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Cultures pures et ensemencement des géloses : isolement des colonies bactériennes pures à partir d'un échantillon mixte

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Microbiology

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Pure Cultures and Streak Plating: Isolation of Single Bacterial Colonies from a Mixed Sample

6.3: Enrichment Cultures: Culturing Aerobic and Anaerobic Microbes on Selective and Differential Medias

6.5: 16S rRNA Sequencing: A PCR-based Technique to Identify Bacterial Species

165,366 Views

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09:03 min

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April 30, 2023

Overview

Source: Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Département des sciences cliniques Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Suède

Apparemment impossible à déterminer, la biodiversité microbienne est vraiment stupéfiante avec environ un billion d’espèces coexistantes (1,2). Bien que des climats particulièrement rudes, comme l’environnement acide de l’estomac humain (3) ou les lacs sous-glaciaires de l’Antarctique (4), puissent être dominés par une espèce spécifique, les bactéries se trouvent généralement dans les cultures mixtes. Comme chaque souche peut influencer la croissance d’une autre (5), la capacité de séparer et de cultiver des colonies « pures » (composées uniquement d’un seul type) est devenue essentielle dans les milieux cliniques et académiques. Les cultures pures permettent d’autres examens génétiques (6) et protéomiques (7), l’analyse de la pureté de l’échantillon et, peut-être plus remarquable, l’identification et la caractérisation des agents infectieux à partir d’échantillons cliniques.

Les bactéries ont un large éventail de besoins de croissance et il existe de nombreux types de supports nutritifs conçus pour soutenir à la fois les espèces non exigeantes et exigeantes (8). Les milieuis de croissance peuvent être préparés sous forme liquide (sous forme de bouillon) ou sous forme d’un agent gélifiant typiquement à base d’agar (un agent gélifiant dérivé d’algues rouges). Alors que l’inoculation directe dans le bouillon comporte le risque de générer une population bactérienne génétiquement diversifiée, voire mixte, le placage et le re-streaking crée une culture plus pure où chaque cellule a une composition génétique très similaire. La technique de la plaque de stries est basée sur la dilution progressive d’un échantillon (Figure 1), dans le but de séparer les cellules individuelles les unes des autres. Toute cellule viable (ci-après appelée unité de formation de colonie, CFU) soutenue par les médias et l’environnement désigné peut par la suite trouver une colonie isolée de cellules-filles par fission binaire. En dépit des taux rapides de mutation dans les communautés bactériennes, ce groupe de cellules est généralement considéré comme clonal. La récolte et le re-streaking de cette population assure par conséquent que les travaux ultérieurs ne concernent qu’un seul type bactérien.

Figure 1 : Une plaque de stries est basée sur la dilution progressive de l’échantillon d’origine. I) L’inoculum est d’abord dispersé à l’aide d’un mouvement en zigzag, créant une zone avec une population bactérienne relativement dense. II-IV) Les stries sont tirées de la zone précédente, à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile à chaque fois, jusqu’à ce que le quatrième quadrant soit atteint. V) Un dernier mouvement en zigzag dirigé vers le milieu de la plaque forme une région où l’inoculum a été nettement dilué, permettant aux colonies d’apparaître séparées les unes des autres.

La technique de la plaque de stries peut également être combinée à l’utilisation de supports sélectifs et/ou différentiels. Un milieu sélectif inhibera la croissance de certains organismes(p. ex. par l’ajout d’antibiotiques) tandis qu’un milieu différentiel aidera uniquement à distinguer l’un de l’autre(par exemple par hémolyse sur les plaques d’agar sanguine).

L’utilisation de techniques aseptiques (stériles) sous-tend tous les travaux en microbiologie. Chaque culture bactérienne devrait être considérée comme potentiellement pathogène car il existe un risque de croissance involontaire de souches dangereuses, la formation d’aérosols et la contamination de l’équipement /personnel. Pour minimiser ces risques, tous les aliments pour supports, plastiques, métalliques et vitraux sont généralement stérilisés par l’autoclacage avant et après l’utilisation, les soumettant à une vapeur saturée à haute pression à environ 121 oC qui élimine efficacement les cellules persistantes. L’espace de travail est généralement désinfecté à l’aide d’éthanol avant et après l’utilisation. Le manteau de laboratoire et les gants sont toujours portés pendant le travail avec des agents infectieux.

