Conjugaison : méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur à l'hôte E. coli

Les cellules bactériennes, telles que E. coli, sont capables de transférer des informations génétiques d’une cellule à l’autre. La conjugaison diffère des autres mécanismes de transfert d’ADN, tels que la transduction ou la transformation, en ce qu’elle nécessite un contact physique entre les cellules.

Pour procéder, la conjugaison nécessite une cellule donneuse qui exprime le facteur de fertilité, ou F, et une cellule receveuse sans elle, une cellule F moins. Le processus se déroule en deux étapes. Le premier est l’établissement d’un contact direct de cellule à cellule. Pour ce faire, la cellule donneuse génère une structure filamenteuse extracellulaire appelée pilus sexuel. Il est nommé ainsi car la conjugaison est une forme d’accouplement pour les bactéries à reproduction asexuée, mais il convient de noter qu’il ne s’agit pas d’une véritable reproduction sexuée car aucun gamète n’est échangé et aucune progéniture ne se forme.

La deuxième étape est l’administration de l’ADN à la cellule réceptrice. Une fois que le pilus sexuel a établi le contact entre deux cellules, un conduit appelé système de sécrétion de type IV est construit, permettant le transfert d’ADN. La cellule donneuse commence alors à répliquer l’ADN extrachromosomique qui sera transféré, sélectionné en fonction de la présence d’un élément génétique connu sous le nom d’OriT ou origine du transfert. Une extrémité de l’ADN nouvellement répliqué est enfilée dans le conduit par liaison aux protéines d’ADN. Au fur et à mesure que l’ADN est répliqué, il est pompé à travers le canal, facilité par un complexe de protéines codées par des gènes situés à proximité de l’OriT. Une fois que l’ADN est entièrement transféré, il formera soit un plasmide chromosomique supplémentaire, soit il s’intégrera dans le chromosome de la cellule réceptrice. Quel que soit le point final de l’ADN transféré, les gènes qu’il code seront alors exprimés. Cette expression génique peut être utilisée pour confirmer la réussite de la conjugaison.

Par exemple, considérons un scénario où la souche donneuse exprime une résistance à l’ampicilline et la transmet dans l’ADN conjugué à la bactérie réceptrice, mais où la souche réceptrice a également un gène de résistance à la tétracycline non présent chez le donneur. Dans ce cas, lorsque les cellules sont plaquées sur un milieu LB contenant à la fois de la tétracycline et de l’ampicilline, les colonies ne devraient se développer qu’à partir de bactéries conjuguées avec succès, qui exprimeront les deux phénotypes de résistance. Pour confirmer la réussite de la conjugaison, l’ADN plasmidique de ces colonies peut être récolté, puis une section d’ADN spécifique au plasmide transféré peut être amplifiée à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase, ou PCR. Lorsque le produit de PCR est exécuté sur un gel d’électrophorèse à côté d’une échelle de tailles standard, un fragment de PCR d’une taille connue doit être visible sur le gel, confirmant ainsi la réussite de la conjugaison. Dans cette expérience, un plasmide sera utilisé pour transférer le gène de résistance à l’ampicilline par conjugaison d’une souche donneuse à une souche receveuse résistante à la tétracycline. Après cela, pour confirmer la conjugaison, le mélange de conjugaison sera incubé sur une plaque contenant les deux antibiotiques ne laissant que les bactéries transformées. Enfin, la conjugaison réussie sera confirmée par PCR.

Avant de commencer l’intervention, enfilez l’équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 % pour essuyer la surface.

Dans cette procédure, le gène de résistance à l’ampicilline sera transféré de la souche WM3064 d’E. coli à la souche J53 d’E. coli par conjugaison. La souche donneuse WM3064 est résistante à la tétracycline et à l’ampicilline et elle a besoin d’acide diaminopimélique, ou DAP, pour se développer. La souche réceptrice J53 n’est résistante qu’à la tétracycline et n’a pas besoin de DAP pour se développer. Cela signifie que les cellules conjuguées avec succès doivent être résistantes à la tétracycline et à l’ampicilline et peuvent se développer sans DAP.

Préparez la culture de la souche donneuse en inoculant cinq millilitres de LB contenant 0,3 millimole de DAP avec un reste de stock de glycérol de la souche donneuse congelée. Ensuite, préparez la souche réceptrice en inoculant cinq millilitres de bouillon LB sans DAP avec un reste de stock de glycérol de souche réceptrice congelée. Cultivez ces cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec aération et agitation à 220 tr/min dans un incubateur à secousses. Une fois que les cultures ont atteint une OD 600 de deux, prélevez un millilitre de culture de chacune et placez-le dans deux nouveaux tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez ces aliquotes à 3000 tr/min pendant cinq minutes pour granuler les cellules bactériennes. Jetez le surnageant et lavez chaque granulé avec 250 microlitres de 1X PBS. Centrifugez à nouveau les échantillons et, après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension chaque pastille dans 500 microlitres de PBS.

Pour commencer la procédure de conjugaison, combinez d’abord 50 microlitres de cellules receveuses avec 50 microlitres de cellules donneuses dans un tube à microcentrifuger de 1,5 millilitre et mélangez en pipetant doucement de haut en bas. Ensuite, pipetez 100 microlitres de la culture cellulaire réceptrice sur une autre plaque de tétracycline 1X contenant du DAP. Ensuite, préparez votre contrôle négatif en pipetant 100 microlitres de la culture cellulaire réceptrice uniquement sur une plaque de gélose non sélective contenant du DAP. Ensuite, incubez les plaques de conjugaison et de contrôle négatif pendant une nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, prenez un grattoir à cellules stériles et récoltez les cellules de la plaque de conjugaison en prélevant des colonies. Ensuite, transférez les colonies dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS 1X. Répétez ce processus pour collecter les cellules réceptrices de l’autre plaque.

