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Source: Natalia Martin1, Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, et Victor J. DiRita1
1 Département de microbiologie et de génétique moléculaire, Michigan State University
Les bactéries ont la capacité d'échanger du matériel génétique (acide déoxyribonucléique, ADN) dans un processus connu sous le nom de transfert horizontal de gènes. L'incorporation d'ADN exogène fournit un mécanisme par lequel les bactéries peuvent acquérir de nouveaux traits génétiques qui leur permettent de s'adapter aux conditions environnementales changeantes, telles que la présence d'antibiotiques ou d'anticorps (1) ou de molécules présentes dans les habitats naturels (2). Il existe trois mécanismes de transfert horizontal de gènes : la transformation, la transduction et la conjugaison (3). Ici, nous allons nous concentrer sur la transformation, la capacité des bactéries à prendre l'ADN libre de l'environnement. En laboratoire, le processus de transformation comporte quatre étapes générales : 1) Préparation de cellules compétentes, 2) Incubation de cellules compétentes avec ADN, 3) Récupération des cellules, et 4) Placage des cellules pour la croissance des transformateurs (figure 1).
Figure 1 : Étapes générales du processus de transformation. Le processus de transformation comporte quatre étapes générales : 1) Préparation de cellules compétentes, 2) Incubation avec ADN, 3) Récupération des cellules et 4) Cellules de placage pour la croissance des transformateurs.
Pour que la transformation se produise, les bactéries récepteuses doivent être dans un état connu sous le nom de compétence. Certaines bactéries ont la capacité de devenir naturellement compétentes en réponse à certaines conditions environnementales. Cependant, beaucoup d'autres bactéries ne deviennent pas compétentes naturellement, ou les conditions pour ce processus sont encore inconnues. La capacité d'introduire l'ADN dans les bactéries a une gamme d'applications de recherche: pour générer plusieurs copies d'une molécule d'ADN d'intérêt, d'exprimer une grande quantité de protéines, comme un composant dans les procédures de clonage, et d'autres. En raison de la valeur de la transformation à la biologie moléculaire, il existe plusieurs protocoles visant à rendre les cellules artificiellement compétentes lorsque les conditions de compétence naturelle sont inconnues. Deux méthodes principales sont utilisées pour préparer des cellules artificiellement compétentes : 1) par le traitement chimique des cellules et 2) l'exposition des cellules aux impulsions électriques (électroporation). Le premier utilise différents produits chimiques selon la procédure pour créer une attraction entre l'ADN et la surface cellulaire, tandis que le second utilise des champs électriques pour générer des pores dans la membrane cellulaire bactérienne par laquelle les molécules d'ADN peuvent entrer. L'approche la plus efficace pour la compétence chimique est l'incubation avec des cations divalentes, plus particulièrement le calcium (Ca2)(4,5) La compétence induite par le calcium est la procédure qui sera décrite ici (6). Cette méthode est principalement utilisée pour la transformation des bactéries Gram-négatives, et qui sera au centre de ce protocole.
La procédure de transformation chimique implique une série d'étapes dans lesquelles les cellules sont exposées à des cations pour induire la compétence chimique. Ces étapes sont ensuite suivies d'un changement de température - choc thermique - qui favorise l'apport d'ADN étranger par la cellule compétente (7). Les enveloppes de cellules bactériennes sont chargées négativement. Chez les bactéries Gram-négatives comme Escherichia coli, la membrane externe est chargée négativement en raison de la présence de lipopolysaccharide (LPS) (8). Il en résulte la répulsion des molécules d'ADN de même charge négative. Dans l'induction chimique de compétence, les ions de calcium positivement chargés neutralisent cette répulsion de charge permettant l'absorption d'ADN sur la surface de cellules (9). Le traitement du calcium et l'incubation avec de l'ADN se font sur la glace. Par la suite, une incubation à des températures plus élevées (42 oC), le choc thermique, est effectuée. Ce déséquilibre de température favorise encore plus l'apport d'ADN. Les cellules bactériennes doivent être à la phase de croissance mi-exponentielle pour résister au traitement de choc thermique ; dans d'autres stades de croissance, les cellules bactériennes sont trop sensibles à la chaleur, ce qui entraîne une perte de viabilité qui diminue considérablement l'efficacité de la transformation.
