Why are variable regions of 16S rRNA useful for bacterial identification?

Variable regions of 16S rRNA serve as unique molecular fingerprints for bacterial species because they differ among bacteria while conserved regions remain essential for ribosome function. These variable regions allow scientists to distinguish phenotypically identical strains that appear the same under microscopy or on growth media, making 16S rRNA sequencing more accurate than conventional identification methods.

What are the main steps in a PCR reaction for 16S rRNA amplification?

PCR consists of repeated cycles of three key steps: denaturation of double-stranded DNA template, annealing of universal primer pairs to conserved regions of the gene, and extension of primers by DNA polymerase. Universal primers bind to highly conserved regions, allowing amplification of the 16S rRNA gene in any bacterial species. The process generates millions of copies of the target DNA fragment for subsequent analysis.

How do you evaluate the quality of a PCR product before sequencing?

PCR product quality is assessed using agarose gel electrophoresis, where successful amplification yields a single band of expected size, typically up to 1500 base pairs. The band should appear distinct without smearing or multiple bands, indicating a pure product. If the gel shows multiple bands or no band, the PCR reaction failed and should be repeated with optimized conditions.

What information does a DNA chromatogram reveal about sequencing quality?

A DNA chromatogram displays peaks representing nucleotides in the sequence. An ideal chromatogram has evenly spaced peaks with minimal background signals. Double peaks indicate multiple DNA templates were present, while broad peaks suggest loss of resolution. Poor quality sections typically appear at the five prime and three prime ends and should be removed before database comparison.

How does BLAST database searching confirm bacterial species identity?

After assembling forward and reverse primer sequences into one continuous sequence, the sequence is entered into the BLAST nucleotide database for comparison with reference 16S rRNA sequences. BLAST returns matches ranked by highest similarity, allowing confirmation of bacterial identity. One hundred percent identity with a reference sequence provides definitive species identification.

Why is genomic DNA quality critical before beginning PCR?

High-quality genomic DNA free of contaminants is essential because impurities can inhibit the PCR reaction and prevent successful amplification. DNA should appear as a thick band above 10 kilobases with minimal smearing on an agarose gel. Creating serial dilutions of the isolated DNA helps optimize the template concentration for PCR, improving amplification efficiency and product quality.

What advantages does 16S rRNA sequencing offer over conventional bacterial identification methods?

Sixteen S rRNA sequencing is faster and more accurate than conventional methods like microscopy, growth on selective media, and biochemical tests. It enables identification of bacteria difficult to culture in laboratory conditions and allows discrimination between phenotypically identical strains at the molecular level. This molecular approach provides definitive species and strain identification based on genetic variation.

Séquençage de l'ARNr 16S : une technique basée sur la PCR pour l'identification d'espèces bactériennes

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1. Mise en place

Tout en manipulant des micro-organismes, il est nécessaire de suivre de bonnes pratiques microbiologiques. Tous les micro-organismes, en particulier les échantillons inconnus, doivent être traités comme des agents pathogènes potentiels. Suivez la technique aseptique pour éviter de contaminer les échantillons, les chercheurs ou le laboratoire. Lavez-vous les mains avant et après la manipulation des bactéries, utilisez des gants et portez des vêtements de protection.
Effectuer une évaluation des risques pour le protocole expérimental pour l'isolement de l'ADN génomique et la purification des produits PCR. Certains réactifs peuvent être nocifs!
La culture pure est essentielle pour le séquençage de l'ARNr 16S. Avant de procéder à l'isolement de l'ADN génomique, assurez-vous que le matériau de départ est entièrement pur. Cela peut être fait par le placage de strie pour isoler les colonies individuelles. Ceux-ci peuvent être cultivés plus loin strié sur des assiettes individuellement, ou dans le bouillon, si nécessaire.
Équipement de laboratoire requis :
1. Cycler thermique pour PCR. La fonction du cycleur thermique est d'augmenter et de baisser la température selon un programme établi. Lors de la création du programme, il vous sera demandé d'entrer les valeurs de température et de temps pour chaque étape PCR ainsi que le nombre total de cycles.
2. Système d'électrophoresis de gel d'Agarose. Il est utilisé pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille et de leur charge. Dans ce protocole, l'électrophorèse de gel d'agarose sera employée pour visualiser la qualité de l'ADN génomique et des produits de PCR isolés.

