Cultures pures et ensemencement des géloses : isolement des colonies bactériennes pures à partir d'un échantillon mixte

1. Mise en place

1. Tous les microbes doivent être traités comme s'ils étaient dangereux. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants, attachez les cheveux longs et assurez-vous que les plaies sont particulièrement bien protégées.
2. Préparez l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol.
3. Assurez-vous que les plaques d'agar, les solutions d'échantillon et une boîte de boucles d'inoculation en plastique pré-stérilisées ou une boucle métallique plus une flamme Bunsen, sont à portée de main. Les boucles en plastique jetables sont généralement pré-stérilisées. Les boucles métalliques doivent être trempées dans 70 % d'éthanol, puis maintenues près de la zone bleue d'une flamme Bunsen et chauffées jusqu'à ce qu'elles soient chaudes. Laisser refroidir le fil en soulevant le couvercle de la plaque (seulement légèrement pour éviter la contamination) et en le tapant contre le milieu solidifié.
4. Terminer chaque procédure par une stérilisation répétée de l'espace de travail et un lavage complet / stérilisation des mains et des poignets.

2. Protocole

1. Préparation des médias
   1. Identifier et préparer un milieu solide (contenant généralement 1,5 % (w/v) d'agar) qui soutiendra l'espèce/souche bactérienne utilisée. Mélanger le milieu dans une bouteille capable de tenir deux fois le volume final pour éviter le débordement lors de l'autoclacage.
   2. Stériliser les supports en plaçant la bouteille, avec un bouchon semi-serré, dans un autoclave réglé à 121 oC pendant 20 min.
   3. Fermez correctement le bouchon dès que la bouteille est retirée de l'autoclave. Si le support doit être utilisé sous peu, placez la bouteille dans un bain d'eau réglé à 45 oC pour la conserver à l'état liquide. La gélose se solidifiera autrement à moins de 32-40 oC, et peut plus tard être réchauffée (généralement à l'aide d'un four à micro-ondes) jusqu'à un point de fusion à 85 oC.
2. Préparation de la plaque de culture(s)
   1. Marquez la base des plats stériles petri (généralement 100 x 15 mm) sur le côté ou le bas avec le nom de l'expérimentateur, la date et le type de média.
   2. Verser de 20 à 25 ml de milieu de culture de l'agar de 45 oC (préalablement préparé) dans chacune des plaques étiquetées. Si de la mousse apparaît le long des bords, celle-ci doit être enlevée rapidement à l'aide d'une pipette régulière et d'une pointe stérile.
   3. Remettre immédiatement tous les couvercles sur les plats pour éviter la contamination.
   4. Laisser l'agar se solidifier pendant environ 2 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 oC. Une fois fixées, les plaques de culture bactérienne doivent ensuite être stockées à l'envers à 4 oC afin de minimiser la condensation sur la surface moyenne.
3. Placage de strie
   1. Immerger une boucle stérile dans l'inoculum désiré et disperser immédiatement l'échantillon prélevé sur le premier quadrant de la plaque à l'aide d'un mouvement en zigzag (Figure 1, I).
   2. Fermez le couvercle et stérilisez à nouveau la boucle d'inoculation ou collectez une nouvelle boucle jetable stérile.
   3. Faire 3-4 traits rayonnant du premier quadrant (contenant une population bactérienne relativement dense) vers le deuxième quadrant de la plaque (Figure 1, II).
   4. Fermez le couvercle et stérilisez à nouveau la boucle d'inoculation ou jetez la boucle jetable et collectez une nouvelle boucle stérile.
   5. Répétez cette stries de 3-4 coups de la seconde dans le troisième quadrant, puis du troisième au quatrième quadrant, en utilisant une boucle stérile à chaque fois (Figure 1, III - IV).
   6. À l'aide d'une boucle stérile, effectuer un dernier coup dans un motif en zigzag à partir du quatrième quadrant vers le milieu de la plaque (Figure 1, V). La prévalence bactérienne sera plus faible dans cette région, ce qui permettra idéalement d'établir des colonies individuelles à partir d'une cellule mère unique et viable.
   7. Fermez le couvercle et (si l'espèce bactérienne l'exige) sceller avec du parafilm pour empêcher l'écoulement de l'air.
   8. Selon l'espèce bactérienne/souche, placez la plaque de culture vers le bas dans un environnement approprié et incubez jusqu'à ce que les colonies bactériennes soient visibles (des colonies séparées peuvent apparaître dans l'une ou l'autre zone de la plaque car la concentration initiale peut varier).
   9. Pour générer une population bactérienne clonale, stries sur une autre plaque, l'échange de l'inoculum plaqué sur la plaque d'origine pour les cellules isolées d'une seule colonie de la plaque d'origine.