Différentes sources d'ADN peuvent être utilisées pour la transformation. Typiquement, les plasmides, petites molécules circulaires d'ADN à double brin, sont utilisés pour la transformation dans la plupart des procédures de laboratoire dans E. coli. Pour que les plasmides soient maintenus dans la cellule bactérienne après la transformation, ils doivent contenir une origine de réplication. Cela leur permet d'être reproduits dans la cellule bactérienne indépendamment du chromosome bactérien. Toutes les cellules bactériennes ne se transforment pas au cours de la procédure de transformation. Ainsi, la transformation donne un mélange de cellules transformées et de cellules non transformées. Pour distinguer entre ces deux populations, une méthode de sélection pour identifier les cellules qui ont acquis le plasmide est utilisée. Les plasmides contiennent habituellement des marqueurs sélectionnables, qui sont des gènes codant un trait qui confère un avantage pour la croissance (c.-à-d. résistance à un antibiotique ou chimique ou sauvetage d'une auotrophie de croissance). Après la transformation, les cellules bactériennes sont plaquées sur des supports sélectifs, ce qui ne permet que la croissance des cellules transformées. Dans le cas des cellules transformées avec un plasmide conférant une résistance à un antibiotique donné, les médias sélectifs seront des supports de croissance contenant cet antibiotique. Plusieurs méthodes différentes peuvent être utilisées pour confirmer que les colonies cultivées dans les milieuis sélectifs sont des transformateurs (c'est-à-dire ont incorporé le plasmide). Par exemple, les plasmides peuvent être récupérés dans ces cellules à l'aide de méthodes de préparation au plasmide (10) et digérés pour confirmer la taille du plasmide. Alternativement, la colonie PCR peut être utilisée pour confirmer la présence du plasmide d'intérêt (11).
L'objectif de cette expérience est de préparer des cellules chimiquement compétentes E. coli DH5MD, en utilisant une adaptation de la procédure de chlorure de calcium (12), et de les transformer avec le plasmide pUC19 pour déterminer l'efficacité de la transformation. La souche E. coli DH5Estest une souche couramment utilisée dans des applications de biologie moléculaire. En raison de son génotype, en particulier le recA1 et endA1, cette souche permet une stabilité accrue de l'insertion et d'améliorer la qualité de l'ADN plasmide dans les préparations ultérieures. Étant donné que l'efficacité de transformation diminue avec l'augmentation de la taille de l'ADN, le plasmide pUC19 a été utilisé dans ce protocole en raison de sa petite taille (2686 bp) (voir https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html pour un carte vectorielle). pUC19 confère une résistance à l'ampicilline et donc, c'était l'antibiotique utilisé pour la sélection.
Ce protocole décrit la préparation et la transformation de e. coli DH5compétent compétent à l'aide d'une adaptation de la procédure de chlorure de calcium (12).
1. Mise en place
IMPORTANT toutes les étapes de ce protocole doivent être effectuées à l'aide de techniques aseptiques et sur la glace ou des températures de 4 oC, sauf indication contraire.
2. Protocole
| composant | quantité |
| 10X Tampon de digestion de restriction | 2,5 l |
| Plasmid pUC19 | 1 g |
| Hind Hind Ⅲ | 1 l |
| H2O | 20,5 l (à 25 l) |
Figure 2 : Digestion de l'ADN plasmide récupéré à partir de cellules DH5 Transformées. L'ADN de Plasmid a été récupéré à partir de cellules DH5 transformées, digérées avec HindIII, exécutés dans un gel d'agarose de 1% et visualisés avec une source UV (étapes 2.19 à 2.22).
3. Analyse des données et résultats
Pour calculer l'efficacité de transformation, un indicateur de la façon dont les cellules ont pris l'ADN extracellulaire, les colonies obtenues dans la transformation doivent être comptés:
| dilution | Ufc |
| 1/100 | 34 |
| 1/10 | 246 |
Tableau 1 : Unités de formation de colonies (cfu) comptées à partir de l'expérience de transformation.
L'efficacité de transformation (TE) est une mesure du nombre de cfu résultant de la transformation de 1 g de plasmide en un volume donné de cellules compétentes. De nombreux paramètres affectent l'efficacité de la transformation : taille plasmique, génotype cellulaire, stade de croissance lors de la préparation des compétences, méthodes de transformation, etc.). Lors du calcul de l'TE est important de considérer quelle dilution (le cas échéant) a été effectuée avant le placage et de l'intégrer dans le calcul du nombre total de cfu. L'efficacité de transformation (TE) est calculée avec l'équation suivante :
D'abord diviser le cfu par le g d'ADN, dans cet exemple 0,0001g. Divisez ensuite le résultat par le facteur de dilution. Dans cet exemple, une dilution de 1/10 a été utilisée et 100 'L d'une solution de 1 ml a été plaquée (dilution: 1/10 '100 'L /1000 'L '0.01).
