6.5: Séquençage de l'ARNr 16S : une technique basée sur la PCR pour l'identification d'espèces bactériennes

1. Mise en place

1. Tout en manipulant des micro-organismes, il est nécessaire de suivre de bonnes pratiques microbiologiques. Tous les micro-organismes, en particulier les échantillons inconnus, doivent être traités comme des agents pathogènes potentiels. Suivez la technique aseptique pour éviter de contaminer les échantillons, les chercheurs ou le laboratoire. Lavez-vous les mains avant et après la manipulation des bactéries, utilisez des gants et portez des vêtements de protection.
2. Effectuer une évaluation des risques pour le protocole expérimental pour l'isolement de l'ADN génomique et la purification des produits PCR. Certains réactifs peuvent être nocifs!
3. La culture pure est essentielle pour le séquençage de l'ARNr 16S. Avant de procéder à l'isolement de l'ADN génomique, assurez-vous que le matériau de départ est entièrement pur. Cela peut être fait par le placage de strie pour isoler les colonies individuelles. Ceux-ci peuvent être cultivés plus loin strié sur des assiettes individuellement, ou dans le bouillon, si nécessaire.
4. Équipement de laboratoire requis :
   1. Cycler thermique pour PCR. La fonction du cycleur thermique est d'augmenter et de baisser la température selon un programme établi. Lors de la création du programme, il vous sera demandé d'entrer les valeurs de température et de temps pour chaque étape PCR ainsi que le nombre total de cycles.
   2. Système d'électrophoresis de gel d'Agarose. Il est utilisé pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille et de leur charge. Dans ce protocole, l'électrophorèse de gel d'agarose sera employée pour visualiser la qualité de l'ADN génomique et des produits de PCR isolés.

2. Protocole

Note: Le protocole démontré s'applique au séquençage du gène 16S rRNA à partir d'une culture pure de bactéries. Elle ne s'applique pas aux études métagénomiques.

1. Cultiver des bactéries pour l'isolement de l'ADN génomique (aDNc).
   1. Cultivez votre micro-organisme sur un support approprié. Les médias liquides et solides peuvent être utilisés dans cette étape. Choisissez les conditions qui donnent la meilleure croissance. Pendant la planification de l'expérience, gardez à l'esprit que les bactéries à croissance lente peuvent avoir besoin de plusieurs jours pour atteindre la phase de croissance tardive/ stationnaire. Dans ce protocole, Bacillus subtilis 168 a été cultivé dans le bouillon de lysogénie (LB) pendant la nuit dans un incubateur secouant réglé à 200 tr/min, 37 oC.
2. Isolement de l'ADN g.
   1. Si des bactéries étaient cultivées sur un milieu solide, gratter certaines cellules à l'aide d'une boucle stérile et les suspendre à nouveau dans 1 ml d'eau distillée.
   2. Si les bactéries étaient cultivées dans un milieu liquide, utilisez environ 1,5 ml d'une culture du jour au lendemain.
   3. Pelleter les cellules par centrifugation (1 minute, 12 000 - 16 000 g), enlever le supernatant, et utiliser les cellules pour l'isolement gDNA à l'aide d'un kit commercial ou de protocoles standard[p. ex. préparation totale de l'ADN du CTAB (13) ou extraction de phénol-chloroforme (14)]. Ici, un kit commercial a été utilisé pour isoler l'ADNc de 1,5 ml de B. subtilis 168 culture de nuit, OD₆₀₀ - 1,5.
      Note 1 : Pour certaines bactéries Gram-négatives cette étape peut être omise et remplacée par la libération simple de l'ADN des cellules par ébullition. Suspendre les granulés bactériens dans de l'eau distillée et incuber dans un bloc chauffant réglé à 100 oC pendant 10 minutes.
      Note 2 : Les cellules bactériennes gram-positives sont difficiles à perturber. Il est donc recommandé de choisir une méthode d'isolement gDNA ou un kit qui est dédié à l'isolement de ce groupe de bactéries.
3. gDNA contrôle de la qualité.
   1. Vérifiez la qualité de l'ADN gdna isolé par électrophoresis de gel d'agarose. Tout d'abord, mélanger 5 lL de l'ADNg isolé avec 1 l de la teinture de chargement (6x), et charger l'échantillon sur un gel d'agarose de 0,8% qui contient un réactif de coloration de l'ADN.
   2. Chargez une norme de masse moléculaire et exécutez l'électrophorèse jusqu'à ce que le front de teinture atteigne le fond du gel.
   3. Une fois l'électrophoresis terminée, visualisez le gel sur un transilluminateur approprié (uv ou lumière bleue). gDNA apparaît comme une bande moléculaire élevée épaisse (au-dessus de 10 kb). Un exemple de la vérification de la qualité de l'ADNg est illustré dans la figure 3.
   4. Si l'ADNc passe le contrôle de la qualité(c'est-à-direla bande moléculaire élevée est présente et il y a peu ou pas de frottis de l'ADNc), diluez votre gDNA en série en étiquetant d'abord 3 tubes microcentrifugecommement comme suit : « 10x », « 100x » et « 1000x ».
   5. Pipette 90 l d'eau distillée stérile dans chacun des 3 tubes.
   6. Prenez 10 L de la solution gDNA et ajoutez-la au tube marqué "10x".
   7. Pipet l'ensemble du volume(c.-à-100 l) de haut en bas à fond pour s'assurer que la solution est mélangée uniformément. Ensuite, prenez 10 L de la solution de ce tube et transférez-le dans le tube marqué "100x".
   8. Mélanger comme décrit précédemment et répéter la même procédure en transférant 10 L de la solution du tube "100x" au tube "1000x". Ces dilutions seront utilisées comme modèle dans la réaction PCR.

