Test de la plaque : méthode de détermination de la charge virale exprimée en unités formant des plaques

Les bactériophages, également appelés phages, sont des virus qui infectent spécifiquement les bactéries et nous pouvons confirmer leur présence et les quantifier à l’aide d’un outil appelé test de la plaque. Les bactériophages infectent leurs hôtes sensibles en se fixant d’abord à la paroi cellulaire bactérienne et en injectant leur matériel génétique. Ensuite, ils détournent la machinerie biosynthétique de la cellule pour répliquer leur ADN et produire de nombreuses particules de phage de descendance, qu’ils libèrent ensuite en lysant et en tuant la cellule hôte.

Cette activité lytique est à la base d’une technique de dénombrement de phages largement utilisée connue sous le nom de test de plaque ou de test de la double couche de gélose. Ici, un mélange de bactériophages est d’abord préparé dans un bouillon nutritif fondu contenant de la gélose à faible concentration. Toutes les bactéries utilisées dans le mélange doivent être vivantes et se diviser activement dans la phase logarithmique de leur croissance, ce qui garantira qu’un grand pourcentage de bactéries sont viables et capables de former une pelouse dense autour des plaques. Ensuite, ce mélange de gélose bactérien-phage fondu est étalé sur un milieu nutritif de gélose plus solide et concentré qui est déjà solidifié sur une boîte de Pétri. Lors de l’incubation à température ambiante, le bouillon d’agar-phage-bactéries à faible concentration se solidifie également pour former une couche de gélose molle.

Ici, les cellules bactériennes peuvent dériver des nutriments supplémentaires de la couche inférieure et devraient se multiplier rapidement pour produire une pelouse confluente de bactéries. Cependant, comme les particules de phages sont également présentes dans la couche molle, celles-ci infecteront et répliqueront leur matériel génétique au sein de la bactérie, aboutissant à la lyse cellulaire, qui libère plusieurs descendances. Ces descendants de phages infectent ensuite les cellules voisines, car l’état semi-solide de la couche de phages bactério-phage limite leur mouvement vers des cellules hôtes plus éloignées. Ce cycle d’infection et de lyse se poursuit sur plusieurs cycles, tuant un grand nombre de bactéries dans une zone localisée. L’effet de la destruction des cellules voisines est de produire une seule zone claire circulaire, appelée plaque, qui peut être vue à l’œil nu, amplifiant efficacement l’activité lytique bactérienne du phage et permettant leur énumération.

Le nombre de plaques sur une boîte de Pétri est appelé unités formant des plaques et, à condition que la concentration initiale du bactériophage ait été suffisamment diluée, devrait correspondre directement au nombre de particules de phages infectieuses dans l’échantillon d’origine. Cette technique peut également être utilisée pour la caractérisation de la morphologie des plaques, pour aider à l’identification des types de phages ou pour isoler les mutants de phages. Dans cet atelier, vous apprendrez à effectuer le test de plaque pour dénombrer les phages, en utilisant le phage T7 d’E. coli comme exemple.

Tout d’abord, identifiez un milieu approprié pour la culture des cellules bactériennes de l’hôte et du bactériophage. Ici, le bouillon de lysogénie, ou milieu LB, a été utilisé pour cultiver E. coli et le phage T7. Ensuite, prenez trois bouteilles en verre propres et étiquetez-les avec le support, le nom, puis la première comme LB-Broth, la deuxième comme LB-Bottom Agar, et la troisième comme LB-Top Agar. Maintenant, pesez quatre grammes de poudre LB pré-formulée en trois séries, puis transférez un ensemble de milieux séchés pesés dans chaque bouteille. Ajoutez 200 millilitres d’eau dans la première bouteille. Mélangez le contenu à l’aide d’un barreau magnétique.