Procedure

1. Mise en place

Tous les microbes doivent être traités comme s’ils étaient dangereux. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants, attachez les cheveux longs et assurez-vous que les plaies sont particulièrement bien protégées.
Préparez l’espace de travail en le stérilisant à l’aide de 70 % d’éthanol.
Assurez-vous que les plaques d’agar, les solutions d’échantillon et une boîte de boucles d’inoculation en plastique pré-stérilisées ou une boucle métallique plus une flamme Bunsen, sont à portée de main. Les boucles en plastique jetables sont généralement pré-stérilisées. Les boucles métalliques doivent être trempées dans 70 % d’éthanol, puis maintenues près de la zone bleue d’une flamme Bunsen et chauffées jusqu’à ce qu’elles soient chaudes. Laisser refroidir le fil en soulevant le couvercle de la plaque (seulement légèrement pour éviter la contamination) et en le tapant contre le milieu solidifié.
Terminer chaque procédure par une stérilisation répétée de l’espace de travail et un lavage complet / stérilisation des mains et des poignets.

2. Protocole

Préparation des médias
1. Identifier et préparer un milieu solide (contenant généralement 1,5 % (w/v) d’agar) qui soutiendra l’espèce/souche bactérienne utilisée. Mélanger le milieu dans une bouteille capable de tenir deux fois le volume final pour éviter le débordement lors de l’autoclacage.
2. Stériliser les supports en plaçant la bouteille, avec un bouchon semi-serré, dans un autoclave réglé à 121 oC pendant 20 min.
3. Fermez correctement le bouchon dès que la bouteille est retirée de l’autoclave. Si le support doit être utilisé sous peu, placez la bouteille dans un bain d’eau réglé à 45 oC pour la conserver à l’état liquide. La gélose se solidifiera autrement à moins de 32-40 oC, et peut plus tard être réchauffée (généralement à l’aide d’un four à micro-ondes) jusqu’à un point de fusion à 85 oC.
Préparation de la plaque de culture(s)
1. Marquez la base des plats stériles petri (généralement 100 x 15 mm) sur le côté ou le bas avec le nom de l’expérimentateur, la date et le type de média.
2. Verser de 20 à 25 ml de milieu de culture de l’agar de 45 oC (préalablement préparé) dans chacune des plaques étiquetées. Si de la mousse apparaît le long des bords, celle-ci doit être enlevée rapidement à l’aide d’une pipette régulière et d’une pointe stérile.
3. Remettre immédiatement tous les couvercles sur les plats pour éviter la contamination.
4. Laisser l’agar se solidifier pendant environ 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC. Une fois fixées, les plaques de culture bactérienne doivent ensuite être stockées à l’envers à 4 oC afin de minimiser la condensation sur la surface moyenne.
Placage de strie
1. Immerger une boucle stérile dans l’inoculum désiré et disperser immédiatement l’échantillon prélevé sur le premier quadrant de la plaque à l’aide d’un mouvement en zigzag (Figure 1, I).
2. Fermez le couvercle et stérilisez à nouveau la boucle d’inoculation ou collectez une nouvelle boucle jetable stérile.
3. Faire 3-4 traits rayonnant du premier quadrant (contenant une population bactérienne relativement dense) vers le deuxième quadrant de la plaque (Figure 1, II).
4. Fermez le couvercle et stérilisez à nouveau la boucle d’inoculation ou jetez la boucle jetable et collectez une nouvelle boucle stérile.
5. Répétez cette stries de 3-4 coups de la seconde dans le troisième quadrant, puis du troisième au quatrième quadrant, en utilisant une boucle stérile à chaque fois (Figure 1, III – IV).
6. À l’aide d’une boucle stérile, effectuer un dernier coup dans un motif en zigzag à partir du quatrième quadrant vers le milieu de la plaque (Figure 1, V). La prévalence bactérienne sera plus faible dans cette région, ce qui permettra idéalement d’établir des colonies individuelles à partir d’une cellule mère unique et viable.
7. Fermez le couvercle et (si l’espèce bactérienne l’exige) sceller avec du parafilm pour empêcher l’écoulement de l’air.
8. Selon l’espèce bactérienne/souche, placez la plaque de culture vers le bas dans un environnement approprié et incubez jusqu’à ce que les colonies bactériennes soient visibles (des colonies séparées peuvent apparaître dans l’une ou l’autre zone de la plaque car la concentration initiale peut varier).
9. Pour générer une population bactérienne clonale, stries sur une autre plaque, l’échange de l’inoculum plaqué sur la plaque d’origine pour les cellules isolées d’une seule colonie de la plaque d’origine.