Figure 3 : Agarose gel électrophoresis de gDNA isolé de Bacillus subtilis. Lane 1: M - marqueur de masse moléculaire (de haut en bas: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 1000 bp). Voie 2: gDNA - ADN génomique isolé de Bacillus subtilis. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Amplification du gène 16S rRNA par PCR.
   Note: Le protocole PCR ci-dessous est optimisé pour une polymérase d'ADN particulière et une paire d'apprêt 8F - 1492R (voir le tableau 1). L'optimisation du protocole est nécessaire pour chaque paire de polymérases et d'amorce.
   1. Décongeler tous les réactifs sur la glace.
   2. Préparer le mix pcR master tel qu'indiqué dans le tableau 2. Étant donné que la polymérase d'ADN est active à température ambiante, la configuration de la réaction doit être effectuée sur la glace, c'est-à-dire que les tubes PCR et les composants de réaction doivent être maintenus sur la glace tout le temps. Préparer une réaction par échantillon d'ADNc get et une réaction pour un contrôle négatif. Le contrôle négatif est un mélange PCR sans le modèle gDNA et est utilisé pour s'assurer que les autres composants de la réaction ne sont pas contaminés.
      Note: En cas d'échantillons multiples, un mélange maître est couramment préparé. Master mix est une solution contenant tous les composants de réaction à l'exception du modèle. Il permet d'omettre le tuyauterie répétitif, d'éviter les erreurs de tuyauterie et d'assurer une grande cohérence entre les échantillons. Pour préparer le mix principal, multipliez le volume de chaque composant (à l'exception du modèle d'ADN) par le nombre d'échantillons testés. Mélanger tous les composants dans le tube microcentrifuge et pipet tout le volume de haut en bas plusieurs fois.
   3. Aliquot 49 l du mélange principal dans les différents tubes PCR.
   4. Ajouter un modèle de 1 L dans des tubes avec le mélange maître. Pour un contrôle négatif, ajoutez 1 l d'eau stérile. Pour s'assurer que les composants sont bien mélangés, épileflez doucement le mélange vers le haut et vers le bas 10 fois avec une pipette réglé à 30-50 'L.
   5. Définir la machine PCR avec le programme indiqué dans le tableau 3.
   6. Mettez les tubes dans la machine PCR et démarrez le programme.
   7. Une fois le programme terminé, examinez la qualité de votre produit PCR par électrophoresis de gel d'agarose.
   8. Une réaction PCR réussie à l'aide de la paire d'amorces 8F-1492R donne une seule bande d'environ 1,5 kb (Figure 4). Si d'autres bandes (c.-à-d. des produits non spécifiques) sont présentes, optimisez le programme PCR en ajustant la température d'annealing. Si une seule bande de taille prévue est présente, passez à l'étape suivante. Ici, la réaction pcR avec 100x modèle dilué gDNA a donné le meilleur produit car il avait une bande forte de taille prévue et manquait de produits non spécifiques. C'est pourquoi il a été choisi pour être purifié et envoyé pour le séquençage.
   9. Avant le séquençage, le produit doit être nettoyé à partir d'amorces résiduelles, de désoxyribonucleotides, de polymérase et de tampon qui étaient présents dans la réaction PCR. Les produits PCR peuvent être isolés à l'aide d'un kit commercial de purification PCR. La réaction PCR est chargée sur une colonne qui contient une matrice de liaison de l'ADN. Le produit PCR se lie à la colonne, tandis que d'autres composants circulent dans la colonne. La colonne est ensuite lavée à l'aide d'un tampon de lavage, et enfin, l'ADN est élucidé dans le tampon de choix. Confirmez que le tampon d'élution qui est complété par le kit est compatible avec le séquençage.
   10. Envoyer le produit PCR purifié pour le séquençage de l'ADN. Suivez les lignes directrices pour la soumission d'échantillons de séquençage à l'installation de séquençage choisie. Pour la meilleure couverture de séquence, utilisez les amorces d'amplification PCR (les mêmes que dans la section 2.4.1) comme amorces de séquençage. Ici, les amorces 8F et 1492R ont été utilisées pour le séquençage du produit PCR.

