6.12: Transduction via bactériophage : méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur au receveur E. coli

1. Mise en place

1. Avant de commencer tout travail impliquant des microbes, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Utilisez toujours le PPE nécessaire (manteau de laboratoire et gants).
2. Assurez-vous que les plaques d'agar LB avec 1x ampicilline, solution de lysate phage P1 disponible dans le commerce, chloroforme, 1 M de citrate de sodium, le glycérol, et une boîte de pointes de pipette en plastique pré-stérilisé et les épandeurs de cellules sont à portée de main.
3. Préparer la LB stérile en autoclamantisant et l'utiliser pour faire trois aliquots 1 mL de solution de sel LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 g), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2 % de glucose (100-20 g)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. citrate de sodium mM (25,806 mg)
4. Une fois terminé, stériliser toutes les surfaces ainsi que les gants à 70 % d'éthanol et se laver les mains.

2. Protocole

1. Préparation de la lysate phage de donneur
   1. Préparer une culture de 1 ml de la souche E3110 du donneur dans LB avec 1x ampicilline cultivée pendant la nuit à 37 oC avec aération et secousses à 220 tr/min.
   2. Diluer cette culture de nuit 1:100 dans 1 ml de LB frais complété avec 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, et 0,1-0,2% de glucose.
   3. Cultivez cette dilution bactérienne à 37 oC pendant 2 heures avec l'aération et en secouant à 220 tr/min.
   4. Une fois que ces cellules ont atteint la phase de croissance logarithmique précoce (croissance notable et légère turbidité), ajoutez 40 l de phage P1 disponible dans le commerce et laissez à 37 oC avec l'aération et secouant à 220 tr/min.
      1. Avant l'ajout de phage, la densité optique mesurée à 600 nm de ces cellules devrait être approximativement 0.4 (6).
   5. Surveillez les cellules pendant 1-3 heures jusqu'à ce que la culture se lysed.
      1. La lyse entraînera une augmentation des débris cellulaires ainsi qu'une diminution notable de la turbidité (c.-à-d. que les cellules seront considérées comme lysées une fois que l'on sera en mesure de voir à travers la culture).
   6. Ajouter plusieurs gouttes (50-100 l) de chloroforme au lysate et mélanger par vortex.
      1. Chloroforme stérilise le lysate phage en tuant les cellules donneuses restantes, ne laissant que du phage et augmentant le titer de ce lysate.
   7. Centrifugeuse lysate à 14 000 tr/min pendant 2 minutes pour enlever les débris et transférer le supernatant dans un tube frais.
   8. Ajouter quelques gouttes de chloroforme et conserver à 4 oC pendant au plus un jour.
2. Transduction
   1. Préparer une culture de 1 ml de la souche E. coli du receveur J53 cultivée pendant la nuit en LB à 37 oC avec l'aération et en secouant à 220 tr/min.
   2. Transférer 100 ll de lysate phage donneur (2,1) dans un tube de microfuge de 1,5 ml et couver avec un bouchon ouvert à 37 oC pendant 30 minutes.
      1. Cette incubation permet à tout chloroforme restant dans la solution de lysate P1 de s'évaporer avant d'être ajouté aux cellules receveuses.
   3. Cellules de souche de receveur de granules par centrifugation à 6.000 tr/min pendant 5 minutes.
   4. Resuspendre ces cellules dans 300 l de LB frais contenant 100 mM MgSO₄ et 5 mM CaCl₂. (Le phage P1 exige que le calcium soit infectieux).
   5. Mettre en place deux réactions à l'aide des cellules bactériennes réceptrices et du lysate phage du donneur préparé : 1) réaction de transduction combinant 100 'L receveur De la souche E. coli et 100 l de phage de phage de donneur, et 2) contrôle négatif combinant 100 souche J53 du receveur de l'Homme et 2) un contrôle négatif combinant 100 souches J53 du receveur de l'Homme E. coli et 100 l de LB contenant 100 mM MgSO₄ et 5 mM CaCl₂.
   6. Incuber à 37 oC pendant 30 minutes en secouant à 220 tr/min.
   7. Ajouter 1 ml lb et 200 citrate de sodium de 1 ML (pH-5,5) et couver pendant 1 heure à 37 oC en secouant à 220 tr/min.
      1. Citrate est utilisé pour réduire l'infectiosité de P1 en chélant avec du calcium, empêchant la lyse des bactéries receveurs.
      2. L'incubation de cette solution permet l'expression du marqueur de résistance à l'ampicilline.
   8. Pellet cellules par centrifugation à 6000 tr/min pendant 5 minutes.
   9. Resuspendre les granulés de cellules dans 100 L de LB avec 100 mM de citrate de sodium (pH 5,5). Vortex et plaque solution entière pour les deux réactions sur deux plaques d'agar LB.
      1. La plaque LB devrait avoir 1x Amp pour l'échantillon transdû et aucun ampli pour le contrôle négatif.
      2. La contamination par le phage P1 sur cette plaque nécessite un re-streaking avant que les stocks de congélateur puissent être préparés.
      3. Si le phage n'est pas enlevé, les cultures cultivées à partir de ces colonies ne se développeront que si en présence d'un chélateur de calcium.
   10. Choisissez environ 3-4 colonies des deux plaques et strie zons à nouveau sur deux plaques d'agar LB étalées avec 100 l de citrate de sodium de 1 M (pH-5,5).
       1. La plaque LB devrait avoir 1x Amp pour l'échantillon transdû et aucun ampli pour le contrôle négatif.
   11. Incuber les plaques à 37 oC pendant la nuit pour permettre aux colonies exemptes de phage de se développer.
   12. Choisissez les colonies des deux plaques et utilisez-les pour faire pousser des cultures de nuit dans 5 ml de LB à 37 oC avec l'aération et les secousses à 220 tr/min.
   13. Isoler l'ADN de ces cultures par miniprep d'ADN en utilisant 4,5 ml du volume total de culture.
       1. Adn d'Elute utilisant 35 l d'eau nucléane-
       2. Mesurez la concentration résultante par Nanodrop. L'ADN pur générera un rapport d'absorption (A_260/280) d'environ 1,8.
   14. Utilisez les 0,5 ml restants de chaque culture pour préparer 1 ml de glycérol en faisant un mélange 1:1 de 100% de glycérol et de culture bactérienne.
   15. Entreposer les stocks bactériens de glycérol à -80 oC.

