Tests de sensibilité aux antibiotiques : Utilisation du ETEST pour déterminer la CMI de deux antibiotiques et évaluer la synergie des antibiotiques

1. Tests d'epsilomètre (E-tests)

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire
   2. Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol
   3. Recueillir les plaques d'agar Mueller-Hinton (plaques MHA)
2. Préparation d'une norme de turbidité McFarland no 0.5
   1. Préparer une solution de 1% de chlorure de baryum (BaCl_2):
      Ajouter 1 gramme de chlorure de baryum anhydre (BaCl₂) dans 100 ml d'eau distillée. Vortex bien.
   2. Préparer une solution de 1% d'acide sulfurique (H₂SO_4):
      Ajouter 1 ml de H₂SO₄ concentré dans 99 ml d'eau distillée. Vortex bien.
   3. Préparer une norme de turbidité McFarland no 0.5 :
      50 l Solution BaCl₂ en 5 ml de 1% H₂SO₄ solution. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide.
   4. Gardez la norme de turbidité McFarland no 0.5 dans un tube recouvert de papier d'aluminium. Conserver à 25oC pendant un maximum de 6 mois. Vortex bien à une solution homogène avant utilisation.
3. Préparation des plaques MHA
   1. Scrape Streptococcus groupe G bactéries de la plaque d'agar de sang à l'aide d'une boucle stérile. Mélanger dans 1mL de salin, et le vortex à une suspension de la bactérie.
   2. Comparez la suspension à une norme McFarland no 0.5 pour obtenir la même turbidité afin d'avoir la même taille d'inoculum pendant les expériences. Ajuster la concentration à l'aide d'un salin ou d'une bactérie supplémentaire.
   3. Inoculer les plaques MHA à l'aide d'un applicateur à pointe de coton stérile. Écouvillons la plaque délicatement pour couvrir la surface. Procédez avec l'une des trois méthodes décrites ci-dessous (1.4-1.6).
4. Test unique de résistance aux antibiotiques. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G ou gentamicine 
   1. Placez une bande d'essai E (pénicilline G ou gentamicine) au centre de la plaque MHA (figure 1 A,B).
   2. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
   3. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai d'antibiotiques notée (Figure 1 C,D).

Figure 1 : Test électronique unique. Placement d'une bande E-test de A) pénicilline G et B) gentamicine sur une plaque d'agar Mueller Hinton recouverte de colonies bactériennes d'un groupe G streptocoques avant (A et B) et après (C et D) du jour au lendemain incubation à 37oC 5% CO₂. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Test de synergie inter-approche. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.
   1. Placez deux bandes d'essai Électronique avec différents antibiotiques (p. ex. pénicilline G et gentamicine) sur la plaque MHA inoculée dans une formation croisée.
      1. Pour obtenir les résultats les plus précis, visez à placer la croix à un angle d'environ 90 degrés à l'intersection des échelles à leurs valeurs MIC, précédemment déterminées à l'essai unique de résistance aux antibiotiques (figure 2 A).
      2. Notez qu'une fois que les bandes sont placées sur la plaque d'agar, elles ne doivent pas être déplacées, puisque certains antibiotiques peuvent déjà avoir été absorbés par la plaque. Par conséquent, il est plus approprié de maintenir les bandes à un angle légèrement erroné (p. ex. 85 degrés) et jusqu'à 1-2 mm de la valeur réelle du MIC. Il est conseillé d'exécuter l'expérience en triplicate pour réduire ce problème.
   2. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
   3. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 2 B).
   4. Utilisez la formule pour la concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) (Équation 1) afin de déterminer la synergie.

Figure 2 : Détection du synergisme - test croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'est fait au MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe G de Streptococcus avant (A) et après (B) l'incubation pendant la nuit à 37 oC 5 % CO₂. Un angle de 90 degrés est formé entre les deux valeurs MIC individuelles (pénicilline G : 0,094 g/mL, gentamicine : 8 g/mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

6. Approche non croisée de test de synergie. Streptococcus groupe G, résistance à la pénicilline G et gentamicine.
   1. Placez la bande e-test au centre de la plaque MHA (Figure 3 A,D).
   2. Marquez l'endroit où la valeur MIC précédemment déterminée se trouvait sur chaque bande.
   3. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   4. Jeter la bande d'essai E pour chaque plaque MHA (Figure 3 B,E).
   5. Placez la deuxième bande d'essai électronique (contenant un antibiotique différent) sur la zone de la bande enlevée antérieure respectivement afin que leurs valeurs MIC correspondent à la marque et soient alignées.
   6. Incuber pendant 18-20 heures, 37oC.
   7. Lisez les résultats. Le MIC est mesuré comme la zone d'inhibition qui croise la bande d'essai antibiotique notée sur chaque bande de test Électronique respective (figure 3 C,F).
   8. Afin de déterminer la synergie, la formule de concentration inhibitrice fractionnaire (FIC) est utilisée (Équation 1).