Après cela, vortex les échantillons à mélanger. Après le mélange, transférez les tubes dans une centrifugeuse pour granuler doucement les cellules. Jetez le surnageant, puis lavez les pastilles cellulaires dans un millilitre de PBS et vortex les tubes pour remettre les cellules en suspension. Granulez à nouveau les cellules par centrifugation. Jetez à nouveau le surnageant et remettez en suspension les deux pastilles cellulaires dans un millilitre de PBS. Maintenant, à l’aide d’une pointe de pipette stérile, plaquez 100 microlitres du mélange de cellules de réaction de conjugaison sur une plaque de gélose LB sans DAP contenant 1X tétracycline et 1X ampicilline. Répétez la méthode de placage en utilisant 100 microlitres d’une dilution dix fois du même mélange cellulaire dans du PBS sur une autre plaque de gélose LB sans DAP contenant 1X tétracycline et 1X ampicilline.

Enfin, pipetez 100 microlitres du mélange de cellules de contrôle négatif sur une seule plaque de gélose LB avec 1X tétracycline uniquement. Après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius, les colonies devraient être visibles. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez une seule colonie dans la plaque de réaction de conjugaison et ajoutez-la à un tube contenant cinq millilitres de milieu sélectif contenant les deux antibiotiques. Ensuite, répétez l’isolement de la colonie en sélectionnant une seule colonie dans la plaque de la cellule réceptrice. Cultivez ces cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une aération à 220 tr/min.

Le lendemain, essuyez le plan de travail avec de l’éthanol à 70 % et retirez les plaques de l’incubateur. Utilisez un mini kit de préparation ADN pour isoler l’ADN de 4. 5 millilitres de chaque culture selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l’ADN, éluez l’ADN à l’aide de 35 microlitres d’eau sans nucléase. Enfin, utilisez le 0 restant. 5 millilitres de chaque culture pour préparer des stocks de glycérol d’un millilitre en ajoutant 0,5 millilitre de glycérol à 100 % pour une dilution un à un. Placez ces aliquotes à moins 80 degrés Celsius pour les stocker jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Pour confirmer la réussite de la conjugaison par PCR, préparez d’abord un mélange maître PCR en ajoutant 75 microlitres de mélange maître PCR 2X dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, ajoutez 7,5 microlitres chacun d’une amorce directe de 10 micromolaires et d’une amorce inverse de 10 micromolaires conçue pour amplifier le gène de résistance à l’ampicilline du plasmide. Ensuite, préparez un deuxième mélange maître PCR en ajoutant 75 microlitres de mélange maître PCR 2X dans un tube de microcentrifugation, puis en ajoutant 7,5 microlitres chacun d’une amorce directe de 10 micromolaires et d’une amorce inverse de 10 micromolaires conçues pour amplifier un gène de nettoyage, dans ce cas l’ADN gyrase B.

Maintenant, ajoutez 15 microlitres du premier mélange principal dans un tube PCR, puis ajoutez 10 nanogrammes, environ deux microlitres de l’ADN expérimental de la matrice dans le même tube. Portez la réaction à un volume final de 25 microlitres avec de l’eau sans nucléases. Répétez ces étapes pour produire les cinq réactions restantes, de sorte que les tubes contiennent les composants illustrés ici. Maintenant, transférez ces réactions dans un thermocycleur avec le bloc préchauffé à 98 degrés Celsius, puis lancez le programme. Une fois la PCR terminée, retirez les tubes de la machine. Ensuite, chargez deux microlitres de chaque réaction mélangés à deux microlitres de colorant de chargement et quatre microlitres d’un marqueur de poids moléculaire dans des puits consécutifs d’un gel d’agarose à 1 %. Réglez le gel pour qu’il fonctionne à 150 volts pendant 20 minutes. Enfin, visualisez le gel à l’aide d’un illuminateur UV.

Dans cette expérience, le transfert réussi du gène de résistance à l’ampicilline par conjugaison a été confirmé par PCR. Ici, une bande d’environ 500 paires de bases doit être observée dans le puits contenant les amorces d’ADN conjugué et d’ampicilline, bien deux dans cet exemple. Un gène d’entretien, l’ADN gyrase B, a été chargé dans les puits trois et cinq avec de l’ADN conjugué et de l’ADN de cellule réceptrice, respectivement. Les bandes observées dans ces puits agissent comme un témoin positif pour s’assurer que la matrice d’ADN était présente et que la PCR a réussi. Il ne faut pas observer de bandes dans le puits contenant la réaction pour l’ADN de la cellule réceptrice et la paire d’amorces d’ampicilline, bien quatre dans cet exemple, car les cellules réceptrices ne sont pas résistantes à l’ampicilline. De plus, aucune bande ne devrait être observée dans les réactions dépourvues d’ADN matrice, puits six et sept ici. Si ces conditions sont remplies, cela confirmera le transfert réussi du gène de résistance à l’ampicilline, conférant une résistance à l’ampicilline de la souche WM3064 d’E. coli à la souche J53 d’E. coli.