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Source: Anna Blàckberg1, Rolf Lood1
1 Département des sciences cliniques Lund, Division de médecine de l'infection, Centre biomédical, Université de Lund, 221 00 Lund Suède
La connaissance des interactions entre les antibiotiques et les bactéries est importante pour comprendre comment les microbes évoluent la résistance aux antibiotiques. En 1928, Alexander Fleming découvre la pénicilline, un antibiotique qui exerce sa fonction antibactérienne en interférant avec la régénération de la paroi cellulaire (1). D'autres antibiotiques avec divers mécanismes d'action ont été découverts par la suite, y compris des médicaments qui inhibent la réplication de l'ADN et la traduction des protéines chez les bactéries; cependant, aucun nouvel antibiotique n'a été développé ces dernières années. La résistance aux antibiotiques actuels a augmenté, ce qui a entraîné des maladies infectieuses graves qui ne peuvent pas être traitées efficacement (2). Ici, nous décrivons plusieurs méthodes pour évaluer la résistance aux antibiotiques dans les populations bactériennes. Chacune de ces méthodes fonctionne, quel que soit le mécanisme d'action des antibiotiques utilisés, parce que la mort bactérienne est le résultat mesuré. La résistance aux antibiotiques est non seulement rapidement disséminée spécifiquement dans les milieux hospitaliers, mais aussi dans toute la société. Afin d'étudier de tels moyens de résistance, différentes méthodes ont été développées, y compris le test Epsilomètre (E-test) et le test de dilution du bouillon (3).
Le test électronique est une méthode bien établie et un outil rentable qui quantifie les données de concentration inhibitrice minimale (MIC), la plus faible concentration d'un antimicrobien qui inhibe la croissance visible d'un micro-organisme. Selon la souche bactérienne et les antibiotiques utilisés, la valeur du MIC peut varier entre le sous-g/mL et le 4. Le test Électronique est effectué à l'aide d'une bande de plastique contenant un gradient antibiotique prédéfini, qui est imprimé avec l'échelle de lecture du MIC en 'g/mL. Cette bande est directement transférée sur la matrice d'agar lorsqu'elle est appliquée sur la plaque d'agar inoculée. Après l'incubation, une zone d'inhibition elliptique symétrique est visible le long de la bande à mesure que la croissance bactérienne est empêchée. LE MIC est défini par la zone d'inhibition, qui est le point de terminaison où l'ellipse croise la bande. Une autre méthode courante pour déterminer LE MIC est la méthode de dilution des microbroths. La dilution du microbroth incorpore différentes concentrations de l'agent antimicrobien ajouté à un milieu bouillon contenant des bactéries inoculées. Après l'incubation, le MIC est défini comme la plus faible concentration d'antibiotiques qui empêche la croissance visible (5). Il s'agit également d'une méthode quantitative qui peut être appliquée à plusieurs bactéries. Les inconvénients de cette méthode comprennent la possibilité d'erreurs lors de la préparation des concentrations des réactifs et le grand nombre de réactifs requis pour l'expérience. La mesure de la résistance aux antibiotiques est impérative du point de vue clinique et de la recherche, et ces méthodes in vitro d'étude de la résistance sont discutées et présentées ci-dessous.
Le profil de résistance pour une bactérie spécifique peut être appliqué afin d'optimiser le traitement antibiotique afin de déterminer si un patient bénéficierait d'un traitement combiné par rapport à un traitement unique. Pour l'utilisation de plus d'un antibiotique à la fois, il est impératif de connaître leurs interactions les uns avec les autres et s'ils ont un effet additif, synergique ou antagoniste. Un effet additif peut être vu lorsque l'effet articulaire des antibiotiques équivaut à la puissance des antibiotiques individuels administrés à dose égale. La synergie entre les antibiotiques, d'autre part, est présente lorsque l'effet articulaire des antibiotiques est plus puissant que si le médicament serait administré seul (6). L'application de combinaisons de traitement antimicrobien est utilisée pour éviter l'apparition de la résistance aux antimicrobiens afin d'améliorer l'effet du traitement antibiotique individuel (7). La connaissance de l'antagonisme est également aussi importante pour prévenir l'utilisation inutile de combinaisons d'antimicrobiens. La méthodologie de test électronique offre des moyens simples et de plusieurs façons de déterminer la synergie et l'antagonisme possibles entre les différents agents antimicrobiens. Afin de faire face à la prolifération des agents pathogènes résistants aux antibiotiques, la connaissance des mécanismes synergiques et antagonistes possibles de certains antibiotiques est importante, ce qui entraîne une efficacité clinique et lutte contre la multirésistance aux médicaments.