Ensuite, à l’aide d’un pH-mètre et d’une agitation constante, amenez le pH final à 7,4 grâce à l’ajout d’hydroxyde de sodium ou d’acide chlorhydrique. Répétez également l’ajout d’eau et l’ajustement du pH pour les deux autres bouteilles restantes. Maintenant, pesez trois grammes de poudre d’agar et ajoutez-la à la deuxième bouteille pour faire une gélose inférieure à 1,5 %. Enfin, pesez 1. 2 grammes de gélose et ajoutez-le à la troisième bouteille pour faire l’agar-gélose supérieure de .6 % LB. L’état du bouillon en bouteille un n’a pas besoin d’un ajout de gélose. Fermez le flacon en toute hermétique, puis stérilisez le milieu en l’autocavant à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois terminé, retirez les flacons de média de l’autoclave et tournez immédiatement les bouchons des bouteilles pour les fermer complètement afin d’éviter toute contamination. Conservez le bouillon LB et la gélose LB-Top sur le banc pour une utilisation ultérieure. Placez la gélose LB-Bottom à refroidir dans un bain-marie préréglé à environ 45 degrés Celsius.

Lorsque la gélose LB-Bottom atteint environ 45 degrés Celsius, transférez-la sur l’établi. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec 70 % d’éthénol. Ensuite, ajoutez 450 microlitres de chlorure de calcium stérile à une molaire dans la gélose fondue pour obtenir une concentration finale de 2,25 millimolaires. Agitez doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, disposez sept boîtes de Pétri propres. Étiquetez chaque plat sur le fond avec le nom du support et la date de préparation. Ensuite, versez 15 millilitres de gélose de fond dans chacune des sept boîtes de Pétri. Laissez les assiettes prendre pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante. Une fois prises, les plaques de culture peuvent être stockées à quatre degrés Celsius pendant plusieurs jours si nécessaire, à l’envers pour minimiser la condensation. Transférez les boîtes de Pétri du réfrigérateur à quatre degrés Celsius dans un incubateur à 37 degrés Celsius une heure avant le test.

La veille de la préparation du test, la mise en culture de E. coli doit être effectuée. Ici, 10 microlitres de culture d’E. coli ont été inoculés dans 10 millilitres de LB-Broth. Placez les bactéries pour qu’elles se développent pendant la nuit dans un incubateur à secouer réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr/min. Puis, le jour du dosage, retirez la culture bactérienne de l’incubateur. Épépinez 10 millilitres de bouillon LB frais avec 0,5 millilitres de culture pendant la nuit. Placez ces cellules pour les développer dans un incubateur à secousses réglé à 37 degrés Celsius à 160 tr/min. Ensuite, à l’aide d’un spectrophotomètre, vérifiez quand cette culture atteint la croissance en phase logarithmique, indiquée par une densité optique de 0,5 à 0,7. Une fois que la DO atteint ce niveau, arrêtez l’incubation en transférant la culture cellulaire sur le banc. Ils sont maintenant prêts à être utilisés pour le dosage de superposition de phages.

Les titres de phages peuvent varier de façon exponentielle selon les types de phages et les échantillons. Donc, afin de les compter efficacement, ils doivent être dilués pour générer une large gamme de concentrations de phages. Le jour du dosage, générer une série de dilutions de phages allant d’un dixième à un millionième de concentrations, en suivant une technique de dilution 10 fois. Pour obtenir des données statistiquement significatives et précises, effectuez la dilution en série en trois exemplaires.

Ensuite, faites fondre la gélose LB-top solidifiée à l’aide d’un micro-ondes. Ensuite, placez-le dans un bain-marie préréglé à 45 degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure, récupérez les boîtes de Pétri contenant la couche inférieure de gélose dans l’incubateur. Étiquetez les plaques avec la concentration de phages et la date du dosage. Ensuite, disposez sept tubes à essai propres. Étiquetez chaque tube à essai avec le numéro de dilution du phage en série et désignez-en un comme témoin.