Les bactéries sont remarquablement adaptables et un mécanisme qui facilite cette adaptation est leur capacité à prendre en molécules externes d'ADN. Un type d'ADN que les bactéries peuvent prendre est appelé un plasmide, un morceau circulaire d'ADN qui contient fréquemment des informations utiles, telles que les gènes de résistance aux antibiotiques. Le processus de modification des bactéries par de nouvelles informations génétiques incorporées à partir d'une source externe est appelé transformation. La transformation peut facilement être effectuée en laboratoire à l'aide d'Escherichia coli, ou E. coli.
Pour être transformées, les cellules E. coli doivent d'abord être rendues compétentes, ce qui signifie être capables de prendre des molécules d'ADN de leur environnement. Le protocole pour y parvenir est étonnamment simple, une courte incubation des cellules dans une solution de chlorure de calcium. Cette incubation fait en cesriciens les cellules des molécules d'ADN. Une fois que les cellules sont granulées par centrifugation, le supernatant est enlevé. L'ADN plasmide est maintenant ajouté aux cellules compétentes. Après avoir incubé les cellules avec de l'ADN, le mélange est brièvement chauffé à 42 degrés Celsius, suivi d'un refroidissement rapide sur la glace. Ce choc thermique provoque le transfert de l'ADN sur la paroi et les membranes de la cellule. Les cellules sont ensuite incubées dans des médias frais. Ensuite, les bactéries sont placées à 37 degrés pour leur permettre de refermer leurs membranes et d'exprimer des protéines résistantes.
Les cellules qui ont pris dans les plasmides copieront fidèlement l'ADN et le transmettent à leur progéniture et exprimeront toutes les protéines qui pourraient être codées par elle, y compris les médiateurs de résistance aux antibiotiques. Ces gènes de résistance peuvent être utilisés comme marqueurs sélectionnables pour identifier les bactéries qui ont été transformées avec succès parce que les cellules qui n'ont pas pris le plasmide n'exprimeront pas le produit du gène de résistance. Cela signifie que lorsque les cellules sont plaquées sur un milieu solide qui contient l'antibiotique approprié, seules les cellules qui ont pris le plasmide se développeront. La transformation des cellules dans une colonie croissante peut être confirmée en cultivant ces cellules dans les médias liquides pendant la nuit pour augmenter le rendement avant d'extraire l'ADN de l'échantillon. Une fois que l'ADN est isolé, un digest d'enzyme de restriction diagnostique peut être effectué. Puisque les enzymes de restriction coupent l'ADN dans les endroits prévisibles, exécution de ces digestes sur un gel devrait montrer un modèle prévisible si le plasmide désiré a été avec succès transformé. Par exemple, si le pUC19 est préparé et coupé avec l'enzyme de restriction HindIII, une seule bande de 2686 nucléotides doit être vu sur le gel.
Dans ce laboratoire, vous transformerez la souche E. coli DH-5 Alpha avec pUC19, puis confirmerez la transformation réussie par l'électrophorèse de gel d'ADN.
Avant de commencer la procédure, mettez l'équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stériliser l'espace de travail avec 70% d'éthanol.
Maintenant, préparez des cellules chimiquement compétentes en déposant une boucle pleine de bactéries sur une plaque stérile d'agar LB et en stries les bactéries avec une nouvelle boucle. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez à nouveau le dessus du banc avec 70 % d'éthanol et retirez la plaque de l'incubateur.
Inoculer une seule colonie bien isolée en 3 millilitres de bouillon LB dans un tube avec une boucle stérile. Ensuite, faire pousser la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit, avec des secousses à 210 tr/min. Le lendemain, mesurez la densité optique de la culture du jour au lendemain à l'utilisation d'un spectrophotomètre. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de bouillon LB à un flacon d'un litre, et inoculez-le avec la culture de nuit à une densité optique de 0. 01. Maintenant, incuber la culture à 37 degrés Celsius avec des secousses, et vérifier l'OD600 toutes les 15 à 20 minutes jusqu'à ce que la culture atteint la phase de croissance à mi-exponentielle.