La détermination de la synergie à l'aide des tests e peut être divisée en deux approches générales : les tests croisés et non croisés. Bien que les deux tests de synergie s'appuient sur la connaissance antérieure des valeurs individuelles du MIC, les deux approches sont légèrement différentes en méthodologie et en approche conceptuelle. Dans un test de synergie non croisé, le premier antibiotique de la paire à être testé est placé sur une plaque d'agar inoculée avec des bactéries. Après avoir permis aux antibiotiques de la première bande infuser la plaque (par exemple après 1 heure), la bande est enlevée et une nouvelle bande contenant le deuxième antibiotique est placé au même endroit que le premier, en veillant à placer les deux valeurs MIC individuelles sur le dessus de chaque ot son. La zone d'inhibition qui en résulte peut ensuite être analysée comme décrite ci-dessus, et la synergie calculée sur la base de l'équation 1.
Équation 1 - Concentrations inhibitrices fractionnelles (FIC)
Les valeurs de la marque sont des valeurs qui démontrent une synergie.
Tout en récompensant l'examinateur avec des plaques faciles à analyser, la méthode est un peu laborieuse et longue en raison du changement de bandes, ainsi que la nécessité d'utiliser deux plaques par expérience. Au lieu de cela, un test croisé est souvent utilisé. Au lieu d'ajouter les deux bandes d'essai E différentes par la suite sur l'autre (après
l'enlèvement de la première), les deux sont placés simultanément, mais sous la forme d'une croix (angle de 90 degrés), avec les deux valeurs MIC précédemment déterminées formant l'angle de 90 degrés. Par cette approche, une seule plaque est nécessaire par test de synergie, ainsi que moins de travail, ce qui en fait un choix préféré en dépit d'être un peu plus difficile à analyser. Les nouvelles valeurs du MIC dans l'approche combinée des antibiotiques peuvent être visualisées comme les zones d'inhibition modifiées, après quoi la synergie peut être déterminée par l'équation 1.
Au lieu d'utiliser une approche de plaque d'agar, une approche de microbroth peut souvent être préférentielle en raison de sa plus grande flexibilité (par exemple, la capacité de choisir des concentrations spécifiques d'antibiotiques en dehors des limites d'une bande de test électronique). En outre, les tests de microbroth sont suggérés pour être plus sensibles en raison de leur distribution uniforme d'antibiotiques dans une solution liquide, ne dépend pas de la dissociation dans une phase solide (plaque d'agar). Les puits dans une microplaque de 96 puits seront inoculés avec un nombre fixe de bactéries (106 cfu/mL : la concentration bactérienne peut être estimée par des mesures OD600 nm, des normes de turbidité, ou par des échantillons de placage de 10x dilutions bactériennes en série), et antibiotiques dans différentes dilutions seront ajoutés aux puits. De même, pour les bandes e-test MIC est déterminé comme l'intersection (bien / spot) avec la plus faible concentration d'antibiotiques inhibant la croissance visible des bactéries.
Objectif expérimental
Matériaux
Remarque : Les médias spécifiques utilisés pour la croissance bactérienne peuvent varier selon les espèces.