Sur un plat Petri, si une bactérie unique subit plusieurs cycles de reproduction asexuée, elle conduira à la formation d’une colonie clonale. Cependant, il peut être difficile d’obtenir une seule bactérie à partir d’un échantillon mixte, comme une suspension du sol. Si l’on en boucle de cette culture hétérogène est prise, il peut contenir jusqu’à un billion de bactéries individuelles. Pour répandre autant de bactéries sur la surface d’une plaque d’agar et obtenir une seule colonie, même en utilisant un motif en zigzag, la boucle devrait être traîné en permanence sur la surface de suffisamment de plaques fixées côte à côte pour encercler l’ensemble de Liberty Island. De toute évidence, les scientifiques n’utilisent pas vraiment autant de plaques. Au lieu de cela, ils utilisent une technique appelée stries de placage.

La technique de la plaque de stries est basée sur la dilution progressive d’un échantillon bactérien, et elle est réalisée sur la surface média solide d’un seul plat Petri. Pour commencer, la surface du média est visuellement divisée en cinq sections en attribuant quatre fragments de la circonférence comme les quatre premières sections, et le centre de la plaque comme le cinquième. Cela permettra de créer efficacement cinq plaques de presse à partir d’un seul plat Petri. Ensuite, à l’aide d’une boucle d’inoculum désiré, la première section est strié à l’aide d’un motif en zig-zag. Ensuite, soit une nouvelle boucle jetable est utilisée, soit dans le cas d’une boucle métallique, elle est stérilisée à l’effile d’un brûleur Bunsen, le flamboyant jusqu’à ce qu’il soit rouge chaud le long de la longueur du fil. Cette utilisation d’une nouvelle boucle, ou boucle de stérilisation des flammes, élimine toutes les cellules bactériennes restantes, aidant à la dilution des bactéries. La boucle chaude est ensuite refroidie dans l’air pendant quelques secondes avant d’être traîné à travers la première section pour créer trois à quatre lignes distinctes, chacune ne transportant qu’une fraction de bactéries dans la deuxième section. Les sections restantes sont striées de la même manière, à l’aide d’une boucle stérile à chaque fois, et un seul passage à travers la série précédente.

En utilisant ce cycle de stries et de stérilisation, la concentration bactérienne dans chaque section suivante doit être diluée de sorte que la section finale ne contient que quelques bactéries discrètement localisées. Lors de l’incubation, ces bactéries discrètes se multiplient pour produire des colonies clonales isolées de cellules filles, appelées unités de formation de colonies, ou UFC. Ceux-ci peuvent être récoltés et re-streaked pour s’assurer que les travaux ultérieurs impliquent seulement un seul type bactérien, désigné sous le premier mot comme une culture pure. En plus d’isoler les colonies individuelles d’une culture mixte bactérienne, la technique de placage est également utilisée pour sélectionner des souches spécifiques aux médias, déterminer la morphologie des colonies bactériennes ou identifier différentes espèces bactériennes. Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler les colonies unibactériennes d’une suspension d’échantillon mixte-bactérienne par l’intermédiaire de la technique de placage de stries.