2. Protocole

Note: Le protocole démontré s'applique au séquençage du gène 16S rRNA à partir d'une culture pure de bactéries. Elle ne s'applique pas aux études métagénomiques.

Cultiver des bactéries pour l'isolement de l'ADN génomique (aDNc).
1. Cultivez votre micro-organisme sur un support approprié. Les médias liquides et solides peuvent être utilisés dans cette étape. Choisissez les conditions qui donnent la meilleure croissance. Pendant la planification de l'expérience, gardez à l'esprit que les bactéries à croissance lente peuvent avoir besoin de plusieurs jours pour atteindre la phase de croissance tardive/ stationnaire. Dans ce protocole, Bacillus subtilis 168 a été cultivé dans le bouillon de lysogénie (LB) pendant la nuit dans un incubateur secouant réglé à 200 tr/min, 37 oC.
Isolement de l'ADN g.
1. Si des bactéries étaient cultivées sur un milieu solide, gratter certaines cellules à l'aide d'une boucle stérile et les suspendre à nouveau dans 1 ml d'eau distillée.
2. Si les bactéries étaient cultivées dans un milieu liquide, utilisez environ 1,5 ml d'une culture du jour au lendemain.
3. Pelleter les cellules par centrifugation (1 minute, 12 000 - 16 000 g), enlever le supernatant, et utiliser les cellules pour l'isolement gDNA à l'aide d'un kit commercial ou de protocoles standard[p. ex. préparation totale de l'ADN du CTAB (13) ou extraction de phénol-chloroforme (14)]. Ici, un kit commercial a été utilisé pour isoler l'ADNc de 1,5 ml de B. subtilis 168 culture de nuit, OD₆₀₀ - 1,5.
  Note 1 : Pour certaines bactéries Gram-négatives cette étape peut être omise et remplacée par la libération simple de l'ADN des cellules par ébullition. Suspendre les granulés bactériens dans de l'eau distillée et incuber dans un bloc chauffant réglé à 100 oC pendant 10 minutes.
  Note 2 : Les cellules bactériennes gram-positives sont difficiles à perturber. Il est donc recommandé de choisir une méthode d'isolement gDNA ou un kit qui est dédié à l'isolement de ce groupe de bactéries.
gDNA contrôle de la qualité.
1. Vérifiez la qualité de l'ADN gdna isolé par électrophoresis de gel d'agarose. Tout d'abord, mélanger 5 lL de l'ADNg isolé avec 1 l de la teinture de chargement (6x), et charger l'échantillon sur un gel d'agarose de 0,8% qui contient un réactif de coloration de l'ADN.
2. Chargez une norme de masse moléculaire et exécutez l'électrophorèse jusqu'à ce que le front de teinture atteigne le fond du gel.
3. Une fois l'électrophoresis terminée, visualisez le gel sur un transilluminateur approprié (uv ou lumière bleue). gDNA apparaît comme une bande moléculaire élevée épaisse (au-dessus de 10 kb). Un exemple de la vérification de la qualité de l'ADNg est illustré dans la figure 3.
4. Si l'ADNc passe le contrôle de la qualité(c'est-à-direla bande moléculaire élevée est présente et il y a peu ou pas de frottis de l'ADNc), diluez votre gDNA en série en étiquetant d'abord 3 tubes microcentrifugecommement comme suit : « 10x », « 100x » et « 1000x ».
5. Pipette 90 l d'eau distillée stérile dans chacun des 3 tubes.
6. Prenez 10 L de la solution gDNA et ajoutez-la au tube marqué "10x".
7. Pipet l'ensemble du volume(c.-à-100 l) de haut en bas à fond pour s'assurer que la solution est mélangée uniformément. Ensuite, prenez 10 L de la solution de ce tube et transférez-le dans le tube marqué "100x".
8. Mélanger comme décrit précédemment et répéter la même procédure en transférant 10 L de la solution du tube "100x" au tube "1000x". Ces dilutions seront utilisées comme modèle dans la réaction PCR.

