Test de la plaque : méthode de détermination de la charge virale exprimée en unités formant des plaques

1. Mise en place

1. Avant de commencer tout travail impliquant des microbes, assurez-vous que l'espace de travail est stérilisé(p. ex. essuyé avec 70 % d'éthanol). Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants, gardez les cheveux longs attachés en arrière et assurez-vous que les plaies sont particulièrement bien protégées.
2. Une fois terminé, stériliser toutes les surfaces et bien laver /stériliser les mains et les poignets.

2. Protocole

1. Préparation de LB Media
   Note: Selon la souche bactérienne hôte et le bactériophage, un milieu liquide différent peut être plus approprié pour la culture initiale de la souche bactérienne hôte ou un milieu solide différent peut être plus approprié pour la croissance ultérieure. Le bouillon de lysogénie (LB) est utilisé dans ce protocole pour le bouillon et l'agar.
   1. Mélanger 4 g LB dans de l'eau distillée de 200 ml, en triplicate, pour le bouillon LB, l'agar solide en fond et l'agar doux. Toutes les solutions doivent être préparées dans des conteneurs capables de contenir deux fois le volume final pour éviter les débordements pendant l'autoclacage.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, préparez le double de la quantité d'agar de fond LB.
   2. Ajustez le pH des trois solutions à 7.4 en utilisant NaOH ou HCl le cas échéant.
   3. Ajouter 3 g de puissance d'agar à la bouteille d'agar inférieure pour faire une solution d'agar de 1,5% pour l'agar solide
   4. Ajoutez 1,2 g de puissance d'agar à la bouteille d'agar supérieure pour faire une solution d'agar de 0,6 % pour l'agar doux.
   5. Placer les bouteilles, avec des bouchons semi-serrés, dans un autoclave réglé à 121 oC pendant 20 min pour stériliser les solutions. Fermez les bouchons dès que la course est terminée pour éviter la contamination.
   6. Lorsque le support LB a atteint une température d'environ 45-50 oC, ajouter 450 l de stérile 1 M CaCl₂ aux trois solutions lb de 200 ml pour faire une concentration finale de 2,25 mM.
   7. Verser 15 ml d'aliquots du milieu d'agar solide dans des plats petri stériles (éviter de secouer pour éviter l'écume) et laisser l'agar se solidifier pendant quelques heures ou toute la nuit à température ambiante (figure 4A). Les plaques peuvent être stockées à l'envers à 4 oC pendant plusieurs jours.
2. Cultiver des cellules hôtes
   1. Un jour avant l'assiduité, ajouter 10 l de culture E. coli à 10 ml de bouillon LB.
   2. Incuber la bactérie à 37oC pendant la nuit à 160 tr/min dans un incubateur secouant.
   3. Le matin de l'astodonte, ajouter 0,5 ml de la culture de nuit à 10 ml de LB frais.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, préparez le double de cette culture.
   4. Incuber le 37oC à 160 tr/min dans un incubateur secouant jusqu'à ce que la culture bactérienne soit en phase de croissance. Cela peut être déterminé spectrophotométriquement par un OD600 de 0,5-0,7.
   5. Gardez la culture à température ambiante jusqu'à ce que les bactéries soient ajoutées à l'agar LB supérieur.
3. 10 fois dilution en série du bactériophage
   1. Ajouter 180 l de bouillon LB à sept puits dans la première rangée d'une assiette de 96 puits
      Note: Il est suggéré d'effectuer la dilution en triplicate afin d'augmenter sa fiabilité statistique. Pour ce faire, préparer des dilutions supplémentaires du bactériophage dans les deuxième et troisième rangées de la plaque.
   2. Vortex soigneusement l'échantillon de bactériophage d'origine pour assurer l'homogénéité et transférer 20 L dans le premier puits.
   3. Bien mélanger l'échantillon par pipetting et vers le bas.
   4. Transférer 20 ll de la suspension résultante dans le deuxième puits.
   5. Continuer la dilution en série en transférant 20 l l de la solution dans le second puits dans le troisième puits, et ainsi de suite, jusqu'à ce que le sixième puits, laissant le septième bien comme un contrôle négatif à laquelle aucune suspension de phage ne sera ajouté. Cela créera une plage de dilution de 10^-1-10^-6.
4. Placage
   1. Étiquetez la base des plats Petri (précédemment préparés à l'étape 2.1.7) avec le nom, la date et une courte description de l'échantillon (y compris le facteur de dilution de l'échantillon de phage). Préchauffer les plats Petri dans un incubateur à 37oC une heure avant l'assidu.
   2. Faire fondre le milieu d'agar mou solidifié (généralement fait à l'aide d'un four à micro-ondes; l'agar solidifié fond à 85 oC), et laisser venir à environ 45 oC. Les supports chauffés peuvent être placés dans un bain d'eau de 45 oC pendant 1h pour atteindre une température appropriée. Il doit être assez chaud pour rester sous forme liquide, mais assez frais pour ne pas tuer les bactéries ajoutées.
   3. Mélanger la culture bactérienne de 4 ml (à partir de l'étape 2,2) avec une gélose molle de 35 ml lb (à 45 oC). Tourbillonner pour répartir uniformément les cellules, mais éviter de secouer pour éviter l'écume (Figure 4A).
   4. Étiquetez un tube à essai stérile pour chacune des étapes de dilution en série et un pour l'échantillon témoin, pour un total de 7 tubes à essai étiquetés. Placer 5 mL d'aliquots de la culture bactérienne/mélange d'agar doux de l'étape 2.4.3 dans les 7 tubes. Travaillez rapidement à l'étape 2.4.6 parce que ces petits volumes de supports à base d'agar se solidifieront rapidement à température ambiante.
   5. Ajouter 100 l de l'échantillon témoin (à partir de l'étape 2.3) au tube d'essai de commande et tourbillonner soigneusement. Jetez la pointe de pipette usagée et transférez le même volume de chacun des échantillons de bactériophage dilués en série (étape 2.3) à leurs tubes à essai respectifs, tourbillonnant pour mélanger.
   6. Transférer immédiatement les mélanges de 5 ml sur les plaques d'agar étiquetées, préchauffées et solides (Figure 4A). Faites tourbillonner doucement les assiettes pour même étendre les mélanges.
      Note: Si vous effectuez l'assay en triple, répétez deux fois de plus les étapes 2.4.3-6 deux fois de plus.
   7. Sceller chaque plaque avec du film de laboratoire et laisser les deux couches se solidifier correctement à température ambiante (environ 15 minutes) avant de les placer vers le bas d'un incubateur de 37 oC, stimulant la croissance des bactéries et du phage, pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les plaques développer, Il faut généralement environ 1-5 jours pour les plaques à apparaître (Figure 4B), mais le calendrier varie considérablement en fonction des conditions d'incubation, moyen, et les espèces bactériennes.