3. Analyse des données et résultats

1. Confirmation de la transduction par qPCR
   1. Préparer deux mélanges de maître qPCR pour six réactions qPCR, trois à l'aide d'amorces qPCR pour le gène de résistance à l'ampicilline, et les trois autres à l'aide d'amorces qPCR pour un gène d'entretien ménager (14,5 L par réaction) : 12,5 l qPCR buffer mix - 1 'L amorce avant '1 'L' amorce inversée.
      1. Dans cette expérience, nous avons utilisé SYBR Green master mix.
      2. Les amorces de gène d'entretien ont été conçues pour amplifier un segment de l'ADN dans le gène bactérien codant pour le gyrase B d'ADN (7).
   2. Pour chaque réaction qPCR, combiner 100 g d'ADN de chaque réaction (10,5 l) avec 14,5 L de mix principal qPCR.
   3. À l'aide d'une machine qPCR et du protocole thermocycling énuméré séditié dans le tableau 1, l'amplification a été mesurée pour la résistance à l'ampicilline et les gènes d'entretien ménager pour les six réactions.
   4. Les valeurs cq générées par qPCR ont été utilisées pour calculer l'efficacité de transduction normalisée du gène de résistance à l'ampicilline (figure 3), confirmant la transduction réussie du gène de résistance à l'ampicilline.
      1. La valeur Cq, ou valeur de quantification du cycle, d'un échantillon est le plus ancien numéro de cycle PCR auquel un signal dépassant le seuil d'arrière-plan est détecté. Les faibles valeurs cqées correspondent à une séquence cible plus nombreuse, vice versa.
      2. L'efficacité de transduction normalisée d'un gène dans un échantillon peut être calculée à l'aide de ces valeurs cq en soustrayant la valeur du gène d'entretien ménager de celle du gène cible, générant une valeur cq, qui peut être utilisée pour calculer la transduction normalisée l'efficacité de 2^(-Cq).

Tableau 1 : Protocole de thermocyclisme qPCR

Les bactéries peuvent s’adapter rapidement à un environnement en évolution rapide en échangeant du matériel génétique et l’une des façons dont elles peuvent le faire est la transduction, l’échange de matériel génétique médié par des virus bactériens. Un bactériophage, souvent abrégé en phage, est un type de virus qui infecte les bactéries en se fixant d’abord à la surface de l’hôte, puis en injectant son ADN dans la cellule bactérienne. Il dégrade ensuite l’ADN de la cellule hôte et réplique son génome viral, tout en détournant la machinerie de la cellule pour synthétiser de nombreuses copies de ses protéines. Ces protéines de phages s’auto-assemblent ensuite et emballent les génomes des phages pour former une descendance multiple. Cependant, en raison de la faible fidélité du mécanisme d’emballage de l’ADN, le phage emballe parfois des fragments d’ADN bactérien dans la capside du phage. Après avoir induit la lyse de l’hôte, la descendance du phage est libérée et, une fois qu’un tel phage infecte une autre cellule hôte, il transfère le fragment d’ADN de son hôte précédent. Celui-ci peut ensuite se recombiner et s’incorporer de façon permanente dans le chromosome du nouvel hôte, favorisant ainsi le transfert de gènes entre les deux bactéries.