Pour commencer, mettez des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stériliser l’espace de travail à l’aide de 70% d’éthanol. Ensuite, sélectionnez un milieu approprié qui soutiendra l’espèce ou la souche bactérienne utilisée et commencera à préparer les milieuis. Ici, l’agar commun de LB est préparé en pesant dehors dix grammes de pré-formulé, le support en poudre et 7.5 grammes d’agar. Ajouter les composants pesés et séchés à une bouteille en verre qui est capable de tenir deux fois le volume final pour éviter le débordement. Ensuite, ajoutez 500 millilitres d’eau à la bouteille, et le bouchon semi-serré. Stériliser les médias en plaçant la bouteille dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant vingt minutes. Après l’achèvement, utilisez des gants anti-chaleur ou un coussin chaud pour enlever le support de la machine, puis tordez immédiatement le bouchon de la bouteille pour le fermer hermétiquement.

Pour l’utilisation le jour même, laissez les médias refroidir en plaçant la bouteille dans un bain d’eau chauffé à environ 45 degrés Celsius, pour préserver les médias dans un état liquide. Alternativement, le support peut être laissé à la température ambiante pour stocker à l’état solide. Au besoin, micro-ondes la bouteille avec le couvercle légèrement ouvert pour faire fondre le support, et laisser refroidir le média à l’aide d’un bain d’eau de 45 degrés Celsius.

Ensuite, prenez une manche de plats stériles Petri, et avec un marqueur permanent, les étiqueter avec l’enquêteur et les noms des médias ainsi que la date. Ensuite, transférez le volume requis de la presse dans un récipient stérile, et ajoutez des antibiotiques ou d’autres composants sensibles si nécessaire. Ici, 50 millilitres de médias sont mélangés avec 100 microlitres de Kanamycine pour une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Faites tourbillonner le tube pour assurer une distribution uniforme des composants ajoutés dans tout le support. Lentement, afin d’éviter la formation de bulles, versez 20 à 25 millilitres d’environ 45 degrés Celsius milieu de culture dans chacune des plaques. Si des bulles ou de la mousse apparaissent, retirez-les rapidement à l’aide d’une pipette régulière et d’une pointe stérile. Ensuite, remplacez immédiatement tous les couvercles pour éviter la contamination. Laisser l’agar se solidifier à température ambiante pendant au moins deux heures ou toute la nuit. Une fois solidifiées, entreposez les plaques de culture à l’envers à quatre degrés Celsius pour minimiser la condensation à la surface du milieu.

Pour strier la culture de choix, prenez d’abord une plaque de culture propre et retirez le couvercle. En travaillant rapidement, immerger une boucle stérile jetable dans l’inoculum désiré, puis immédiatement écouvilloner la boucle sur le premier quadrant de la plaque à l’aide d’un mouvement en zigzag. Remplacez le couvercle du plat, jetez la boucle d’inoculation utilisée, puis sélectionnez une nouvelle boucle stérile. À l’aide de la nouvelle boucle, faire trois à quatre coups en traversant la ligne d’écouvillon d’origine rayonnant du premier quadrant, qui devrait contenir une population de bactéries relativement dense dans le deuxième quadrant. Fermez le couvercle une fois de plus, et jetez la boucle. Avec une nouvelle boucle, répétez cette action à nouveau, mais cette fois stries de la seconde dans le troisième quadrant. Puis, avec une nouvelle boucle à nouveau, faire une autre série de la troisième dans la quatrième section de la plaque. Enfin, avec une boucle fraîche, faire un dernier coup dans un modèle en zig-zag à partir du quatrième quadrant vers le centre de la plaque. La prévalence bactérienne sera plus faible dans cette région, ce qui permettra idéalement d’établir des colonies individuelles à partir d’une seule cellule mère viable.

Remplacer le couvercle de la plaque et, le cas échéant, sceller la plaque avec du film para pour empêcher l’écoulement de l’air. Tournez la plaque de culture à l’envers pour éviter les gouttes de condensation, puis placez-la à une température propice à la croissance. Ici, un incubateur est réglé à 37 degrés Celsius. Laisser la plaque incuber jusqu’à ce que les colonies bactériennes soient visibles. Pour générer une population bactérienne clonale, sélectionnez une colonie discrète à partir de cette plaque. Maintenant, avec la boucle stérile, touchez la colonie cible, et comme avant, faites une strie dans le premier quadrant d’une nouvelle plaque. Continuer à stériliser alternativement la boucle et strie les quadrants restants de la plaque comme précédemment démontré, se terminant par le zig-zag au centre. Fermez l’assiette et placez-la pour l’incuber jusqu’à formation de colonies discrètes. Une fois que ces colonies sont cultivées, elles représentent généralement de pures souches clonales.