1. Tests d'epsilomètre (E-tests)
Figure 1 : Test électronique unique. Placement d'une bande E-test de A) pénicilline G et B) gentamicine sur une plaque d'agar Mueller Hinton recouverte de colonies bactériennes d'un groupe G streptocoques avant (A et B) et après (C et D) du jour au lendemain incubation à 37oC 5% CO2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Détection du synergisme - test croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'est fait au MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe G de Streptococcus avant (A) et après (B) l'incubation pendant la nuit à 37 oC 5 % CO2. Un angle de 90 degrés est formé entre les deux valeurs MIC individuelles (pénicilline G : 0,094 g/mL, gentamicine : 8 g/mL). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Détection du synergisme - test non croisé. Résultats des tests de synergie antimicrobienne s'estconcentré sur le MIC de la pénicilline G et de la gentamicine sur le groupe De Streptococcus G. A) bande de gentamicin (8 g/mL centré) au-dessus de la bactérie du groupe G de Streptococcus, B) Enlèvement de la bande de gentamicine, C ) Bande combinée de gentamicine / pénicilline G (0,094 g/mL centré) au-dessus de la bactérie Streptococcus groupe G, D) penicilline G bande (0,094 g/mL centré), E) Enlèvement de la penicilline G bande, F) Pénicilline combinée G / la bande de gentamicine (8 g/mL centré) sur le dessus des bactéries du groupe G de Streptococcus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Test de bouillon
Figure 4 : Détermination du MIC par dilution du bouillon. MIC est ici défini comme le dernier puits qui montre la clarté (pas de croissance des bactéries) avant qu'il ne change la turbidité. Les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la pénicilline G et les lignes sont des doublons de la valeur MIC de la gentamicine, à la fois par rapport à un isolat du groupe Streptococcus G. A) résultat expérimental réel, B) interprétation schématique des valeurs de A ( gris et pas de croissance; blanc et la croissance). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Procédure schématique de la série de dilution pour compter la concentration originale des bactéries. Les dilutions ont été effectuées telles que décrites (20 l diluées dans 180 l pour une série de dilution 10x), puis 10 L des rangées A-H sont plaquées sur deux plaques d'agar de sang distinctes comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Détermination de la taille de l'inoculum. Les bactéries inoculées selon la figure 5 ont été incubées pendant 20-24 heures à 37oC, puis comptées. La rangée D compte un bon nombre de colonies (p. ex. 5-50). Les échantillons en A ne sont pas dilués, B est dilué 10x, C est dilué 100x, et D est dilué 1000x, et seulement 10 L est plaqué dans chaque endroit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La susceptibilité aux antibiotiques est définie comme la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques et peut être mesurée à l'aide d'un test de dilution du bouillon ou d'un test d'epsilomètre, également appelé E-test.
Dans la méthode de dilution du bouillon, un nombre normalisé de bactéries sont ajoutés à un milieu de croissance contenant des dilutions antibiotiques en série. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se développer à des concentrations plus élevées d'antibiotiques, mais continuent de se multiplier aux concentrations d'antibiotiques les plus faibles, ce qui entraîne la turbidie des médias. La plus faible concentration d'antibiotiques à laquelle les bactéries ne peuvent plus survivre ou se multiplier est appelée la concentration inhibitrice minimale, ou MIC, valeur de l'antibiotique pour les bactéries données.
Dans un E-test, une bande de plastique imprégnée d'un gradient prédéfini d'antibiotique est appliquée sur une pelouse fraîchement répandue de bactéries sur une agar Mueller-Hinton, ou MH-A, plaque Petri. L'antibiotique se diffuse dans le support d'agar, où il est pris par les bactéries. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se multiplier et mourront, formant une zone claire autour de la bande Électronique, qui est appelée zone d'inhibition de la croissance. Au point où la croissance se croise avec la bande Électronique, la valeur correspondante sur l'échelle donne la valeur MIC de l'antibiotique.
Souvent, les antibiotiques sont utilisés en combinaison pour empêcher l'émergence de souches résistantes aux antibiotiques de bactéries. Il en résulte souvent un effet synergique plutôt qu'additif. Synergique signifie que l'effet combiné des deux antibiotiques est plus grand que la somme de leurs activités individuelles. Cependant, l'effet n'est considéré comme significatif que lorsque la valeur MIC de la combinaison d'antibiotiques diminue d'au moins deux fois. Ce critère est évalué en calculant l'indice de concentration inhibitrice fractionnaire, ou FIC. En résumant le rapport du MIC de chaque antibiotique en combinaison avec le MIC de chaque antibiotique individuellement, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie.