Figure 3 : Détection du synergisme - test non croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'estconcentré sur le MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe De Streptococcus G. A) bande de gentamicin (8 g/mL centré) au-dessus de la bactérie du groupe G de Streptococcus, B) Enlèvement de la bande de gentamicine, C ) Bande combinée de gentamicine / pénicilline G (0,094 g/mL centré) au-dessus de la bactérie Streptococcus groupe G, D) penicilline G bande (0,094 g/mL centré), E) Enlèvement de la penicilline G bande, F) Pénicilline combinée G / la bande de gentamicine (8 g/mL centré) sur le dessus des bactéries du groupe G de Streptococcus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Test de bouillon

1. arrangement
   1. Portez des gants et une blouse de laboratoire
   2. Préparer l'espace de travail en le stérilisant à l'aide de 70 % d'éthanol
   3. Recueillir 15mL de bouillon MH avec 50% de sang de cheval lysé et 20 mg/mL de NAD (MH-F)
2. (Facultatif) Effectuer un e-test [Protocole 1] pour déterminer le MIC sur le milieu solide
   1. Bien qu'elles soient facultatives, ces connaissances permettront une meilleure conception expérimentale (p. ex., les concentrations d'antibiotiques ajoutés peuvent être conçues pour entourer la valeur du MIC déterminée à partir de la plaque), ce qui améliorera les chances d'une expérience réussie.
3. Préparation d'un inoculum bactérien. Comme indiqué ci-dessus, la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD nm ou des normes de turbidité McFarland
   1. Méthode OD600 nm
      1. Obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie
      2. Diluer la culture dans le bouillon MH-F pour obtenir un OD600 de 0,003
   2. Méthode de turbidité McFarland
      1. Mettre 15 ml de bouillon MH-F dans un tube stérile.
      2. Inoculer le bouillon MH-F avec des bactéries (d'une assiette) à un niveau McFarland. Vortex la solution vigoureusement. Verser la solution dans un plat stérile Petri.
4. Préparation des antibiotiques
   1. Déterminer la concentration d'antibiotiques souhaitées
      1. Identifier la valeur du MIC à partir du test E (p. ex. 0,125 g/mL pour la pénicilline G et 8 g/mL pour la gentamicine)
      2. Multipliez la valeur MIC de la plaque d'agar par 2⁴-2⁷, correspondant à quatre-sept dilutions en série 2x. Ce sera la concentration de départ d'antibiotiques. (ex. pour la pénicilline G, sept dilutions en série 2x : 0,125 g/mL x 2⁷ à 16 g/mL; pour la gentamicine, quatre dilutions en série 2x 8 g/mL x 2⁴ x 128 g/mL
      3. Multiplier la valeur de départ souhaitée 100x afin de déterminer générer une concentration en stock des antibiotiques (p. ex. stocks de 1,6 mg/mL de pénicilline G et de 12,8 mg/mL de gentamicine)
   2. Préparer une concentration de 100x stocks d'antibiotiques en conséquence
      1. Dissoudre les antibiotiques dans 10mL d'eau autoclaved, et le vortex pour générer une solution de stock (par exemple 16 mg de pénicilline G et 128 mg de gentamicine pour créer les stocks ci-dessus)
5. Ajouter des bactéries aux puits microplaques
   1. Aliquot 200 le bouillon MH-F contenant des bactéries inoculum aux puits dans les 3 premières rangées d'une plaque de microtiter de 96 puits pour une expérience dans le triplicate.
6. Ajouter des antibiotiques aux puits microplaques
   1. Ajouter 200 l de bouillon MH-F supplémentaire avec des bactéries à la première colonne de puits (A1, B1, C1) pour porter le volume total à 400 l.
   2. Ajouter 4 ll de la concentration en stock d'antibiotiques à la première colonne de puits. Étant donné que l'échantillon contient 400 L, il se traduira par une dilution 100x des antibiotiques.
   3. Générez une dilution en série 2x en transférant 200 bactéries/antibiotiques de A1 à A2, jusqu'à A11. Pipet vigoureusement entre les dilutions. Répétez l'étape pour des lignes supplémentaires.
   4. Retirez 200 L de la colonne 11 afin que le volume final dans tous les puits soit de 200 l.
   5. Laissez la dernière colonne (A12, B12, C12) sans antibiotiques, comme contrôles.
7. Déterminer les valeurs du MIC
   1. Incuber la plaque microtiter de 96 puits pendant 24 heures à 37oC sans trembler.
   2. La valeur du MIC est définie comme le dernier puits de la série de dilution qui ne présente aucune croissance visible des bactéries (figure 4). Cette valeur, cependant, ne peut être digne de confiance que si la taille d'inoculum d'origine était correcte.