3. Analyse des données et résultats

1. Compter les plaques
   1. Assurez-vous qu'aucune plaque n'est visible dans les plaques marquées « contrôle », car cela indiquerait une contamination virale.
   2. Commencez par les plaques étiquetées 10^-6, contenant l'échantillon de bactériophage le plus dilué. Comptez les plaques sans enlever le couvercle, en les marquant avec un stylo que vous allez pour indiquer quelles plaques ont déjà été comptés.
   3. Comptez les plaques restantes. Certaines plaques peuvent avoir trop peu ou trop de plaques à compter. Utilisez les plaques avec 10-150 plaques pour une analyse plus approfondie.
2. Calcul de l'UF
   1. Diviser le nombre de plaques par le facteur de dilution (ex. 10^-6 pour l'échantillon le plus dilué) pour obtenir le nombre d'unités de formation de plaque (PFU) dans 100 l de mélange de phage.
      Note: Si vous effectuez le récarthèse en triple, utilisez le nombre moyen de plaques des trois plaques.
   2. Pour déterminer la concentration (dans l'UL/mL) de l'échantillon original, multipliez par un facteur de dilution supplémentaire de 10, puisque seulement 100 l'échantillon a été plaqué. (c'est à dire )
   3. Calculez la valeur moyenne du PFU/mL pour toutes les dilutions qui avaient entre 10 et 150 plaques pour atteindre un résultat plus fiable.