La plaque de stries initiales peut contenir des colonies provenant de cellules de différentes espèces bactériennes ou cellules ayant une composition génétique différente, selon la pureté de l’échantillon. Par l’isolement ultérieur d’une seule colonie, où toutes les unités sont dérivées d’une cellule mère commune, la deuxième procédure de stries génère une population bactérienne relativement clonale, appropriée pour une caractérisation ou une inoculation plus poussée dans le bouillon.

Results

La plaque de stries initialepeut contenir des colonies provenant de cellules ayant une composition génétique différente ou (selon la pureté de l’échantillon) de différentes espèces bactériennes (figure 2A).

Par l’isolement ultérieur d’une seule colonie, où toutes les unités sont dérivées d’une cellule mère commune, la deuxième procédure de stries génère une population bactérienne relativement clonale, adaptée à une caractérisation ou à une inoculation ultérieure dans le bouillon ( Figure 2B).

Figure 2 : Une culture pure peut être générée à partir d’un échantillon mixte par l’isolement d’une seule colonie isolée. A) La croissance d’une seule cellule bactérienne (UFCC) a généré une colonie clonale, séparée de celles d’autres espèces et souches. Ce CFU a été employé pour le stries suivants sur une nouvelle plaque B) Une deuxième plaque, où la population bactérienne se compose uniquement des cellules dérivées du CFU initial.

Applications and Summary

La capacité d’obtenir et de cultiver une colonie bactérienne pure est essentielle, tant en milieu clinique qu’universitaire. Le placage de strie permet l’isolement d’une population de cellules relativement clonale, provenant d’un CFU partagé, qui peut être d’un intérêt particulier lors du diagnostic ou pour la caractérisation supplémentaire de l’isolat. Un échantillon est strié sur un milieu nutritif à base d’agar approprié et incubé jusqu’à ce que les colonies deviennent visibles. Une colonie isolée est ensuite récoltée et re-streaked sur une deuxième plaque.

References

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Transcript

On a Petri dish, if a single bacterium undergoes multiple rounds of asexual reproduction, it will lead to the formation of a clonal colony. However, obtaining a single bacterium from a mixed sample, such as a soil suspension, can be difficult. If one loopful of this heterogeneous culture is taken, it can contain as many as one trillion individual bacteria. To spread this many bacteria out onto the surface of an agar plate and obtain a single colony, even using a zig-zag pattern, the loop would need to be dragged continuously over the surface of enough plates set side-by-side to encircle the entirety of Liberty Island. Obviously, scientists do not really use that many plates. Instead, they use a technique called streak plating.

The streak plate technique is based on progressive dilution of a bacterial sample, and it is performed over the solid media surface of a single Petri dish. To begin, the media surface is visually divided into five sections by assigning four fragments of the circumference as the first four sections, and the plate’s center as the fifth. This will effectively create five media plates out of a single Petri dish. Next, using a loopful of desired inoculum, the first section is streaked using a zig-zag pattern. Then, either a new disposable loop is used, or in the case of a wire loop, it is sterilized with a Bunsen burner, flaming it until it is red hot along the length of the wire. This use of a new loop, or flame sterilize loop, removes any remaining bacterial cells, assisting in the dilution of the bacteria. The hot loop is then cooled in the air for a few seconds before being dragged through the first section to create three to four separate lines, each carrying only a fraction of bacteria into the second section. The remaining sections are streaked in the same manner, using a sterile loop each time, and a single pass through the previous streak.