La synergie antibiotique peut être mesurée à l'aide de deux méthodes basées sur l'e-test : un test non croisé ou un test croisé. Dans un test non croisé, premièrement, les e-bandes pour deux antibiotiques différents avec des valeurs MIC prédéterminées sont appliquées à deux plaques distinctes. Une fois que les antibiotiques se sont diffusés dans le milieu, les e-bandes d'origine sont enlevées et les E-bandes pour les antibiotiques alternatifs sont placées de telle sorte que leurs écailles de MIC se trouvent exactement sur les échelles de MIC des bandes précédentes. Dans un test croisé, qui est une version plus rapide de l'essai non croisé, les E-bandes des deux antibiotiques sont placées ensemble dans une formation croisée, de sorte que les écailles de leurs marques MIC forment un angle de 90 degrés à l'intersection. Après l'incubation dans les deux techniques, la valeur MIC de chaque antibiotique en combinaison avec l'autre antibiotique est lue au point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec le bord de la bande Électronique. Ensuite, l'indice FIC est calculé.
Cette vidéo démontrera comment déterminer la valeur MIC d'un antibiotique donné pour une bactérie donnée à l'aide d'un test électronique et d'un test de dilution micro bouillon. Vous apprendrez également comment déterminer la synergie entre deux antibiotiques à l'aide d'un test croisé et d'un test non croisé.
Pour commencer, mettez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Ensuite, recueillir 15 millilitres de bouillon stérile Mueller-Hinton avec 50% de sang de cheval lysé et 20 milligrammes par millilitre de bêta-nicotinamide. Et cinq à huit plaques d'agar Mueller-Hinton. Maintenant, pour préparer un numéro standard de turbidité McFarland 0.5, mesurez 9.95 millilitres de solution d'acide sulfurique de 1%. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de 1% de chlorure de baryum solution à la solution d'acide sulfurique. Vortex la solution bien pour obtenir une suspension turbide. Couvrir le tube de papier d'aluminium et le réserver. Ensuite, dispenser un millilitre de solution saline dans un tube de 15 millilitres.
Utilisez une boucle stérile pour gratter un échantillon de la croissance bactérienne de votre plaque d'essai bactérienne, ici, Streptococcus groupe G. Ensuite, placez la boucle chargée de bactéries dans la solution saline, remuer doucement, puis vortex le tube bien. Maintenant, placez la suspension bactérienne et les normes de turbidité McFarland côte à côte et comparez-les pour l'équivalence de turbidité. Ajouter des colonies saline ou bactériennes supplémentaires jusqu'à ce que la turbidité de la suspension bactérienne corresponde à celle de la norme. Une fois que la turbidité désirée est obtenue, trempez un applicateur stérile de pointe de coton dans la suspension bactérienne. Pour inoculer la plaque MH-A, tamponnez doucement toute la surface de la plaque avec un mouvement en zigzag. Ensuite, étiquetez les côtés inférieurs des plaques avec le nom de la bactérie et la date.
Pour commencer, sortir une bande de pénicilline G E-test, en la tenant par le bord avec des forceps. Placez délicatement la bande au centre de la plaque MH-A fraîchement tamponnée et remplacez le couvercle. Dans cet exemple, un deuxième antibiotique, la gentamicine, est également testé. Ainsi, le processus de placement de bande est répété avec la deuxième plaque et une bande de e-test de gentamicine. Pour déterminer les résultats du test E, collectez la première plaque qui contient la bande de test G E de la pénicilline. Maintenant, déterminez le point où la zone d'inhibition se croise avec la bande d'antibiotiques. Lisez la valeur numérique correspondante sur l'échelle. Cette valeur représente la valeur MIC de la pénicilline G. Déterminer la valeur MIC pour la gentamicine de la même manière.
