Amplification rapide des extrémités d'ADNc

1. Expérience mise en place pour 3' RACE

1. Concevoir une amorce spécifique 5' pour un gène d’intérêt (amorce spécifique du gène 1, GSP-1). Il doit être très spécifique, car c’est le seul apprêt qui introduit de la spécificité. Par conséquent, une amorce relativement longue serait préférable (longueur typique autour de 24 nucléotides, Tm allant de 55 à 65°C).
2. Concevez une deuxième amorce imbriquée (GSP-2), c’est-à-dire que l’amorce doit être située à 3' de GSP-1. Cette étape est facultative, mais la réalisation d’une deuxième PCR avec une amorce emboîtée augmentera le rendement et la spécificité de la PCR pour le gène d’intérêt. Les amorces utilisées pour amplifier l’ADNc dSmad2 sont énumérées dans le tableau 2.

2. Synthèse de l’ADNc

1. Extraire l’ARN des échantillons, à l’aide d’une méthode ou d’un kit d’extraction d’ARN en suivant le protocole du fabricant. Traitez les échantillons avec de la DNase pour éviter l’amplification de l’ADN génomique. Dans notre exemple, nous avons extrait l’ARN de 10 mouches adultes entières.
2. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et ajustez-la avec de l’eau libre de RNase jusqu’à un maximum de 100 ng/μl si nécessaire.
3. Préparez l’ADNc dans une réaction de transcription inverse (RT), à l’aide d’un kit recommandé pour RACE. Préparez un master mix, avec les réactifs suivants par échantillon :
   - 4 μl Tampon de transcription inverse (5x)
   - 2 μl d’oligo(dT)₂₀ primer (un oligo composé de 20 désoxythymidines)
   - 10 μl d’ARN (max. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl de transcriptase inverse
   - TOTAL : 20 μl
4. Incuber la réaction pendant 90 min à 42ºC. Inclure un témoin négatif omettant la transcriptase inverse.
5. Inactiver la transcriptase inverse en l’incubant à 85ºC pendant 5 min.
6. Afin de diluer les niveaux d’ADN pour une PCR efficace, ajoutez 80 μl de tampon TE pour porter le volume total à 100 μl.

3. Amplification de fragments d’ADNc

1. Préparez le mélange PCR d’amplification de premier tour à l’aide d’une polymérase Taq haute fidélité (HF) :
   - 4 μl 5x tampon polymérase HF Taq
   - Mélange dNTP de 0,4 μl (10 mM chacun)
   - 1 μl d’amorce GSP1 (10 μM)
   - 1 μl d’amorce Oligo(dT)20 (10 μM)
   - 1 μl de modèle d’ADNc
   - 0,2 μl d’ADN polymérase HF Taq
   - 12,4 μl de ddH2O
   - Total : 20 μl
2. Exécutez la PCR à l’aide du programme PCR1 (Tableau 1). Inclure un contrôle négatif en utilisant comme matrice le produit d’ARN original sans RT. De plus, un contrôle « sans amorce » peut être inclus.
3. Facultatif : PCR imbriquée pour augmenter la spécificité et la quantité de produits d’ADNc. Diluer 1 μl des produits de PCR et le témoin négatif 1:20 dans le tampon TE. Utilisez-les comme modèle pour les secondes réactions PCR :
   - 4 μl 5x HF Taq tampon polymérase
   - 0,4 μl de mélange dNTP (10 mM chacun)
   - 1 μl d’amorce GSP2 (10 μM)
   - 1 μl d’oligo(dT)₂₀ amorce (10 μM)
   - Modèle de produit PCR de 1 μl
   - 0,2 μl d’ADN polymérase HF Taq
   - 12,4 μl de ddH2O
   - Total : 20 μl
4. Exécutez la deuxième PCR à l’aide du programme PCR2 (Tableau 1)

4. Isolement des fragments d’ADNc

1. Préparez un gel d’agarose à 1-2 % avec un tampon TAE, en utilisant du bromure d’éthidium ou un autre colorant d’ADN.
2. Mélangez 5 μl d’échantillon avec 1 μl de tampon de chargement de gel 6x.
3. Chargez les échantillons et l’échelle d’ADN de 1 kb comme marqueur et faites fonctionner le gel à 120 V pendant environ 45 minutes ou jusqu’à ce que le front du colorant soit à ~75 % du chemin vers le bas du gel. Assurez-vous que les échantillons ne s’épuisent pas du gel.
4. Vérifiez les bandes de gel sous une lampe UV. Pour un traitement ultérieur des produits, utilisez des UV de faible intensité, localisez les bandes amplifiées et coupez-les du gel à l’aide d’un scalpel.
5. Purifiez l’ADN du gel en utilisant une méthode comme la congélation ou un kit.
6. Stockez les fragments d’ADNc purifiés à -20 °C ou utilisez-les immédiatement pour d’autres applications, telles que le séquençage ou le clonage.