Figure 3 : Agarose gel électrophoresis de gDNA isolé de Bacillus subtilis. Lane 1: M - marqueur de masse moléculaire (de haut en bas: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 1000 bp). Voie 2: gDNA - ADN génomique isolé de Bacillus subtilis. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Amplification du gène 16S rRNA par PCR.
Note: Le protocole PCR ci-dessous est optimisé pour une polymérase d'ADN particulière et une paire d'apprêt 8F - 1492R (voir le tableau 1). L'optimisation du protocole est nécessaire pour chaque paire de polymérases et d'amorce.
1. Décongeler tous les réactifs sur la glace.
2. Préparer le mix pcR master tel qu'indiqué dans le tableau 2. Étant donné que la polymérase d'ADN est active à température ambiante, la configuration de la réaction doit être effectuée sur la glace, c'est-à-dire que les tubes PCR et les composants de réaction doivent être maintenus sur la glace tout le temps. Préparer une réaction par échantillon d'ADNc get et une réaction pour un contrôle négatif. Le contrôle négatif est un mélange PCR sans le modèle gDNA et est utilisé pour s'assurer que les autres composants de la réaction ne sont pas contaminés.
  Note: En cas d'échantillons multiples, un mélange maître est couramment préparé. Master mix est une solution contenant tous les composants de réaction à l'exception du modèle. Il permet d'omettre le tuyauterie répétitif, d'éviter les erreurs de tuyauterie et d'assurer une grande cohérence entre les échantillons. Pour préparer le mix principal, multipliez le volume de chaque composant (à l'exception du modèle d'ADN) par le nombre d'échantillons testés. Mélanger tous les composants dans le tube microcentrifuge et pipet tout le volume de haut en bas plusieurs fois.
3. Aliquot 49 l du mélange principal dans les différents tubes PCR.
4. Ajouter un modèle de 1 L dans des tubes avec le mélange maître. Pour un contrôle négatif, ajoutez 1 l d'eau stérile. Pour s'assurer que les composants sont bien mélangés, épileflez doucement le mélange vers le haut et vers le bas 10 fois avec une pipette réglé à 30-50 'L.
5. Définir la machine PCR avec le programme indiqué dans le tableau 3.
6. Mettez les tubes dans la machine PCR et démarrez le programme.
7. Une fois le programme terminé, examinez la qualité de votre produit PCR par électrophoresis de gel d'agarose.
8. Une réaction PCR réussie à l'aide de la paire d'amorces 8F-1492R donne une seule bande d'environ 1,5 kb (Figure 4). Si d'autres bandes (c.-à-d. des produits non spécifiques) sont présentes, optimisez le programme PCR en ajustant la température d'annealing. Si une seule bande de taille prévue est présente, passez à l'étape suivante. Ici, la réaction pcR avec 100x modèle dilué gDNA a donné le meilleur produit car il avait une bande forte de taille prévue et manquait de produits non spécifiques. C'est pourquoi il a été choisi pour être purifié et envoyé pour le séquençage.
9. Avant le séquençage, le produit doit être nettoyé à partir d'amorces résiduelles, de désoxyribonucleotides, de polymérase et de tampon qui étaient présents dans la réaction PCR. Les produits PCR peuvent être isolés à l'aide d'un kit commercial de purification PCR. La réaction PCR est chargée sur une colonne qui contient une matrice de liaison de l'ADN. Le produit PCR se lie à la colonne, tandis que d'autres composants circulent dans la colonne. La colonne est ensuite lavée à l'aide d'un tampon de lavage, et enfin, l'ADN est élucidé dans le tampon de choix. Confirmez que le tampon d'élution qui est complété par le kit est compatible avec le séquençage.
10. Envoyer le produit PCR purifié pour le séquençage de l'ADN. Suivez les lignes directrices pour la soumission d'échantillons de séquençage à l'installation de séquençage choisie. Pour la meilleure couverture de séquence, utilisez les amorces d'amplification PCR (les mêmes que dans la section 2.4.1) comme amorces de séquençage. Ici, les amorces 8F et 1492R ont été utilisées pour le séquençage du produit PCR.