Lorsque la gélose LB-top atteint 45 degrés Celsius, transférez-la sur le banc de travail. Maintenant, ajoutez 450 microlitres d’une molaire de chlorure de calcium à la gélose de 200 millilitres pour obtenir une concentration finale de 2,25 millimolaires. Agitez doucement la bouteille pour mélanger. Ensuite, ajoutez 35 millilitres de gélose LB-top et quatre millilitres de suspension bactérienne dans un tube conique stérile. Agitez doucement pour répartir uniformément les cellules, mais évitez de secouer pour éviter la formation de mousse.

Maintenant, aliquote cinq millilitres de ce mélange de gélose bactérienne dans chacun des sept tubes à essai. Ensuite, transférez 100 microlitres d’échantillons de bactériophages dilués en série et de milieux de contrôle, qui doivent être simplement des milieux sans bactériophage, dans les tubes à essai respectueusement étiquetés. Agitez doucement le mélange pour assurer un bon mélange. Transférez délicatement cinq millilitres de mélange de bactériophages sur la plaque de Pétri correspondante. Répartissez uniformément le mélange sur toute la surface en faisant tourner doucement la plaque de Petri.

Une fois que toutes les plaques de Pétri sont recouvertes du mélange, permettez la solidification de la couche supérieure en l’incubant à température ambiante pendant 15 minutes. Une fois ces étapes terminées, répétez le processus pour la deuxième puis la troisième série de boîtes de Pétri en utilisant les deux séries restantes de dilutions de phages. Fermez chaque plat avec du parafilm et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Placez la plaque de culture à l’envers à une température appropriée pendant 24 heures ou jusqu’à ce que des plaques se développent. Ici, les plaques ont été placées dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une journée, une condition de croissance stimulante pour E. coli et le phage T7.

Les plaques apparaîtront après un à cinq jours d’incubation, selon l’espèce bactérienne, les conditions d’incubation et le choix du milieu. Ici, des plaques étaient visibles après une journée d’incubation à 37 degrés Celsius. Commencez par vérifier les plaques marquées comme témoins et assurez-vous qu’aucune plaque ne s’est formée dans ces plaques, car cela indiquerait une contamination virale. Pour déterminer le titre de phage dans l’échantillon d’origine, commencez par les plaques contenant l’échantillon de phage le plus dilué et comptez les plaques sans retirer les couvercles, en les marquant pour indiquer celles qui ont déjà été comptées. Répétez le comptage pour chaque assiette de chaque série. Certaines plaques peuvent avoir trop ou trop peu de plaques pour être comptées. Considérez 10 à 150 comme un nombre idéal de plaques.

Ensuite, générez un tableau répertoriant les valeurs du nombre de plaques pour les différentes dilutions et répétitions. Ensuite, calculez les valeurs moyennes du nombre de plaques pour les plaques de dilution qui contenaient le nombre idéal de plaques. Dans cet exemple, il s’agissait du nombre moyen de plaques formées dans les plaques de dilution de 10 à moins trois et de 10 à moins quatre. Maintenant, ajustez le facteur de dilution des phages en divisant les valeurs moyennes de plaque obtenues par les facteurs de dilution des phages respectifs. Ici, le nombre moyen de plaques formées à 10 à moins trois et de 10 à moins quatre plaques a été divisé par leurs facteurs de dilution respectifs pour obtenir le nombre d’unités formant des plaques, ou PFU, dans 100 microlitres de mélange de phages. Pour convertir la valeur en PFU par millilitre, multipliez les valeurs générées par 10, car seulement 100 microlitres de mélange de dilution de phage ont été utilisés lors de l’étape de préparation du recouvrement de bactériophages, produisant un facteur de dilution supplémentaire de 10. Enfin, calculez la moyenne des valeurs obtenues à partir des différentes plaques de dilution. Cela donnera le nombre moyen de PFUs par millilitre. Le nombre de PFUs correspond au nombre de particules de phages infectieuses dans l’échantillon d’origine.