Après environ trois heures, transférer 50 millilitres de la culture dans deux bouteilles de polypropylène glacée. Ensuite, remettre les bouteilles sur la glace pendant 20 minutes pour refroidir. Ensuite, récupérer les cellules par centrifugation. Jetez les supernatants et placez les bouteilles à l'envers sur un essuie-tout. Ensuite, resuspendre la pastille bactérienne en cinq millilitres de chlorure de calcium glacé et tourbillonner soigneusement jusqu'à ce que la pastille se soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez encore 25 millilitres de la solution à la pastille bactérienne dissoute. Resuspendre l'autre granule bactérien tel que démontré précédemment. Après cela, répéter la centrifugation, et retirer les supernatants.
Si les cellules compétentes doivent être directement transformées, resuspendre chaque granule bactérienne en deux millilitres d'une solution de chlorure de calcium de 0,1 molaire glacée en faisant tourbillonner soigneusement les tubes. Pour commencer la procédure de transformation, transférer 50 microlitres de cellules compétentes à deux tubes de polypropylène de 1,5 millilitre étiquetés. Ensuite, ajoutez un microlitre d'ADN plasmide pUC19 à l'un des tubes. Mélanger délicatement, en évitant la formation de bulles, et incuber les deux tubes pendant 30 minutes sur la glace. Après l'incubation, transférer les tubes dans un bloc de chaleur et couver à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes. Transférer immédiatement les tubes sur la glace et couver pendant deux minutes. Maintenant, ajoutez 950 microlitres de milieu xcopique à chaque tube et incubez-les pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux bactéries de récupérer, et exprimez le marqueur résistant aux antibiotiques encodé dans le plasmide.
Pour faire une dilution de 1 à 100, ajouter 990 microlitres de support SOC et 10 microlitres de suspension cellulaire à un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faire une dilution de 1 à 10 en ajoutant 900 microlitres de supports SOC et 100 microlitres de suspension cellulaire à un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, plaque10 microlitres des suspensions de cellules diluées et 100 microlitres du contrôle négatif, sur des plaques sélectives séparées contenant de l'ampicilline à l'aide d'un épandeur et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l'incubation, compter les unités de formation des colonies, ou UFC, par plaque, obtenues par transformation, et consigner ces données. Pour vérifier que les transformateurs ont le plasmide pUC19, choisissez une seule colonie bien isolée dans une assiette avec une boucle stérile, et introduisez-la dans un tube contenant 3 millilitres de bouillon LB. Puis, incuber la culture à 37 degrés Celsius avec des secousses, du jour au lendemain. Le lendemain, utilisez un kit de préparation à l'ADN pour isoler l'ADN de 3 millilitres de la culture, selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l'ADN, digérez le 1 microgramme de pUC19 purifié avec une enzyme de restriction à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Maintenant, chargez 20 microlitres d'une échelle de poids moléculaire, 1 microgramme d'ADN plasmide digéré, et 1 microgramme d'ADN plasmide non digéré dans des puits consécutifs d'un gel d'agarose de 1% contenant 1 microgramme par bromure d'éthidium millilitre. Ensuite, faites fonctionner le gel pendant 1 heure à 95 volts. Enfin, visualisez le gel à l'aide d'un illuminateur UV.
Dans cette expérience, des cellules chimiquement compétentes E. coli DH5 Alpha ont été préparées à l'aide d'une adaptation de la procédure de chlorure de calcium, puis transformées avec le plasmide pUC19 pour déterminer l'efficacité de la transformation. Pour calculer l'efficacité de la transformation, utilisez les comptes cFU enregistrés pour les dilutions de 1 sur 100 et de 1 sur 10, et toutes les autres dilutions avec cFU comptent entre 30 et 300. Tout d'abord, le nombre enregistré de CFU, 246 dans cet exemple, est divisé par la quantité d'ADN, .0001 microgrammes ici, qui a été plaqué. Ensuite, ce nombre est divisé par le facteur de dilution utilisé pour donner l'efficacité de transformation dans les UFC par microgramme. Dans cet exemple, une dilution de 1 à 10 a été utilisée et 100 microlitres d'une solution de 1 millilitre ont été plaqués, donnant un facteur de dilution final de 0,01. Dans la voie plasmide non digérée, l'ADN circulaire peut apparaître comme deux ou trois bandes différentes de luminosité variable. C'est parce que l'ADN circulaire, non coupé peut exister dans plusieurs états de conformation différents, tels que supercoiled, cercle ouvert, ou plus linéaire, et chacun de ces se déplacent à travers le gel à des taux différents. L'analyse de la digestion récupérée d'ADN de plasmide a indiqué que le plasmide utilisé a une taille prévue de l'ADN de pUC19, 2.686 paires de base.