composant	Concentration finale	Volume par réaction	Volume par x réactions (mix master)
tampon de réaction 5x	1x 1x	10 l	10 l x
10 mM dNTP	200 m	1 l	1 l x
10 M Amorce 8F	0,5 M	2,5 l	2,5 l x
10 M Amorce 1492R	0,5 M	2,5 l	2,5 l x
Polymérase de phusion	1 unité	0,5 l	0,5 l x
Template ADN	-	1 l	-
ddH₂O	-	32,5 l	32,5 l x
Volume total		50 l	49 l x

Tableau 2 : composants de réaction PCR. - utiliser l'ADNc dilué 10x, 100x ou 1000x à partir de l'étape 2.3.

pas	température	temps	Cycles
Dénaturation initiale	98oC	30 sec
Dénaturation	98oC	10 sec	25-30
Recuit	60oC	30 sec
prolongation	72oC	45 sec
Prolongation finale	72oC	7 min
tenir	4oC	∞

Tableau 3 : Programme PCR pour l'amplification du gène 16S rRNA.

Figure 4 : Électrophoresis de gel d'Agarose des produits de PCR amplifiés utilisant des amorces 8F et 1492R et gDNA comme modèle. L'échantillon d'ADNc de B. subtilis (voir la figure 3) a été dilué 10, 100 et 1000 fois afin de tester les meilleurs résultats. Voie 1: M - marqueur de masse moléculaire (de haut en bas: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Voie 2: Réaction PCR avec le modèle dilué 10x. Voie 3: Réaction PCR avec le modèle dilué 100x. Voie 4: Réaction PCR avec le modèle dilué 1000x. Voie 5: (C-) - contrôle négatif (réaction sans modèle d'ADN). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Analyse des données et résultats

Note: Le produit PCR est séquencé à l'aide des amorces avant (ici 8F) et inverses (ici 1492R). Par conséquent, deux ensembles de séquences de données sont générés, l'un pour l'avant et l'autre pour l'amorce inversée. Pour chaque séquence, au moins deux types de fichiers sont générés : i) un fichier texte contenant la séquence d'ADN et ii) un chromatogramme d'ADN, qui montre la qualité de la séquence.

Pour l'apprêt avant, ouvrez le chromatogramme et examinez attentivement la séquence. Un chromatogramme idéal pour une séquence de qualité devrait avoir des pics espacés uniformément et peu ou pas de signaux de fond (Figure 5A).
Si le chromatogramme n'est pas de haute qualité, la séquence doit être jetée, ou le fichier texte de séquence doit être révisé en fonction des éléments suivants :
1. La présence de doubles pics dans tout le chromatogramme indique la présence de plusieurs modèles d'ADN. Cela peut être le cas si la culture bactérienne n'était pas pure. Une telle séquence doit être écartée (Figure 5B).
2. Un chromatogramme ambigu pourrait résulter de la présence de différents pics colorés au même endroit. L'une des erreurs les plus courantes est la présence de deux pics de couleur différents dans la même position et l'attribution inappropriée des bases par le logiciel de séquençage (Figure 5C). Corrigez manuellement les nucléotides mal assignés et modifiez-les dans le fichier texte.
3. Les chromatogrammes à basse résolution peuvent entraîner des « pics larges » qui causent souvent un mauvais comptage des nucléotides dans ces régions (figure 5D). Cette erreur est difficile à corriger, et donc les inadéquations possibles dans l'étape d'alignement supplémentaire ne doivent pas être traitées comme fiables.
4. Une mauvaise qualité de lecture du chromatogramme et la présence de pics multiples sont généralement observées aux extrémités de 5' et 3' de la séquence. Certains logiciels de séquenceur suppriment automatiquement ces fragments de mauvaise qualité (Figure 5E), et les nucléotides ne sont pas inclus dans le fichier texte. Si votre séquence n'a pas été tronquée automatiquement, déterminez les fragments de mauvaise qualité(par exemple signal faible, pics qui se chevauchent, perte de résolution) aux extrémités et supprimez les bases respectives du fichier texte.