Pour effectuer la transduction de phages en laboratoire, il faut une souche donneuse qui contient un gène d’intérêt, une souche réceptrice qui n’en est pas dotée, un phage qui peut infecter les deux souches et une méthode pour sélectionner les bactéries transduites. Dans la plupart des cas, il s’agit d’un milieu de croissance solide sélectif qui favorise la croissance des bactéries transduites mais inhibe la croissance des bactéries non transduites. Pour commencer, la souche donneuse qui contient le gène d’intérêt est cultivée dans un milieu de croissance liquide. Lorsque toutes les bactéries se divisent activement dans la phase logarithmique de leur croissance, la culture est inoculée avec le phage cible. Après trois à quatre heures d’incubation, lorsque presque toutes les bactéries se sont lysées et ont libéré les particules de phage, le lysat de phage donneur est inoculé dans une culture fraîchement cultivée de la souche bactérienne receveuse. Après une brève incubation d’une heure, la culture doit maintenant contenir un mélange de cellules bactériennes transduites et non transduites, qui est analysé pour les cellules transduites en étalant une fraction de la suspension sur un milieu de croissance solide sélectif approprié. Lors d’une incubation ultérieure, les cellules transduites devraient croître et se multiplier pour produire des colonies visibles. Ces colonies peuvent ensuite être sélectionnées pour une analyse plus approfondie à l’aide de diverses méthodes afin de confirmer la réussite de la transduction, telles que la PCR de colonie, le séquençage de l’ADN ou la PCR quantitative.

Avant de commencer l’intervention, enfilez tout équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 % et essuyez la surface.

Après cela, préparez trois aliquotes d’un millilitre de solution saline LB. Maintenant, préparez une culture de souche donneuse en ajoutant 100 microlitres d’E. coli dans un flacon conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de milieu de croissance LB avec 500 microgrammes d’ampicilline. Ensuite, cultivez la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec aération et agitation à 220 tr/min. Le lendemain, essuyez le plan de travail avec de l’éthanol à 70 % avant de retirer la culture de l’incubateur à agitation. Ensuite, diluez la culture de nuit de un à 100 en ajoutant 10 microlitres de souche donneuse à 990 microlitres de LB frais complété par une solution saline.

Laissez la dilution bactérienne croître à 37 degrés Celsius pendant deux heures avec aération et agitation à 220 tr/min. Une fois que les cellules ont atteint la phase logarithmique précoce, retirez la culture de l’incubateur, ajoutez 40 microlitres de phage P1 à la culture et incubez à nouveau. Continuez à surveiller les cellules pendant une à trois heures jusqu’à ce que la culture soit lysée. Ensuite, ajoutez 50 à 100 microlitres de chloroforme au lysat et mélangez par vortex. Ensuite, centrifugez le lysat pour éliminer les débris et transférez le surnageant dans un tube frais. Ajoutez quelques gouttes de chloroforme au surnageant et conservez-le à quatre degrés Celsius pendant une journée au maximum.

Pour commencer la procédure de transduction, obtenir une culture d’un millilitre de souche réceptrice. Ensuite, transférez 100 microlitres de lysat de phage donneur dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et incuberez-le à 37 degrés Celsius avec le capuchon ouvert pendant 30 minutes pour permettre au chloroforme restant de s’évaporer. Pendant l’incubation du lysat du phage donneur, granulez les cellules souches réceptrices par centrifugation douce. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 300 microlitres de LB frais contenant 100 millimolaires de sulfate de magnésium et cinq millimolaires de chlorure de calcium.

Ensuite, mettez en place la réaction de transduction en combinant 100 microlitres de la souche réceptrice et 100 microlitres de lysat de phage donneur dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, mettez en place le contrôle négatif en combinant 100 microlitres de la souche réceptrice et 100 microlitres de la LB avec du sulfate de magnésium et du chlorure de calcium. Après l’incubation, ajoutez 200 microlitres d’une molaire de citrate de sodium et un millilitre de LB dans les deux tubes, et mélangez en pipetant doucement de haut en bas. Ensuite, après que les tubes aient été incubés pendant une heure, granulez doucement les cellules par centrifugation.