Pour commencer, inoculer une plaque MH-A avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus. Étiquetez le fond de la plaque avec le nom des bactéries, des antibiotiques à utiliser et de la date. Maintenant, placez une bande d'essai e pour l'antibiotique d'intérêt dans le centre de la plaque. Ensuite, maintenez la deuxième bande d'essai à un angle de 90 degrés à la première bande et localisez sa marque MIC. Pose doucement la deuxième e-bande sur la première au point où les deux valeurs MIC se croisent. Une fois les bandes placées, ne les déplacez pas. Ensuite, incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.
Après avoir inoculé deux plaques MH-A, avec des bactéries souches du groupe G de Streptococcus, placez une bande d'essai E pour un antibiotique à la surface d'une plaque. Ensuite, placez une bande d'essai électronique pour l'autre antibiotique sur la deuxième plaque comme démontré. À l'aide d'une boucle d'inoculation en plastique, marquez la valeur MIC de chaque antibiotique à la surface de sa plaque respective. Ensuite, couvrez les assiettes et incuber à température ambiante pendant une heure. Après cela, utilisez des forceps pour enlever les bandes E. Ensuite, collectez l'une des plaques et une bande de test E pour l'autre antibiotique. Maintenez la bande E-test sur l'empreinte laissée par la première bande et localisez le point où la valeur MIC sur la bande E s'aligne avec la ligne marquée. Placez délicatement la bande à ce point d'intersection. Répétez ce processus pour la deuxième plaque et incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.
Tout d'abord, obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie et diluer la culture dans le bouillon MHF pour atteindre un OD600 de 0,003. Ensuite, peser 16 milligrammes de pénicilline G et 128 milligrammes de gentamicine. Transférer chaque antibiotique sec pesé dans des tubes coniques de 215 millilitres. Ajouter 10 millilitres d'eau distillée à chacun des tubes coniques et bien mélanger par vortex. Étiqueter les tubes avec le nom et la concentration des antibiotiques.
En effectuant l'analyse en triplicate, ajouter 400 microlitres de la solution bactérienne de travail dans les premiers puits de trois rangées d'une plaque de microtimètre de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution bactérienne de travail dans le bouillon MHF aux puits des trois rangées. Maintenant, pour générer une dilution antibiotique en série double, d'abord ajouter quatre microlitres de stock d'antibiotiques au premier puits, générant une dilution 100 fois. Séquentiellement, transférer 200 microlitres de bactéries-antibiotique solution à chaque puits, à partir du premier puits à travers le puits deuxième à dernier dans chaque rangée, assurer un bon mélange par pipetting deux à trois fois après chaque transfert. Jetez les 200 derniers microlitres de solution bactéries-antibiotiques.
Pour déterminer les résultats du test de micro dilution du bouillon pour la pénicilline G, localiser d'abord les puits qui ne présentent aucune croissance bactérienne visible, indiquée par un manque de turbidité. À partir de ces puits, identifiez le puits avec la plus faible concentration d'antibiotiques. Cela représente la valeur MIC de la pénicilline G pour les bactéries testées. La valeur MIC de la gentamicine peut être déterminée en utilisant le même résultat et la même technique.
Pour déterminer les résultats de l'essai non croisé, collectez la première plaque, qui contient une bande de pénicilline G E. Ensuite, déterminez le point où la zone d'inhibition de la croissance se croise avec la bande d'antibiotiques. La valeur correspondante sur l'échelle représente la valeur MIC pour la pénicilline G en combinaison avec la gentamicine. Dans cet exemple, la valeur MIC en combinaison est de 0,064 microgramme par millilitre.
Maintenant, recueillir la deuxième plaque, qui contient la bande E gentamicine, et de déterminer la valeur MIC en combinaison comme précédemment démontré. Pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez d'abord la concentration inhibitrice fractionnaire ou FIC pour la pénicilline G en divisant le MIC en combinaison par le MIC de l'antibiotique seul. Répétez ce processus pour la gentamicine. Ensuite, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Une réduction de deux fois de la valeur du MIC en combinaison donne une valeur de l'indice FIC inférieure ou égale à 0,5 et démontre une synergie entre la pénicilline G et la gentamicine. Dans ce cas, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Ainsi, les résultats ne démontrent pas de synergie entre la pénicilline G et la gentamicine avec la souche Streptococcus groupe G.