Figure 5 : Exemples de dépannage du séquençage de l'ADN. A) Exemple d'une séquence de chromatogrammes de qualité (des pics uniformément espacés et sans ambiguïté). B) Séquence de mauvaise qualité qui se produit habituellement au début du chromatogramme. La zone grise est considérée comme de mauvaise qualité et automatiquement supprimée par le logiciel de séquençage. Plus de bases peuvent être coupées manuellement. C) Présence de double pics (indiqués par des flèches). Un nucléotide indiqué par la flèche rouge a été lu par le séquenceur comme "T" (pic rouge), mais le pic bleu est plus fort, et il peut également être interprété comme "C". D) Les pics de chevauchement indiquent une contamination par l'ADN(c.-à-d. plus d'un modèle). E) Perte de résolution et soi-disant « pics larges » (marqués par rectangle) qui empêchent l'appel de base fiable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Répétez 3.1 et 3.2 pour l'amorce inversée.
Enfin, assemblez les séquences avant et inverses en une séquence contigu. Une bonne exécution de séquençage donne une séquence de jusqu'à 1100 bp. Considérant que le produit PCR est de 1500 bp de long, les séquences obtenues à l'aide d'amorces avant et inverses devraient se chevaucher partiellement.
1. Fusionner les deux séquences à l'aide du programme d'assemblage de séquences d'ADN, par exemple un outil gratuit comme CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. Insérez les deux séquences en format EXPRES dans la case indiquée. Cliquez sur le bouton "Soumettre" et attendez que les résultats reviennent.
3. Pour afficher la séquence assemblée appuyez sur "Contigs" dans l'onglet résultat. Pour voir les détails de l'alignement appuyez sur "Détails d'assemblage".
  Note 1 : Si le logiciel CAP3 est utilisé pour l'assemblage contig, il n'est pas nécessaire de convertir la séquence d'apprêt inverse en inverse-complémentaire; toutefois, cette étape peut être nécessaire si un autre programme est utilisé.
  Note 2 : Le format FASTA est un format textuel pour représenter la séquence de nucléotide. La première ligne (la ligne de description) dans un fichier FASTA commence par un symbole « 'gt;» suivi du nom ou d'un identifiant unique de la séquence. Suivant la ligne de description est la séquence de nucléotide. Collez vos séquences dans le format suivant :
  
  'gt;séquence'frw'primer
  coller votre séquence à partir du fichier texte ici
  'gt;séquence'rvs'primer
  coller votre séquence à partir du fichier texte ici
Effectuez une recherche dans une base de données en visitant le site Web pour l'outil de recherche local de base (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. Sélectionnez l'outil "Nucléotide BLAST" pour comparer votre séquence à la base de données.
2. Entrez votre séquence (le contig assemblé en 3.5) dans la boîte de texte "Séquence requête", puis sélectionnez la base de données "16S rRNA sequences (Bacteria et Archea)" dans le menu défilement vers le bas.
3. Appuyez sur le bouton "BLAST" au bas de la page. Les séquences les plus similaires seront retournées. Un exemple de résultat BLAST est affiché dans la figure 6. Dans l'expérience présentée, le coup principal est la souche 168 de B. subtilis, montrant l'identité à 100 % avec la séquence disponible dans la base de données BLAST.
4. Si le coup supérieur ne montre pas l'identité à 100%, allez à l'alignement et vérifiez les décalages. En cliquant sur le coup supérieur, vous serez dirigé vers les détails de l'alignement. Les nucléotides alignés seront rejoints par de courtes lignes verticales tandis que les nucléotides dépareillés ont un espace entre eux. Retournez au chromatogramme que vous avez reçu de la société de séquençage et révisez la séquence une fois de plus en mettant l'accent sur la région dépareillée. Corriger la séquence si des erreurs supplémentaires sont trouvées. Exécutez BLAST à nouveau en utilisant la séquence corrigée.

Figure 6 : Exemple du résultat de blast nucléotide. La séquence de gène de rRNA 16S de la culture pure de B. subtilis 168 a été employée comme séquence de requête. Le top hit montre 100% d'identité (souligné) à la souche B. subtilis 168, comme prévu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Source: Ewa Bukowska-Faniband¹, Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Département des sciences cliniques Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Cent…