Après la centrifugation, jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de LB avec 100 millimolaires de citrate de sodium. Vortex les solutions et pipetez l’ensemble de l’échantillon transduit sur une plaque de gélose LB avec de l’ampicilline 1X. Enfin, pipetez tout le volume du mélange de cellules de contrôle négatif sur une plaque de gélose LB sans ampicilline. Après avoir incubé les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius, utilisez une pointe de pipette stérile pour prélever trois à quatre colonies de la plaque de transduction et les étaler sur une nouvelle plaque de gélose LB contenant 1X ampicilline et 100 microlitres de citrate de sodium molaire. Répétez cette méthode de placage pour le contrôle négatif sur une autre plaque de gélose LB contenant seulement 100 microlitres d’une molaire de citrate de sodium. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre aux colonies exemptes de phage de se développer.

Le lendemain, essuyez le plan de travail avec de l’éthanol à 70 % avant de retirer vos assiettes de l’incubateur. À l’aide d’une pointe de pipette stérile, prélevez trois colonies dans la plaque de transduction et ajoutez-les chacune dans un tube séparé contenant cinq millilitres de milieu LB. Ensuite, sélectionnez trois colonies dans la plaque de contrôle négatif et ajoutez-les dans un autre tube contenant cinq millilitres de milieu LB. Cultivez les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec aération et agitation à 220 tr/min. Après avoir stérilisé la paillasse comme démontré précédemment, utilisez un kit de mini-préparation d’ADN pour isoler l’ADN de 4,5 millilitres de chaque culture selon les instructions du fabricant. Ensuite, éluez l’ADN avec 35 microlitres d’eau sans nucléase et mesurez la concentration résultante à l’aide d’un spectrophotomètre de laboratoire. Enfin, préparez des stocks de glycérol en ajoutant les 0,5 millilitres restants des deux solutions bactériennes à 0,5 millilitre de glycérol à 100 %.

Pour confirmer la transduction, préparez d’abord deux mélanges maîtres qPCR pour 24 réactions qPCR. Pour le premier mélange maître, ajoutez 150 microlitres de mélange tampon qPCR dans un tube de microcentrifugation et 12 microlitres chacun d’une amorce avant et d’une amorce inverse conçue pour amplifier le gène de résistance à l’ampicilline. Ensuite, préparez un deuxième mélange maître qPCR en ajoutant 150 microlitres de mélange maître qPCR dans un tube de microcentrifugation, puis en ajoutant 12 microlitres chacun d’une amorce avant et d’une amorce inverse conçues pour amplifier un gène de nettoyage.

Pour chaque réaction qPCR, combinez 100 microgrammes d’ADN expérimental de chaque réaction avec 14,5 microlitres de mélange maître qPCR. Maintenant, préparez les réactions restantes comme démontré précédemment. Transférez les réactions dans un thermocycleur préchauffé à 94 degrés Celsius, puis lancez le programme. Enfin, utilisez les valeurs de quantification du cycle, ou Cq, générées par la qPCR pour calculer l’efficacité de transduction normalisée du gène de résistance à l’ampicilline.

Les valeurs de quantification du cycle, ou Cq, pour les gènes d’intérêt ont été compilées pour chacun des témoins négatifs et des échantillons transduis. De faibles valeurs Cq, généralement inférieures à 29 cycles, comme les échantillons traduits dans cet exemple, indiquent des quantités élevées de la séquence cible.

Un gène d’entretien, également présenté ici, est utilisé comme contrôle de charge pour normaliser la quantité d’ADN dans chaque réaction et comme contrôle positif pour s’assurer que la qPCR fonctionne. À condition que les mêmes quantités du gène housekeeping soient chargées, on le trouve à un rythme relativement égal dans chaque échantillon.

Ensuite, pour calculer la valeur delta Cq pour chaque échantillon, soustrayez la valeur Cq du gène housekeeping pour chaque échantillon de la valeur Cq de son gène cible correspondant. Par exemple, le delta Cq du premier témoin négatif est de 13,54. Ensuite, utilisez cette valeur pour calculer l’efficacité de transduction normalisée de chaque échantillon à l’aide de la formule présentée ici. Enfin, l’efficacité de transduction moyenne normalisée pour chaque groupe d’échantillons peut être calculée.