Tableau 2 : composants de réaction PCR. - utiliser l'ADNc dilué 10x, 100x ou 1000x à partir de l'étape 2.3.

Tableau 3 : Programme PCR pour l'amplification du gène 16S rRNA.

Figure 4 : Électrophoresis de gel d'Agarose des produits de PCR amplifiés utilisant des amorces 8F et 1492R et gDNA comme modèle. L'échantillon d'ADNc de B. subtilis (voir la figure 3) a été dilué 10, 100 et 1000 fois afin de tester les meilleurs résultats. Voie 1: M - marqueur de masse moléculaire (de haut en bas: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Voie 2: Réaction PCR avec le modèle dilué 10x. Voie 3: Réaction PCR avec le modèle dilué 100x. Voie 4: Réaction PCR avec le modèle dilué 1000x. Voie 5: (C-) - contrôle négatif (réaction sans modèle d'ADN). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Analyse des données et résultats

Note: Le produit PCR est séquencé à l'aide des amorces avant (ici 8F) et inverses (ici 1492R). Par conséquent, deux ensembles de séquences de données sont générés, l'un pour l'avant et l'autre pour l'amorce inversée. Pour chaque séquence, au moins deux types de fichiers sont générés : i) un fichier texte contenant la séquence d'ADN et ii) un chromatogramme d'ADN, qui montre la qualité de la séquence.

1. Pour l'apprêt avant, ouvrez le chromatogramme et examinez attentivement la séquence. Un chromatogramme idéal pour une séquence de qualité devrait avoir des pics espacés uniformément et peu ou pas de signaux de fond (Figure 5A).
2. Si le chromatogramme n'est pas de haute qualité, la séquence doit être jetée, ou le fichier texte de séquence doit être révisé en fonction des éléments suivants :
   1. La présence de doubles pics dans tout le chromatogramme indique la présence de plusieurs modèles d'ADN. Cela peut être le cas si la culture bactérienne n'était pas pure. Une telle séquence doit être écartée (Figure 5B).
   2. Un chromatogramme ambigu pourrait résulter de la présence de différents pics colorés au même endroit. L'une des erreurs les plus courantes est la présence de deux pics de couleur différents dans la même position et l'attribution inappropriée des bases par le logiciel de séquençage (Figure 5C). Corrigez manuellement les nucléotides mal assignés et modifiez-les dans le fichier texte.
   3. Les chromatogrammes à basse résolution peuvent entraîner des « pics larges » qui causent souvent un mauvais comptage des nucléotides dans ces régions (figure 5D). Cette erreur est difficile à corriger, et donc les inadéquations possibles dans l'étape d'alignement supplémentaire ne doivent pas être traitées comme fiables.
   4. Une mauvaise qualité de lecture du chromatogramme et la présence de pics multiples sont généralement observées aux extrémités de 5' et 3' de la séquence. Certains logiciels de séquenceur suppriment automatiquement ces fragments de mauvaise qualité (Figure 5E), et les nucléotides ne sont pas inclus dans le fichier texte. Si votre séquence n'a pas été tronquée automatiquement, déterminez les fragments de mauvaise qualité(par exemple signal faible, pics qui se chevauchent, perte de résolution) aux extrémités et supprimez les bases respectives du fichier texte.