Pour déterminer les résultats de l'essai croisé, déterminez d'abord le point où les zones d'inhibition de la croissance se croisent avec leurs bandes E respectives. Lisez la valeur numérique sur chaque bande de test Électronique qui correspond à ce point d'intersection. Ces valeurs représentent la valeur MIC en combinaison pour la pénicilline G et la gentamicine. Ensuite, pour évaluer l'effet de la combinaison, calculez l'indice FIC à l'aide de l'équation indiquée ici. Dans cet exemple, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Cela signifie que la pénicilline G et la gentamicine n'agissent pas en synergie contre la souche Streptococcus du groupe G.
La sensibilité aux antibiotiques est définie comme la sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques et peut être mesurée à l’aide d’un test de dilution en bouillon ou d’un test Epsilometer, également appelé test E.
Dans la méthode de dilution en bouillon, un nombre standardisé de bactéries est ajouté à un milieu de croissance contenant des dilutions d’antibiotiques en série. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se développer aux concentrations d’antibiotiques les plus élevées, mais continuent de se multiplier aux concentrations d’antibiotiques les plus faibles, ce qui rend les milieux troubles. La concentration minimale d’antibiotiques à laquelle la bactérie ne peut plus survivre ou se multiplier est appelée la valeur minimale de concentration inhibitrice, ou CMI, de l’antibiotique pour la bactérie donnée.
Dans un test E, une bande de plastique imprégnée d’un gradient prédéfini d’antibiotique est appliquée sur une pelouse de bactéries fraîchement répandue sur une plaque de Pétri gélifiée Mueller-Hinton, ou MH-A. L’antibiotique se diffuse dans le milieu gélosée, où il est absorbé par les bactéries. Si elles sont sensibles, les bactéries ne peuvent pas se multiplier et mourront, formant une zone claire autour de la bande E, appelée zone d’inhibition de la croissance. Au point où la croissance croise la bande E, la valeur correspondante sur l’échelle donne la valeur CMI de l’antibiotique.
Souvent, les antibiotiques sont utilisés en combinaison pour prévenir l’émergence de souches de bactéries résistantes aux antibiotiques. Il en résulte souvent un effet synergique plutôt qu’additif. Synergique signifie que l’effet combiné des deux antibiotiques est supérieur à la somme de leurs activités individuelles. Cependant, l’effet n’est considéré comme significatif que lorsque la valeur de la CMI de l’association d’antibiotiques diminue d’au moins deux fois. Ce critère est évalué en calculant l’indice de concentration inhibitrice fractionnelle, ou FIC. En additionnant le rapport entre la CMI de chaque antibiotique et la CMI de chaque antibiotique individuellement, un indice FIC inférieur à 0,5 indique une synergie.
La synergie antibiotique peut être mesurée à l’aide de deux méthodes basées sur le test E : un test non croisé ou un test croisé. Dans un test non croisé, les bandelettes E de deux antibiotiques différents avec des valeurs de CMI prédéterminées sont appliquées sur deux plaques distinctes. Une fois que les antibiotiques se sont diffusés dans le milieu, les bandelettes E d’origine sont retirées et les bandelettes E pour les antibiotiques alternatifs sont placées de manière à ce que leurs échelles de CMI reposent exactement sur les échelles de CMI des bandelettes précédentes. Dans un test croisé, qui est une version plus rapide du test non croisé, les bandelettes E des deux antibiotiques sont placées ensemble en formation croisée, de sorte que les écailles de leurs marques MIC forment un angle de 90 degrés à l’intersection. Après l’incubation dans les deux techniques, la valeur de la CMI de chaque antibiotique en combinaison avec l’autre antibiotique est lue au point où la zone d’inhibition de la croissance croise le bord de la bandelette E. Ensuite, l’indice FIC est calculé.