Using this cycle of streaking and sterilizing, the bacterial concentration in every subsequent section should be diluted so that the final section contains only a few discretely located bacteria. Upon incubation, these discrete bacteria multiply to produce isolated clonal colonies of daughter cells, which are referred to as Colony Forming Units, or CFUs. These can be harvested and re-streaked to ensure that subsequent work involves only a single bacterial type, referred to as a pure culture. As well as isolating single colonies from a mixed-bacterial culture, the streak plating technique is also used to select media-specific strains, determine bacterial colony morphology, or identify different bacterial species. In this video, we will demonstrate how to isolate single-bacterial colonies from a mixed-bacterial sample suspension via streak plating technique.

To begin, put on laboratory gloves and a lab coat. Next, sterilize the workspace using 70% ethanol. Next, select a suitable medium that will sustain the utilized bacterial species or strain and begin preparing the media. Here, common LB agar is prepared by weighing out ten grams of pre-formulated, powdered media and 7.5 grams of agar. Add the weighed, dried components to a glass bottle which is able to hold twice the final volume to avoid overflow. Then, add 500 milliliters of water to the bottle, and cap it semi-tightly. Sterilize the media by placing the bottle in an autoclave set to 121 degrees Celsius for twenty minutes. After completion, use heat-proof gloves or a hot pad to remove the media from the machine and then immediately twist the bottle cap to close it tightly.

For the same-day use, let the media cool down by placing the bottle into a water bath heated to approximately 45 degrees Celsius, to preserve the media in a liquid state. Alternatively, the media can be left at room temperature to store at solid state. When needed, microwave the bottle with the lid slightly open to melt the media, and allow the media to cool using a 45 degree Celsius water bath.

Next, take a sleeve of sterile Petri dishes, and with a permanent marker, label them with the investigator and media names as well as the date. Then, transfer the required volume of media into a sterile vessel, and add antibiotics or other sensitive components if necessary. Here, 50 milliliters of media is mixed with 100 microliters of Kanamycin for a final concentration of 25 micrograms per milliliter. Swirl the tube to ensure even distribution of the added components throughout the media. Slowly, so as to avoid bubble formation, pour 20 to 25 milliliters of approximately 45 degree Celsius culture medium into each of the plates. If bubbles or foam appear, swiftly remove using a regular pipette and a sterile tip. Then, immediately replace all lids to prevent contamination. Allow the agar to solidify at room temperature for at least two hours or overnight. Once solidified, store the culture plates upside down at four degrees Celsius to minimize condensation on the medium’s surface.

To streak the culture of choice, first take a clean culture plate and remove the lid. Working quickly, submerge a disposable, sterile loop into the desired inoculum and then immediately swab the loop over the first quadrant of the plate using a zig-zag motion. Replace the lid of the dish, discard the used inoculation loop, and then select a new sterile loop. Using the new loop, make three to four strokes crossing the original swab line radiating from the first quadrant, which should contain a relatively dense bacteria population into the second quadrant. Close the lid once more, and discard the loop. With a new loop, repeat this action again, but this time streaking from the second into the third quadrant. Then, with a new loop again, make another streak from the third into the fourth section of the plate. Finally, with a fresh loop, make one last stroke in a zig-zag pattern from the fourth quadrant towards the center of the plate. The bacterial prevalence will be lower in this area, ideally allowing individual colonies to be established from a single viable mother cell.

Replace the plate lid, and if appropriate for the bacterial species, seal the plate with para film to prevent airflow. Turn the culture plate upside down to prevent condensation drips, and then place at a suitable temperature for growth. Here, an incubator is set to 37 degrees Celsius. Allow the plate to incubate until bacterial colonies are visible. To generate a clonal bacterial population, select one discrete colony from this plate. Now, with the sterile loop, touch the target colony, and as before, make a streak in the first quadrant of a new plate. Continue to alternately sterilize the loop and streak the remaining quadrants of the plate as previously demonstrated, ending with the zig-zag to the center. Close the plate, and place it to incubate until discrete colonies form. Once these colonies are grown, they will typically represent pure clonal strains.

The initial streak plate may contain colonies originating from cells from different bacterial species or cells with different genetic makeup, depending upon the sample purity. Through subsequent isolation of a single colony, where all units are derived from a common mother cell, the second streaking procedure generates a relatively clonal bacterial population, suitable for further characterization or inoculation into broth.

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