Figure 4 : Détermination du MIC par dilution du bouillon. MIC est ici défini comme le dernier puits qui montre la clarté (pas de croissance des bactéries) avant qu'il ne change la turbidité. Les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la pénicilline G et les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la gentamicine, à la fois par rapport à un isolat du groupe Streptococcus G. A) résultat expérimental réel, B) interprétation schématique des valeurs de A ( gris et pas de croissance; blanc et la croissance). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Procédure schématique de la série de dilution pour compter la concentration originale des bactéries. Les dilutions ont été effectuées telles que décrites (20 l diluées dans 180 l pour une série de dilution 10x), puis 10 L des rangées A-H sont plaquées sur deux plaques d'agar de sang distinctes comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

8. Déterminer la taille originale de l'inoculum
   REMARQUE: Les essais de microbroth sont très sensibles pour la taille originale d'inoculum utilisée. Une taille excessive d'inoculum donnera un résultat faussement positif, puisque les antibiotiques ajoutés ne pourront plus inhiber la croissance à ce ratio. Par conséquent, il est essentiel de vérifier combien de bactéries ont été ajoutées aux micropuits. Bien que les données ne soient pas disponibles au moment de l'expérience (en raison du besoin d'incubation de 24 heures), elles serviront de contrôle. Si le nombre de bactéries ajoutées se situe dans la plage de concentration indiquée, les valeurs MIC peuvent être fiables. Si l'inoculum était trop haut ou trop bas, l'expérience doit être répétée.
   1. Diluer en série les bactéries
      1. Préparer une plaque de microtiter de 96 puits pour diluer la concentration bactérienne d'origine afin de déterminer la taille de l'inoculum. L'optimum est un volume de 200 L avec 10^5-6 bactéries. Pour effectuer les dilutions, d'abord aliquot 180 L stérile PBS à chaque puits en B-H (en triple1-3).
      2. Ensuite, ajoutez 100 'l de solution bactérienne à A (en triplicate 1-3).
      3. Générer une dilution en série 10x (en triplicate) en transférant 20 bactéries de A à B, pipet vigoureusement. Répétez les étapes pour C-H.
   2. Plaquer les dilutions bactériennes pour la détermination de la taille de l'inoculum
      1. Marquez les plaques d'agar de sang selon la figure 5.
      2. Transférer 10 l de la dilution en série à la plaque selon la figure 5.
      3. Incuber la plaque à 37oC pendant 20-24 heures.
   3. Déterminer la taille de l'inoculum bactérien
      1. Compter les nombres bactériens dans les endroits dans les colonies de 5-50 (figure 6).
      2. Calculer la taille initiale de l'inoculum en calculant la moyenne des échantillons triplicate, multiplier par le facteur de dilution (par exemple 10x pour les échantillons B, 100x pour les échantillons C, 1000x pour les échantillons D, etc.) et ensuite par 100 pour compenser le volume de repérage de 10 L, ce qui a pour résultat le taille de l'inoculum en cfu/mL. Si l'inoculum est dans 10^5-6 cfu/mL les données MIC peuvent être fiables.

Figure 6 : Détermination de la taille de l'inoculum. Les bactéries inoculées selon la figure 5 ont été incubées pendant 20-24 heures à 37oC, puis comptées. La rangée D compte un bon nombre de colonies (p. ex. 5-50). Les échantillons en A ne sont pas dilués, B est dilué 10x, C est dilué 100x, et D est dilué 1000x, et seulement 10 L est plaqué dans chaque endroit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.