Figure 5 : Exemples de dépannage du séquençage de l'ADN. A) Exemple d'une séquence de chromatogrammes de qualité (des pics uniformément espacés et sans ambiguïté). B) Séquence de mauvaise qualité qui se produit habituellement au début du chromatogramme. La zone grise est considérée comme de mauvaise qualité et automatiquement supprimée par le logiciel de séquençage. Plus de bases peuvent être coupées manuellement. C) Présence de double pics (indiqués par des flèches). Un nucléotide indiqué par la flèche rouge a été lu par le séquenceur comme "T" (pic rouge), mais le pic bleu est plus fort, et il peut également être interprété comme "C". D) Les pics de chevauchement indiquent une contamination par l'ADN(c.-à-d. plus d'un modèle). E) Perte de résolution et soi-disant « pics larges » (marqués par rectangle) qui empêchent l'appel de base fiable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Répétez 3.1 et 3.2 pour l'amorce inversée.
4. Enfin, assemblez les séquences avant et inverses en une séquence contigu. Une bonne exécution de séquençage donne une séquence de jusqu'à 1100 bp. Considérant que le produit PCR est de 1500 bp de long, les séquences obtenues à l'aide d'amorces avant et inverses devraient se chevaucher partiellement.
   1. Fusionner les deux séquences à l'aide du programme d'assemblage de séquences d'ADN, par exemple un outil gratuit comme CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Insérez les deux séquences en format EXPRES dans la case indiquée. Cliquez sur le bouton "Soumettre" et attendez que les résultats reviennent.
   3. Pour afficher la séquence assemblée appuyez sur "Contigs" dans l'onglet résultat. Pour voir les détails de l'alignement appuyez sur "Détails d'assemblage".
      Note 1 : Si le logiciel CAP3 est utilisé pour l'assemblage contig, il n'est pas nécessaire de convertir la séquence d'apprêt inverse en inverse-complémentaire; toutefois, cette étape peut être nécessaire si un autre programme est utilisé.
      Note 2 : Le format FASTA est un format textuel pour représenter la séquence de nucléotide. La première ligne (la ligne de description) dans un fichier FASTA commence par un symbole « 'gt;» suivi du nom ou d'un identifiant unique de la séquence. Suivant la ligne de description est la séquence de nucléotide. Collez vos séquences dans le format suivant :
      
      'gt;séquence'frw'primer
      coller votre séquence à partir du fichier texte ici
      'gt;séquence'rvs'primer
      coller votre séquence à partir du fichier texte ici
5. Effectuez une recherche dans une base de données en visitant le site Web pour l'outil de recherche local de base (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
   1. Sélectionnez l'outil "Nucléotide BLAST" pour comparer votre séquence à la base de données.
   2. Entrez votre séquence (le contig assemblé en 3.5) dans la boîte de texte "Séquence requête", puis sélectionnez la base de données "16S rRNA sequences (Bacteria et Archea)" dans le menu défilement vers le bas.
   3. Appuyez sur le bouton "BLAST" au bas de la page. Les séquences les plus similaires seront retournées. Un exemple de résultat BLAST est affiché dans la figure 6. Dans l'expérience présentée, le coup principal est la souche 168 de B. subtilis, montrant l'identité à 100 % avec la séquence disponible dans la base de données BLAST.
   4. Si le coup supérieur ne montre pas l'identité à 100%, allez à l'alignement et vérifiez les décalages. En cliquant sur le coup supérieur, vous serez dirigé vers les détails de l'alignement. Les nucléotides alignés seront rejoints par de courtes lignes verticales tandis que les nucléotides dépareillés ont un espace entre eux. Retournez au chromatogramme que vous avez reçu de la société de séquençage et révisez la séquence une fois de plus en mettant l'accent sur la région dépareillée. Corriger la séquence si des erreurs supplémentaires sont trouvées. Exécutez BLAST à nouveau en utilisant la séquence corrigée.

Figure 6 : Exemple du résultat de blast nucléotide. La séquence de gène de rRNA 16S de la culture pure de B. subtilis 168 a été employée comme séquence de requête. Le top hit montre 100% d'identité (souligné) à la souche B. subtilis 168, comme prévu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La Terre abrite des millions d’espèces bactériennes, chacune ayant des caractéristiques uniques. L’identification de ces espèces est essentielle à l’évaluation des échantillons environnementaux. Les médecins doivent également distinguer les différentes espèces bactériennes pour diagnostiquer les patients infectés.

Pour identifier les bactéries, diverses techniques peuvent être utilisées, y compris l’observation microscopique de la morphologie ou de la croissance sur un milieu spécifique pour observer la morphologie de la colonie. L’analyse génétique, une autre technique d’identification des bactéries, a gagné en popularité ces dernières années, en partie grâce au séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S.

