Transduction via bactériophage : méthode de transfert de la résistance à l'ampicilline du donneur au receveur E. coli

1. Mise en place

1. Avant de commencer tout travail impliquant des microbes, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Utilisez toujours le PPE nécessaire (manteau de laboratoire et gants).
2. Assurez-vous que les plaques d'agar LB avec 1x ampicilline, solution de lysate phage P1 disponible dans le commerce, chloroforme, 1 M de citrate de sodium, le glycérol, et une boîte de pointes de pipette en plastique pré-stérilisé et les épandeurs de cellules sont à portée de main.
3. Préparer la LB stérile en autoclamantisant et l'utiliser pour faire trois aliquots 1 mL de solution de sel LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 g), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2 % de glucose (100-20 g)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. citrate de sodium mM (25,806 mg)
4. Une fois terminé, stériliser toutes les surfaces ainsi que les gants à 70 % d'éthanol et se laver les mains.

2. Protocole

1. Préparation de la lysate phage de donneur
   1. Préparer une culture de 1 ml de la souche E3110 du donneur dans LB avec 1x ampicilline cultivée pendant la nuit à 37 oC avec aération et secousses à 220 tr/min.
   2. Diluer cette culture de nuit 1:100 dans 1 ml de LB frais complété avec 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂, et 0,1-0,2% de glucose.
   3. Cultivez cette dilution bactérienne à 37 oC pendant 2 heures avec l'aération et en secouant à 220 tr/min.
   4. Une fois que ces cellules ont atteint la phase de croissance logarithmique précoce (croissance notable et légère turbidité), ajoutez 40 l de phage P1 disponible dans le commerce et laissez à 37 oC avec l'aération et secouant à 220 tr/min.
      1. Avant l'ajout de phage, la densité optique mesurée à 600 nm de ces cellules devrait être approximativement 0.4 (6).
   5. Surveillez les cellules pendant 1-3 heures jusqu'à ce que la culture se lysed.
      1. La lyse entraînera une augmentation des débris cellulaires ainsi qu'une diminution notable de la turbidité (c.-à-d. que les cellules seront considérées comme lysées une fois que l'on sera en mesure de voir à travers la culture).
   6. Ajouter plusieurs gouttes (50-100 l) de chloroforme au lysate et mélanger par vortex.
      1. Chloroforme stérilise le lysate phage en tuant les cellules donneuses restantes, ne laissant que du phage et augmentant le titer de ce lysate.
   7. Centrifugeuse lysate à 14 000 tr/min pendant 2 minutes pour enlever les débris et transférer le supernatant dans un tube frais.
   8. Ajouter quelques gouttes de chloroforme et conserver à 4 oC pendant au plus un jour.
2. Transduction
   1. Préparer une culture de 1 ml de la souche E. coli du receveur J53 cultivée pendant la nuit en LB à 37 oC avec l'aération et en secouant à 220 tr/min.
   2. Transférer 100 ll de lysate phage donneur (2,1) dans un tube de microfuge de 1,5 ml et couver avec un bouchon ouvert à 37 oC pendant 30 minutes.
      1. Cette incubation permet à tout chloroforme restant dans la solution de lysate P1 de s'évaporer avant d'être ajouté aux cellules receveuses.
   3. Cellules de souche de receveur de granules par centrifugation à 6.000 tr/min pendant 5 minutes.
   4. Resuspendre ces cellules dans 300 l de LB frais contenant 100 mM MgSO₄ et 5 mM CaCl₂. (Le phage P1 exige que le calcium soit infectieux).
   5. Mettre en place deux réactions à l'aide des cellules bactériennes réceptrices et du lysate phage du donneur préparé : 1) réaction de transduction combinant 100 'L receveur De la souche E. coli et 100 l de phage de phage de donneur, et 2) contrôle négatif combinant 100 souche J53 du receveur de l'Homme et 2) un contrôle négatif combinant 100 souches J53 du receveur de l'Homme E. coli et 100 l de LB contenant 100 mM MgSO₄ et 5 mM CaCl₂.
   6. Incuber à 37 oC pendant 30 minutes en secouant à 220 tr/min.
   7. Ajouter 1 ml lb et 200 citrate de sodium de 1 ML (pH-5,5) et couver pendant 1 heure à 37 oC en secouant à 220 tr/min.
      1. Citrate est utilisé pour réduire l'infectiosité de P1 en chélant avec du calcium, empêchant la lyse des bactéries receveurs.
      2. L'incubation de cette solution permet l'expression du marqueur de résistance à l'ampicilline.
   8. Pellet cellules par centrifugation à 6000 tr/min pendant 5 minutes.
   9. Resuspendre les granulés de cellules dans 100 L de LB avec 100 mM de citrate de sodium (pH 5,5). Vortex et plaque solution entière pour les deux réactions sur deux plaques d'agar LB.
      1. La plaque LB devrait avoir 1x Amp pour l'échantillon transdû et aucun ampli pour le contrôle négatif.
      2. La contamination par le phage P1 sur cette plaque nécessite un re-streaking avant que les stocks de congélateur puissent être préparés.
      3. Si le phage n'est pas enlevé, les cultures cultivées à partir de ces colonies ne se développeront que si en présence d'un chélateur de calcium.
   10. Choisissez environ 3-4 colonies des deux plaques et strie zons à nouveau sur deux plaques d'agar LB étalées avec 100 l de citrate de sodium de 1 M (pH-5,5).
       1. La plaque LB devrait avoir 1x Amp pour l'échantillon transdû et aucun ampli pour le contrôle négatif.
   11. Incuber les plaques à 37 oC pendant la nuit pour permettre aux colonies exemptes de phage de se développer.
   12. Choisissez les colonies des deux plaques et utilisez-les pour faire pousser des cultures de nuit dans 5 ml de LB à 37 oC avec l'aération et les secousses à 220 tr/min.
   13. Isoler l'ADN de ces cultures par miniprep d'ADN en utilisant 4,5 ml du volume total de culture.
       1. Adn d'Elute utilisant 35 l d'eau nucléane-
       2. Mesurez la concentration résultante par Nanodrop. L'ADN pur générera un rapport d'absorption (A_260/280) d'environ 1,8.
   14. Utilisez les 0,5 ml restants de chaque culture pour préparer 1 ml de glycérol en faisant un mélange 1:1 de 100% de glycérol et de culture bactérienne.
   15. Entreposer les stocks bactériens de glycérol à -80 oC.