Cette vidéo montrera comment déterminer la valeur de la CMI d’un antibiotique donné pour une bactérie donnée à l’aide d’un test E et d’un test de dilution de micro-bouillon. Vous apprendrez également à déterminer la synergie entre deux antibiotiques à l’aide d’un test croisé et d’un test non croisé.
Pour commencer, enfilez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, prélevez 15 millilitres de bouillon stérile Mueller-Hinton avec 50 % de sang de cheval lysé et 20 milligrammes par millilitre de bêta-nicotinamide. Et cinq à huit plaques de gélose Mueller-Hinton. Maintenant, pour préparer un étalon de turbidité McFarland numéro 0,5, mesurez 9,95 millilitres d’une solution d’acide sulfurique à 1 %. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de solution de chlorure de baryum à 1 % à la solution d’acide sulfurique. Vortex bien la solution pour obtenir une suspension trouble. Couvrez le tube de papier d’aluminium et mettez-le de côté. Ensuite, versez un millilitre de solution saline dans un tube de 15 millilitres.
Utilisez une boucle stérile pour prélever un échantillon de la croissance bactérienne de votre plaque de test bactérienne, ici, Streptococcus groupe G. Ensuite, placez la boucle chargée de bactéries dans la solution saline, remuez doucement, puis agitez bien le tube. Maintenant, placez la suspension bactérienne et les étalons de turbidité McFarland côte à côte et comparez-les pour l’équivalence de turbidité. Ajoutez des colonies salines ou bactériennes supplémentaires jusqu’à ce que la turbidité de la suspension bactérienne corresponde à celle de l’étalon. Une fois la turbidité souhaitée obtenue, trempez un applicateur à embout en coton stérile dans la suspension bactérienne. Pour inoculer la plaque MH-A, frottez doucement toute la surface de la plaque avec un mouvement en zigzag. Ensuite, étiquetez les côtés inférieurs des plaques avec le nom de la bactérie et la date.
Pour commencer, sortez une bandelette de test E à la pénicilline G en la tenant par le bord avec une pince. Placez délicatement la bande au centre de la plaque MH-A fraîchement tamponnée et replacez le couvercle. Dans cet exemple, un deuxième antibiotique, la gentamicine, est également testé. Ainsi, le processus de mise en place de la bandelette est répété avec la deuxième plaque et une bandelette de test E de gentamicine. Pour déterminer les résultats du test E, prélevez la première plaque contenant la bandelette de test E de pénicilline G. Maintenant, déterminez le point où la zone d’inhibition croise la bande antibiotique. Lire la valeur numérique correspondante sur l’échelle. Cette valeur représente la valeur CMI de la pénicilline G. Déterminez la valeur CMI de la gentamicine de la même manière.
Pour commencer, inoculez une plaque MH-A avec des bactéries de la souche Streptococcus du groupe G. Étiquetez le bas de l’assiette avec le nom de la bactérie, les antibiotiques à utiliser et la date. Maintenant, placez une bandelette de test E pour l’antibiotique d’intérêt au centre de la plaque. Ensuite, tenez la deuxième bandelette de test à un angle de 90 degrés par rapport à la première bande et localisez sa marque MIC. Posez doucement la deuxième bande E sur la première au point d’intersection des deux valeurs MIC. Une fois les bandes placées, ne les déplacez pas. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.
Après avoir inoculé deux plaques MH-A, avec des bactéries de la souche G, placez une bandelette de test E pour un antibiotique sur la surface d’une plaque. Ensuite, placez une bandelette de test E pour l’autre antibiotique sur la deuxième plaque, comme indiqué. À l’aide d’une boucle d’inoculation en plastique, marquez la valeur CMI de chaque antibiotique sur la surface de sa plaque respective. Ensuite, couvrez les assiettes et incubez-les à température ambiante pendant une heure. Après cela, utilisez une pince pour retirer les bandes E. Ensuite, récupérez l’une des plaques et une bandelette de test E pour l’autre antibiotique. Tenez la bandelette de test E sur l’empreinte laissée par la première bande et localisez le point où la valeur MIC sur la bande E s’aligne avec la ligne marquée. Placez délicatement la bande à ce point d’intersection. Répétez ce processus pour la deuxième assiette et incubez les deux plaques à 37 degrés Celsius pendant 18 à 20 heures.