Le ribosome bactérien est un complexe protéique ARN composé de deux sous-unités. La sous-unité 30S, la plus petite de ces deux sous-unités, contient l’ARNr 16S, qui est codé par le gène de l’ARNr 16S contenu dans l’ADN génomique. Des régions spécifiques de l’ARNr 16S sont hautement conservées, en raison de leur fonction essentielle dans l’assemblage des ribosomes. Alors que d’autres régions, moins critiques pour le fonctionnement, peuvent varier entre les espèces bactériennes. Les régions variables de l’ARNr 16S peuvent servir d’empreintes moléculaires uniques pour les espèces bactériennes, nous permettant de distinguer des souches phénotypiquement identiques.

Après l’obtention d’un échantillon de qualité d’ADNg, la PCR du gène codant pour l’ARNr 16S peut commencer. La PCR est une méthode de biologie moléculaire couramment utilisée, consistant en des cycles de dénaturation de la matrice d’ADN double brin, de recuit de paires d’amorces universelles, qui amplifient les régions hautement conservées du gène, et de l’extension des amorces par l’ADN polymérase. Alors que certaines amorces amplifient la plupart de l’ARNr 16S codant pour le gène, d’autres n’amplifient que des fragments de celui-ci. Après la PCR, les produits peuvent être analysés par électrophorèse sur gel d’agarose. Si l’amplification a réussi, le gel doit contenir une seule bande d’une taille attendue, en fonction de la paire d’amorces utilisée, jusqu’à 1500 pb, la longueur approximative du gène de l’ARNr 16S.

Après purification et séquençage, les séquences obtenues peuvent ensuite être saisies dans la base de données BLAST, où elles peuvent être comparées aux séquences d’ARNr 16S de référence. Comme cette base de données renvoie des correspondances basées sur la similitude la plus élevée, cela permet de confirmer l’identité des bactéries d’intérêt. Dans cette vidéo, vous observerez le séquençage du gène de l’ARNr 16S, y compris la PCR, l’analyse et l’édition de séquences d’ADN, l’assemblage de séquences et la recherche dans des bases de données.

Lors de la manipulation de micro-organismes, il est essentiel de suivre les bonnes pratiques microbiologiques, y compris l’utilisation de la technique aseptique et le port d’un équipement de protection individuelle approprié. Après avoir effectué une évaluation appropriée des risques pour le micro-organisme ou l’échantillon environnemental d’intérêt, obtenir une culture d’essai. Dans cet exemple, une culture pure de Bacillus subtilis est utilisée.

Pour commencer, cultivez votre micro-organisme sur un milieu adapté dans les conditions appropriées. Dans cet exemple, Bacillus subtilis 168 est cultivé dans un bouillon LB pendant la nuit dans un incubateur à agitation réglé à 200 tr/min à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez une trousse disponible dans le commerce pour isoler l’ADN génomique ou l’ADNg de 1,5 millilitre de culture de nuit de B. subtilis.

Pour vérifier la qualité de l’ADN isolé, mélangez d’abord cinq microlitres d’ADNg isolé avec un microlitre de colorant de chargement de gel d’ADN. Ensuite, chargez l’échantillon sur un gel d’agarose à 0,8 %, contenant un réactif de coloration de l’ADN, tel que SYBR safe ou EtBr. Après cela, chargez un étalon de masse moléculaire d’un kilobase sur le gel et exécutez l’électrophorèse jusqu’à ce que le colorant avant soit à environ 0,5 centimètre du bas du gel. Une fois l’électrophorèse sur gel terminée, visualisez le gel sur un transilluminateur à lumière bleue. L’ADNg doit se présenter sous la forme d’une bande épaisse, d’une taille supérieure à 10 kilobase et présenter un étalement minimal.

Après cela, pour créer des dilutions en série de l’ADNg, étiquetez trois tubes de microcentrifugation comme 10X, 100X et 1000X. Ensuite, à l’aide d’une pipette, versez 90 microlitres d’eau distillée stérile dans chacun des tubes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution d’ADNg dans le tube 10X. Pipetez tout le volume de haut en bas pour vous assurer que la solution est bien mélangée. Ensuite, retirez 10 microlitres de la solution du tube 10X et transférez-le dans le tube 100X. Mélangez la solution comme décrit précédemment. Enfin, transférez 10 microlitres de la solution dans le tube 100X, dans le tube 1000X.

