Conjugaison : méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur à l'hôte E. coli

1. Mise en place

1. Autoclave environ 1L du milieu de Luria-Bertani (LB). Ce LB stérile sera utilisé pour fabriquer environ 5 ml de LB contenant 0,3 mM d'acide diaminopiélique (DAP).
2. Recueillir les plaques suivantes: plaques d'agar LB avec 1X Tet et 0,3 mM DAP, plaques d'agar LB avec 1X Tet seulement, et plaques d'agar LB avec 1X Amp / Tet seulement.
3. Assurez-vous qu'un peu de glycérol et une boîte de pointes de pipette en plastique pré-stérilisée sont à portée de main.
4. Avant de commencer tout travail impliquant des microbes, stériliser l'espace de travail avec 70% d'éthanol. Portez toujours l'équipement de protection individuelle nécessaire, y compris une blouse de laboratoire et des gants.
5. Une fois terminé, stériliser toutes les surfaces et les gants avec 70% d'éthanol et se laver les mains.

2. Préparation des souches du donneur et du receveur

1. Préparer 5 ml de cultures bactériennes des souches du donneur et du receveur et les cultiver pendant la nuit à 37 oC avec l'aération et les secousses à 220 tr/min. La souche de donneur devrait être cultivée en LB avec 0.3 mM DAP.
2. Faites tourner 1 ml des deux cultures (3 000 tr/min pendant 5 minutes) et lavez les cellules avec du PBS.
3. Resuspendre les cellules dans 500 l de phosphate tamponné saline (PBS).

3. Conjugaison

1. Combiner 50 l de cellules réceptrices avec 50 l de cellules donneuses dans un tube de microcentrifuge et mélanger par pipetting.
2. Incuber le mélange cellulaire pendant 1 heure à 37 oC. Cela permettra d'améliorer l'efficacité de la conjugaison avant et pendant la prochaine étape de placage.
3. Pipet 100 l du mélange cellulaire sur une plaque d'agar avec 1X Tet et 0,3 mM DAP. Ne pas étendre sur la plaque.
4. Pipet 100 l de culture cellulaire receveur sur une plaque d'agar avec 1X Tet et 0,3 mM DAP. Ne pas étendre sur la plaque.
5. Incuber les deux assiettes pendant la nuit à 37 oC.
6. Gratter le mélange des cellules de conjugaison et la culture cellulaire réceptrice avec un grattoir à cellules stériles. Transférer les cellules dans un tube microcentrifuge stérile et les suspendre à 1 ml de PBS.
7. Vortex les cellules et les faire tourner doucement vers le bas (3000 tr/min pendant 5 minutes).
8. Resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS.
9. Plaquer le mélange de cellules de réaction de conjugaison sur une plaque d'agar LB avec 1X Amp/Tet seulement. Sur cette plaque, seules les bactéries récepteuses qui ont réussi à obtenir le gène de résistance de l'ampli par conjugaison sont censées se développer.
10. Déposer les cellules réceptrices sur une plaque d'agar LB avec 1X Tet seulement. Sur cette plaque, seules les bactéries récepteuses non conjuguées, qui n'ont pas le gène de résistance de l'ampli, devraient se développer.
11. Incuber les assiettes toute la nuit à 37 oC.
12. Choisissez des colonies simples des deux plaques et utilisez-les pour faire pousser des cultures de nuit dans 5 ml de support (37 oC avec aération à 220 tr/min).

4. Isolement de l'ADN

1. Isoler l'ADN des cultures précédemment préparées en utilisant 4,5 ml du volume total de culture par miniprep d'ADN.
2. Pour ce faire, éluter l'ADN à l'aide de 35 L d'eau sans nucléane.
3. L'ADN pur générera un rapport d'absorption (A_260/280) d'environ 1,8.
4. Utilisez les 0,5 ml restants de chaque culture pour préparer les stocks de glycérol en faisant un mélange 1:1 de culture bactérienne et 100% de glycérol.
5. Conserver les stocks de congélateurs à -80 oC.

5. Confirmation de la conjugaison de transfert de Plasmid par PCR

1. Préparer deux mélanges maîtres PCR, chacun avec un ensemble différent d'amorces avant et inverses, l'un ciblant un segment de 500 paires de base au sein du gène de résistance à l'ampicilline et l'autre ciblant un segment au sein d'un gène d'entretien ménager.
   1. Les amorces de gène d'entretien ménager ont été conçues pour amplifier un segment de l'ADN dans l'encodage de gène bactérien pour le gyrase B d'ADN (14).
   2. Les volumes de réactifs suivants ont été utilisés pour préparer 90 L de chaque mix master :
      7,5 L de 10 m d'apprêt avant
      7,5 L de 10 m d'apprêt inversé
      75 L de 2X PCR Master Mix
2. Préparer les six réactions PCR suivantes à l'aide d'un mix maître de 15 l, de 10 ng d'ADN de modèle et d'eau exempte de nucléane jusqu'à un volume final de 25 l.
   Apprêtdedede de réaction de conjugaison et d'ampicilline
   Réaction de conjugaison ADN et amorces d'entretien ménager
   Amorces d'ADN et d'ampicilline de contrôle négatif
   ADN de contrôle négatif et amorces d'entretien ménager
   Pas d'amorces d'ADN et d'ampicilline
   Pas d'ADN et d'amorces d'entretien ménager
3. Transférez ces réactions à une machine PCR avec le bloc préchauffé à 98 C et commencez le thermocyclisme dans les conditions suivantes :
   98 oC pendant 30 secondes
   25-35 cycles de 98 oC pendant 5-10 secondes, 45-72 oC pendant 10 à 30 secondes, et 72 oC pendant 15-30 secondes par kb
   72 oC pendant 5-10 minutes
   Tenir à 4 oC
4. Chargez les six réactions PCR sur un gel agarose de 1% et exécutez à 150V pendant environ 20 minutes.
5. Visualisez le produit PC à l'aide d'un illuminateur UV.