Les bactéries sont remarquablement adaptables et l’un des mécanismes qui facilite cette adaptation est leur capacité à absorber des molécules d’ADN externes. Un type d’ADN que les bactéries peuvent absorber est appelé plasmide, un morceau d’ADN circulaire qui contient fréquemment des informations utiles, telles que des gènes de résistance aux antibiotiques. Le processus de modification des bactéries par de nouvelles informations génétiques incorporées à partir d’une source externe est appelé transformation. La transformation peut facilement être réalisée en laboratoire à l’aide d’Escherichia coli ou d’E. coli.
Pour être transformées, les cellules E. coli doivent d’abord être rendues compétentes, c’est-à-dire capables d’absorber des molécules d’ADN de leur environnement. Le protocole pour y parvenir est étonnamment simple, une courte incubation des cellules dans une solution de chlorure de calcium. Cette incubation rend les cellules perméables aux molécules d’ADN. Une fois que les cellules ont été granulées par centrifugation, le surnageant est éliminé. L’ADN plasmidique est maintenant ajouté aux cellules compétentes. Après avoir incubé les cellules avec de l’ADN, le mélange est brièvement chauffé à 42 degrés Celsius, suivi d’un refroidissement rapide sur de la glace. Ce choc thermique provoque le transfert de l’ADN à travers la paroi et les membranes de la cellule. Les cellules sont ensuite incubées dans un milieu frais. Ensuite, les bactéries sont placées à 37 degrés pour leur permettre de refermer leurs membranes et d’exprimer des protéines résistantes.
Les cellules qui ont absorbé les plasmides copieront fidèlement l’ADN et le transmettront à leur descendance et exprimeront toutes les protéines qui pourraient être codées par celui-ci, y compris les médiateurs de résistance aux antibiotiques. Ces gènes de résistance peuvent être utilisés comme marqueurs sélectionnables pour identifier les bactéries qui ont été transformées avec succès parce que les cellules qui n’ont pas absorbé le plasmide n’exprimeront pas le produit du gène de résistance. Cela signifie que lorsque les cellules sont plaquées sur un milieu solide contenant l’antibiotique approprié, seules les cellules qui ont absorbé le plasmide se développeront. La transformation des cellules d’une colonie en croissance peut être confirmée en cultivant ces cellules dans un milieu liquide pendant la nuit afin d’augmenter le rendement avant d’extraire l’ADN de l’échantillon. Une fois l’ADN isolé, une digestion diagnostique de l’enzyme de restriction peut être effectuée. Étant donné que les enzymes de restriction coupent l’ADN à des endroits prévisibles, l’exécution de ces digestions sur un gel devrait montrer un modèle prévisible si le plasmide souhaité a été transformé avec succès. Par exemple, si pUC19 est préparé et coupé avec l’enzyme de restriction HindIII, une seule bande de 2686 nucléotides doit être visible sur le gel.
Dans ce laboratoire, vous transformerez la souche DH-5 Alpha d’E. coli avec pUC19, puis confirmerez la transformation réussie par électrophorèse sur gel d’ADN.
Avant de commencer l’intervention, enfilez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %.
Maintenant, préparez des cellules chimiquement compétentes en déposant une boucle pleine de bactéries sur une plaque de gélose LB stérile et en striant les bactéries avec une nouvelle boucle. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez à nouveau la paillasse avec de l’éthanol à 70 % et retirez la plaque de l’incubateur.
Inoculez une seule colonie bien isolée dans 3 millilitres de bouillon LB dans un tube avec une boucle stérile. Ensuite, cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit, en secouant à 210 tr/min. Le lendemain, mesurez la densité optique de la culture de nuit à l’aide d’un spectrophotomètre. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de bouillon LB dans une fiole d’un litre et inocunez-le avec la culture de nuit à une densité optique de 0. 01. Maintenant, incubez la culture à 37 degrés Celsius en secouant et vérifiez l’OD600 toutes les 15 à 20 minutes jusqu’à ce que la culture atteigne une phase de croissance exponentielle moyenne.