Pour commencer le protocole PCR, décongelez les réactifs nécessaires sur de la glace. Ensuite, préparez le mélange maître PCR. Comme l’ADN polymérase est active à température ambiante, la réaction mise en place doit se produire sur de la glace. Aliquote 49 microlitres du mélange principal dans chacun des tubes PCR. Ensuite, ajoutez un microlitre de matrice dans chacun des tubes expérimentaux et un microlitre d’eau stérile dans le tube de contrôle négatif, en pipetant de haut en bas pour mélanger. Après cela, réglez la machine PCR selon le programme décrit dans le tableau. Placez les tubes dans le thermocycleur et démarrez le programme.

Une fois le programme terminé, examinez la qualité de votre produit par électrophorèse sur gel d’agarose, comme démontré précédemment. Une réaction réussie à l’aide du protocole décrit devrait produire une seule bande d’environ 1,5 kilobase. Dans cet exemple, l’échantillon contenant de l’ADNg dilué 100X a donné le produit de la plus haute qualité. Ensuite, purifiez le meilleur produit PCR, dans ce cas, l’ADNg 100X, avec un kit disponible dans le commerce. Le produit PCR peut maintenant être envoyé pour le séquençage.

Dans cet exemple, le produit de PCR est séquencé à l’aide d’amorces directes et inverses. Ainsi, deux ensembles de données, contenant chacun une séquence d’ADN et un chromatogramme d’ADN, sont générés : l’un pour l’amorce directe et l’autre pour l’amorce inverse. Tout d’abord, examinez les chromatogrammes générés à partir de chaque amorce. Un chromatogramme idéal doit avoir des pics régulièrement espacés avec peu ou pas de signaux de fond.

Si les chromatogrammes présentent des pics doubles, il se peut que plusieurs matrices d’ADN aient été présentes dans les produits de PCR et que la séquence soit éliminée. Si les chromatogrammes contenaient des pics de couleurs différentes au même endroit, le logiciel de séquençage a probablement appelé à tort nucléotides. Cette erreur peut être identifiée et corrigée manuellement dans le fichier texte. La présence de larges pics dans le chromatogramme indique une perte de résolution, ce qui entraîne une erreur de comptage des nucléotides dans les régions associées. Cette erreur est difficile à corriger et les incohérences dans l’une ou l’autre des étapes ultérieures doivent être considérées comme non fiables. Une mauvaise qualité de lecture du chromatogramme, indiquée par la présence de plusieurs pics, se produit généralement aux cinq extrémités premières et aux trois extrémités premières de la séquence. Certains programmes de séquençage suppriment automatiquement ces sections de mauvaise qualité. Si votre séquence n’a pas été tronquée automatiquement, identifiez les fragments de mauvaise qualité et supprimez leurs bases respectives du fichier texte.

Utilisez un programme d’assemblage d’ADN pour assembler les deux séquences d’amorces en une seule séquence continue. N’oubliez pas que les séquences obtenues à l’aide d’amorces avant et arrière doivent se chevaucher partiellement. Dans le programme d’assemblage d’ADN, insérez les deux séquences au format FASTA dans la boîte appropriée. Ensuite, cliquez sur le bouton Soumettre et attendez que le programme renvoie les résultats.

Pour visualiser la séquence assemblée, cliquez sur Contigs dans l’onglet résultats. Ensuite, pour afficher les détails de l’alignement, sélectionnez Détails de l’assemblage. Accédez au site Web de l’outil de recherche d’alignement local de base, ou BLAST, et sélectionnez l’outil BLAST de nucléotide pour comparer votre séquence à la base de données. Entrez votre séquence dans la zone de texte de la séquence de requête et sélectionnez la base de données appropriée dans le menu déroulant. Enfin, cliquez sur le bouton BLAST en bas de la page et attendez que l’outil renvoie les séquences les plus similaires de la base de données.

Dans cet exemple, la souche 168 de B. subtilis est la souche 168, qui présente une identité de 100 % avec la séquence dans la base de données BLAST. Si le résultat le plus élevé n’indique pas une identité de 100 % par rapport à l’espèce ou à la souche attendue, cliquez sur la séquence qui correspond le mieux à votre requête pour voir les détails de l’alignement. Les nucléotides alignés seront reliés par de courtes lignes verticales et les nucléotides non appariés auront des espaces entre eux. En vous concentrant sur les régions non appariées identifiées, révisez la séquence et répétez la recherche BLAST si vous le souhaitez.