Tout d’abord, obtenir une suspension bactérienne avec une concentration bactérienne établie et diluer la culture dans un bouillon MHF pour obtenir une DO 600 de 0,003. Ensuite, pesez 16 milligrammes de pénicilline G et 128 milligrammes de gentamicine. Transférez chaque antibiotique sec pesé dans des tubes coniques de 215 millilitres. Ajoutez 10 millilitres d’eau distillée dans chacun des tubes coniques et mélangez bien par vortex. Étiquetez les tubes avec le nom et la concentration de l’antibiotique.
En effectuant le test en trois exemplaires, ajoutez 400 microlitres de la solution bactérienne de travail dans les premiers puits de trois rangées d’une plaque de microtitration de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de la solution bactérienne de travail dans du bouillon MHF dans les puits des trois rangées. Maintenant, pour générer une dilution d’antibiotique en série deux fois, ajoutez d’abord quatre microlitres de stock d’antibiotiques dans le premier puits, générant une dilution de 100 fois. Séquentiellement, transférez 200 microlitres de solution bactério-antibiotique dans chaque puits, en commençant par le premier puits jusqu’au deuxième pour durer bien dans chaque rangée, assurez-vous d’un bon mélange en pipetant deux à trois fois après chaque transfert. Jetez les 200 derniers microlitres de solution bactérie-antibiotique.
Pour déterminer les résultats de l’essai de microdilution en bouillon pour la pénicilline G, il faut d’abord localiser les puits qui ne présentent aucune croissance bactérienne visible, indiquée par une absence de turbidité. À partir de ces puits, identifiez le puits avec la plus faible concentration d’antibiotiques. Il s’agit de la valeur CMI de la pénicilline G pour les bactéries testées. La valeur CMI de la gentamicine peut être déterminée à l’aide du même dosage et de la même technique.
Pour déterminer les résultats de l’essai non croisé, prélevez la première plaque, qui contient une bandelette G E de pénicilline. Ensuite, déterminez le point où la zone d’inhibition de la croissance croise la bande antibiotique. La valeur correspondante sur l’échelle représente la valeur CMI de la pénicilline G en association avec la gentamicine. Dans cet exemple, la valeur MIC combinée est de 0,064 microgramme par millilitre.
Maintenant, prélevez la deuxième plaque, qui contient la bande de gentamicine E, et déterminez la valeur MIC en combinaison comme démontré précédemment. Pour évaluer l’effet de l’association, calculez d’abord la concentration inhibitrice fractionnée ou FIC pour la pénicilline G en divisant la CMI en combinaison par la CMI de l’antibiotique seul. Répétez ce processus pour la gentamicine. Ensuite, calculez l’indice FIC à l’aide de l’équation illustrée ici. Une réduction de deux fois de la valeur de la CMI en combinaison donne une valeur d’indice FIC inférieure ou égale à 0,5 et démontre une synergie entre la pénicilline G et la gentamicine. Dans ce cas, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Ainsi, les résultats ne démontrent pas de synergie entre la pénicilline G et la gentamicine contre la souche du groupe G du streptocoque.
Pour déterminer les résultats de l’essai croisé, il faut d’abord déterminer le point d’intersection des zones d’inhibition de la croissance avec leurs bandes E respectives. Lisez la valeur numérique sur chaque bandelette E-test qui correspond à ce point d’intersection. Ces valeurs représentent la valeur CMI en combinaison pour la pénicilline G et la gentamicine. Ensuite, pour évaluer l’effet de la combinaison, calculez l’indice FIC à l’aide de l’équation illustrée ici. Dans cet exemple, la valeur FIC calculée est de 1,18, ce qui est supérieur à 0,5. Cela signifie que la pénicilline G et la gentamicine n’agissent pas en synergie contre la souche du groupe G du streptocoque.
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