Après environ trois heures, transférez 50 millilitres de la culture dans deux bouteilles de polypropylène glacées. Ensuite, remettez les bouteilles sur de la glace pendant 20 minutes pour qu’elles refroidissent. Ensuite, récupérez les cellules par centrifugation. Jetez les surnageants et placez les bouteilles à l’envers sur une serviette en papier. Ensuite, remettez en suspension la pastille bactérienne dans cinq millilitres de solution glacée de chlorure de calcium et de chlorure de magnésium et remuez soigneusement jusqu’à ce que la pastille soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez encore 25 millilitres de la solution à la pastille bactérienne dissoute. Remettez en suspension l’autre pastille bactérienne comme démontré précédemment. Après cela, répétez la centrifugation et retirez les surnageants.
Si les cellules compétentes doivent être directement transformées, remettez en suspension chaque pastille bactérienne dans deux millilitres d’une solution glacée de chlorure de calcium de 0,1 molaire en remuant les tubes avec précaution. Pour commencer la procédure de transformation, transférez 50 microlitres de cellules compétentes dans deux tubes en polypropylène de 1,5 millilitre marqués. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ADN plasmidique pUC19 dans l’un des tubes. Mélangez doucement, en évitant la formation de bulles, et incubez les deux tubes pendant 30 minutes sur de la glace. Après l’incubation, transférez les tubes dans un bloc chauffant et incubez à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes. Transférez immédiatement les tubes dans de la glace et incubez pendant deux minutes. Maintenant, ajoutez 950 microlitres de milieu SOC dans chaque tube et incubez-les pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux bactéries de se rétablir et d’exprimer le marqueur de résistance aux antibiotiques codé dans le plasmide.
Pour faire une dilution de 1 à 100, ajoutez 990 microlitres de milieu SOC et 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faites une dilution de 1 à 10 en ajoutant 900 microlitres de milieu SOC et 100 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, placez 100 microlitres de suspensions cellulaires diluées et 100 microlitres de contrôle négatif, sur des plaques sélectives séparées contenant de l’ampicilline à l’aide d’un épandeur et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l’incubation, compter les unités formant colonies (UFC) par boîte obtenues par transformation et consigner ces données. Pour vérifier que les transformants ont le plasmide pUC19, prélevez une seule colonie bien isolée dans une plaque avec une boucle stérile et introduisez-la dans un tube contenant 3 millilitres de bouillon LB. Ensuite, incubez la culture à 37 degrés Celsius en secouant, pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un mini kit de préparation de l’ADN pour isoler l’ADN de 3 millilitres de la culture, selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l’ADN, digérez le 1 microgramme de pUC19 purifié avec une enzyme de restriction à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Maintenant, chargez 20 microlitres d’une échelle de poids moléculaire, 1 microgramme d’ADN plasmidique digéré et 1 microgramme d’ADN plasmidique non digéré dans des puits consécutifs d’un gel d’agarose à 1 % contenant 1 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium. Ensuite, faites fonctionner le gel pendant 1 heure à 95 volts. Enfin, visualisez le gel avec un illuminateur UV.
Dans cette expérience, des cellules chimiquement compétentes d’E. coli DH5 Alpha ont été préparées à l’aide d’une adaptation de la procédure du chlorure de calcium, puis transformées avec le plasmide pUC19 pour déterminer l’efficacité de la transformation. Pour calculer l’efficacité de la transformation, utilisez les dénombrements d’UFC enregistrés pour les dilutions de 1 sur 100 et de 1 sur 10, ainsi que toute autre dilution dont le nombre d’UFC est compris entre 30 et 300. Tout d’abord, le nombre d’UFC enregistré, 246 dans cet exemple, est divisé par la quantité d’ADN, 0,0001 microgramme ici, qui a été plaquée. Ensuite, ce nombre est divisé par le facteur de dilution utilisé pour donner l’efficacité de transformation en UFC par microgramme. Dans cet exemple, une dilution de 1 à 10 a été utilisée et 100 microlitres d’une solution de 1 millilitre ont été plaqués, ce qui donne un facteur de dilution final de 0,01. Dans la voie plasmidique non digérée, l’ADN circulaire peut apparaître sous la forme de deux ou trois bandes différentes de luminosité variable. En effet, l’ADN circulaire et non coupé peut exister dans plusieurs états de conformation différents, tels que superenroulé, cercle ouvert ou plus linéaire, et chacun d’entre eux se déplace à travers le gel à des vitesses différentes. L’analyse de la digestion de l’ADN plasmidique récupéré a indiqué que le plasmide utilisé a une taille attendue d’ADN pUC19, soit 2 686 paires de bases.
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