3. Analyse des données et résultats

1. Confirmation de la transduction par qPCR
   1. Préparer deux mélanges de maître qPCR pour six réactions qPCR, trois à l'aide d'amorces qPCR pour le gène de résistance à l'ampicilline, et les trois autres à l'aide d'amorces qPCR pour un gène d'entretien ménager (14,5 L par réaction) : 12,5 l qPCR buffer mix - 1 'L amorce avant '1 'L' amorce inversée.
      1. Dans cette expérience, nous avons utilisé SYBR Green master mix.
      2. Les amorces de gène d'entretien ont été conçues pour amplifier un segment de l'ADN dans le gène bactérien codant pour le gyrase B d'ADN (7).
   2. Pour chaque réaction qPCR, combiner 100 g d'ADN de chaque réaction (10,5 l) avec 14,5 L de mix principal qPCR.
   3. À l'aide d'une machine qPCR et du protocole thermocycling énuméré séditié dans le tableau 1, l'amplification a été mesurée pour la résistance à l'ampicilline et les gènes d'entretien ménager pour les six réactions.
   4. Les valeurs cq générées par qPCR ont été utilisées pour calculer l'efficacité de transduction normalisée du gène de résistance à l'ampicilline (figure 3), confirmant la transduction réussie du gène de résistance à l'ampicilline.
      1. La valeur Cq, ou valeur de quantification du cycle, d'un échantillon est le plus ancien numéro de cycle PCR auquel un signal dépassant le seuil d'arrière-plan est détecté. Les faibles valeurs cqées correspondent à une séquence cible plus nombreuse, vice versa.
      2. L'efficacité de transduction normalisée d'un gène dans un échantillon peut être calculée à l'aide de ces valeurs cq en soustrayant la valeur du gène d'entretien ménager de celle du gène cible, générant une valeur cq, qui peut être utilisée pour calculer la transduction normalisée l'efficacité de 2^(-Cq).

	température	temps
Dénaturation	94 oC	2 min
40 cycles:
Dénaturation	94 oC	15 sec
Annealing, extension, et fluorescence lire	60 oC ou 5 oC au-dessous de l'apprêt le plus bas Tm	1 min

Tableau 1 : Protocole de thermocyclisme qPCR