d’une seule boîte de Pétri. Pour commencer, la surface du support est visuellement divisée en cinq sections en attribuant quatre fragments de la circonférence comme les quatre premières sections, et le centre de la plaque comme cinquième. Cela permettra de créer cinq plaques de support à partir d’une seule boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide d’une boucle de l’inoculum souhaité, la première section est striée à l’aide d’un motif en zigzag. Ensuite, soit une nouvelle boucle jetable est utilisée, soit dans le cas d’une boucle de fil, elle est stérilisée avec un bec Bunsen, en la flamboyant jusqu’à ce qu’elle soit chauffée au rouge sur toute la longueur du fil. L’utilisation d’une nouvelle boucle, ou boucle de stérilisation à la flamme, élimine toutes les cellules bactériennes restantes, aidant à la dilution des bactéries. La boucle chaude est ensuite refroidie à l’air pendant quelques secondes avant d’être traînée à travers la première section pour créer trois à quatre lignes distinctes, chacune ne transportant qu’une fraction de bactéries dans la deuxième section. Les sections restantes sont stries de la même manière, à l’aide d’une boucle stérile à chaque fois, et d’un seul passage à travers la traînée précédente.
À l’aide de ce cycle de stries et de stérilisation, la concentration bactérienne dans chaque section suivante doit être diluée de sorte que la section finale ne contienne que quelques bactéries discrètement localisées. Lors de l’incubation, ces bactéries discrètes se multiplient pour produire des colonies clonales isolées de cellules filles, appelées unités formant colonies, ou UFC. Ceux-ci peuvent être récoltés et retracés pour s’assurer que les travaux ultérieurs ne concernent qu’un seul type de bactérie, appelé culture pure. En plus d’isoler des colonies uniques à partir d’une culture bactérienne mixte, la technique de placage de stries est également utilisée pour sélectionner des souches spécifiques à un milieu, déterminer la morphologie des colonies bactériennes ou identifier différentes espèces bactériennes. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment isoler des colonies bactériennes uniques à partir d’une suspension d’échantillon bactérien mixte via la technique de placage de stries.
Pour commencer, enfilez des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, sélectionnez un milieu approprié qui soutiendra l’espèce ou la souche bactérienne utilisée et commencez à préparer le milieu. Ici, la gélose LB ordinaire est préparée en pesant dix grammes de milieu préformulé en poudre et 7,5 grammes de gélose. Ajoutez les composants pesés et séchés dans une bouteille en verre capable de contenir deux fois le volume final pour éviter les débordements. Ensuite, ajoutez 500 millilitres d’eau dans la bouteille et bouchonnez-la semi-hermétiquement. Stérilisez le milieu en plaçant le flacon dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant vingt minutes. Une fois terminé, utilisez des gants résistants à la chaleur ou un tampon chauffant pour retirer le support de la machine, puis tournez immédiatement le bouchon de la bouteille pour le fermer hermétiquement.
Pour une utilisation le jour même, laissez refroidir le média en plaçant la bouteille dans un bain-marie chauffé à environ 45 degrés Celsius, afin de préserver le média à l’état liquide. Alternativement, le support peut être laissé à température ambiante pour être stocké à l’état solide. Si nécessaire, passez la bouteille au micro-ondes avec le couvercle légèrement ouvert pour faire fondre le média, et laissez le média refroidir à l’aide d’un bain-marie à 45 degrés Celsius.
Ensuite, prenez un manchon de boîtes de Pétri stériles et, à l’aide d’un marqueur permanent, étiquetez-les avec les noms de l’investigateur et du support ainsi que la date. Ensuite, transférez le volume requis de milieu dans un récipient stérile et ajoutez des antibiotiques ou d’autres composants sensibles si nécessaire. Ici, 50 millilitres de média sont mélangés à 100 microlitres de Kanamycine pour une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Faites tourner le tube pour assurer une répartition uniforme des composants ajoutés dans tout le support. Lentement, afin d’éviter la formation de bulles, versez 20 à 25 millilitres de milieu de culture à environ 45 degrés Celsius dans chacune des plaques. Si des bulles ou de la mousse apparaissent, retirez rapidement à l’aide d’une pipette ordinaire et d’un embout stérile. Ensuite, remplacez immédiatement tous les couvercles pour éviter toute contamination. Laissez la gélose se solidifier à température ambiante pendant au moins deux heures ou toute la nuit. Une fois solidifiées, stockez les plaques de culture à l’envers à quatre degrés Celsius pour minimiser la condensation à la surface du milieu.
Pour strier la culture de votre choix, prenez d’abord une plaque de culture propre et retirez le couvercle. En travaillant rapidement, immergez une boucle stérile jetable dans l’inoculum souhaité, puis écouvillonnez immédiatement la boucle sur le premier quadrant de la plaque en utilisant un mouvement en zigzag. Replacez le couvercle de la boîte, jetez la boucle d’inoculation utilisée, puis sélectionnez une nouvelle boucle stérile. À l’aide de la nouvelle boucle, effectuez trois à quatre mouvements traversant la ligne d’écouvillon d’origine rayonnant à partir du premier quadrant, qui devrait contenir une population de bactéries relativement dense, dans le deuxième quadrant. Fermez à nouveau le couvercle et jetez la boucle. Avec une nouvelle boucle, répétez cette action à nouveau, mais cette fois en partant du deuxième vers le troisième quadrant. Ensuite, avec une nouvelle boucle à nouveau, faites une autre traînée de la troisième à la quatrième section de la plaque. Enfin, avec une boucle fraîche, faites un dernier trait en zigzag du quatrième quadrant vers le centre de la plaque. La prévalence bactérienne sera plus faible dans cette zone, ce qui permettra idéalement d’établir des colonies individuelles à partir d’une seule cellule mère viable.
Replacez le couvercle de la plaque et, si cela convient à l’espèce bactérienne, scellez la plaque avec un film para pour empêcher la circulation de l’air. Retournez la plaque de culture pour éviter les gouttes de condensation, puis placez-la à une température appropriée pour la croissance. Ici, un incubateur est réglé à 37 degrés Celsius. Laissez la plaque incuber jusqu’à ce que les colonies bactériennes soient visibles. Pour générer une population bactérienne clonale, sélectionnez une colonie discrète dans cette plaque. Maintenant, avec la boucle stérile, touchez la colonie cible et, comme précédemment, faites une traînée dans le premier quadrant d’une nouvelle plaque. Continuez à stériliser alternativement la boucle et à strier les quadrants restants de la plaque comme démontré précédemment, en terminant par le zigzag vers le centre. Fermez la plaque et placez-la à incuber jusqu’à ce que des colonies discrètes se forment. Une fois que ces colonies sont cultivées, elles représentent généralement des souches clonales pures.
La plaque striée initiale peut contenir des colonies provenant de cellules de différentes espèces bactériennes ou de cellules ayant une constitution génétique différente, en fonction de la pureté de l’échantillon. Par l’isolement ultérieur d’une seule colonie, où toutes les unités sont dérivées d’une cellule mère commune, la deuxième procédure de strie génère une population bactérienne relativement clonale, propice à une caractérisation plus poussée ou à une inoculation dans un bouillon.
