Amplification rapide des extrémités d'ADNc

En règle générale, avec les nouveaux ARNm, seule une partie de leur séquence complète est connue. Les séquences nucléotidiques manquantes aux extrémités de l’ARNm peuvent être déterminées à l’aide d’une méthode basée sur la PCR appelée Amplification rapide des extrémités de l’ADNc, ou RACE.

Chez les eucaryotes, les ARNm matures ont des caractéristiques structurelles distinctives aux deux extrémités. À l’extrémité cinq primes, la plupart ont un résidu de guanosine méthylée connecté à l’ARNm via une liaison triphosphate cinq primes à cinq primes. Ceci est également connu sous le nom de plafond à cinq nombres premiers. À l’extrémité trois premiers, la plupart des eucaryotes ont une queue de 20 à 250 résidus d’adénylate, appelée queue poly(A).

Maintenant, si la séquence nucléotidique, même d’un petit segment, est connue n’importe où dans l’ARNm, la séquence jusqu’à son extrémité trois premiers peut être amplifiée à l’aide d’une amorce spécifique au gène et d’une amorce oligo(dT) non spécifique qui recuit à la queue poly(A) à l’extrémité trois primes. Ce sous-ensemble de la technique RACE est appelé RARACE à trois nombres premiers, et il permet de détecter des variantes de transcription et différentes régions non traduites à trois nombres premiers, ou UTR.

La séquence à l’extrémité cinq premiers peut être amplifiée de la même manière. Pour ce faire, une queue poly(A) est d’abord attachée à l’extrémité cinq premiers. Ensuite, à l’aide d’une amorce oligo(dT) non spécifique qui recuit à la queue ajoutée et d’une amorce spécifique au gène, la séquence jusqu’à l’extrémité cinq premières peut être amplifiée. Ce sous-ensemble de RACE est connu sous le nom de RACE à cinq nombres premiers et est utilisé pour trouver des variantes d’épissage différentielles à cinq nombres premiers et des UTR alternatifs à cinq nombres premiers.

Pour effectuer l’identification de différents transcrits codés par un gène donné, l’ARN est d’abord isolé de l’organisme ou du tissu d’intérêt. Ensuite, l’ADNc est synthétisé à partir des ARNm isolés avec une réaction de transcription inverse qui utilise une amorce oligo(dT) et une enzyme transcriptase inverse, qui génère de l’ADN complémentaire à partir d’une matrice d’ARN. Ensuite, à partir du pool généré d’ADNc, l’extrémité inconnue à trois premiers de l’ADNc cible est étendue par PCR, en utilisant l’amorce oligo(dT) non spécifique et une amorce spécifique au gène, et amplifiée pendant la réaction PCR.

Cependant, en raison de la nature générique de l’amorce non spécifique et de l’amorçage erroné aléatoire par l’amorce spécifique du gène, ils peuvent se recuire en ADNc hors cible, ce qui les amène également à s’amplifier. Pour surmonter ce problème, une deuxième série de PCR est effectuée à l’aide d’amorces emboîtées, qui se lient en aval du premier ensemble d’amorces. Cette deuxième série d’amorces amplifie davantage l’ADNc d’intérêt, mais pas le produit non spécifique, augmentant ainsi la spécificité et le rendement de la réaction.

Enfin, les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, qui sépare différents transcrits du gène cible en fonction de leur taille, produisant des bandes distinctes. La bande d’intérêt peut ensuite être excisée, purifiée et enfin séquencée pour obtenir la séquence complète du transcrit.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer la technique RACE à trois premiers pour identifier et isoler différents transcrits codés par le gène dSmad2 de la drosophile.

Avant de commencer la synthèse et l’amplification de l’ADNc, utilisez un logiciel de conception d’amorces pour créer une amorce spécifique à cinq premiers pour le gène d’intérêt, dSmad2 dans cet exemple. Pour s’assurer que l’amorce est très spécifique, elle doit être d’environ 24 nucléotides et avoir une Tm allant de 55 à 65 degrés Celsius. Ensuite, concevez une deuxième amorce imbriquée située à trois premiers de la première amorce, qui est également spécifique à la séquence cible.

Pour commencer, extrayez l’ARN de 10 mouches adultes entières à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN disponible dans le commerce. Une fois l’ARN extrait, remettre la pastille en suspension dans 20 microlitres d’eau sans nucléases. Pour une réaction de 50 microlitres, ajoutez 5 microlitres de tampon de réaction dans chaque tube d’échantillon et augmentez le volume de la réaction en ajoutant 24 microlitres d’eau sans nucléases. Ensuite, ajoutez 1 microlitre de DNase I pour empêcher l’amplification de l’ADN génomique. Enfin, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après le traitement à la DNase, inactivez l’enzyme avec 1 microlitre d’EDTA de 25 millimolaires dans chacun des tubes. Ajoutez l’échantillon à une colonne de spin pour purifier l’ARN. Ensuite, utilisez un spectrophotomètre à microvolume pour mesurer la concentration d’ARN. Ajustez la concentration à 100 nanogrammes par microlitre en ajoutant de l’eau sans nucléases.

Maintenant, préparez un mixage maître pour la réaction de transcription inverse. En plus des échantillons d’ADN testés, inclure un témoin négatif en omettant la transcriptase inverse du tube approprié. Incuber les réactions pendant 90 minutes à 42 degrés Celsius. Ensuite, inactivez la transcriptase inverse en incubant les tubes à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, diluez les niveaux d’ADN en ajoutant 80 microlitres de tampon TE dans chaque tube pour porter le total de la réaction à 100 microlitres.

Maintenant que l’ADNc est synthétisé, amplifiez le gène d’intérêt via la PCR. Pour ce faire, préparez d’abord le premier mélange PCR d’amplification. En plus de la matrice d’ADNc, incluez une réaction de contrôle négative qui utilise la matrice du produit non transcrit en retour, ainsi qu’une réaction qui n’a pas l’amorce spécifique du gène comme témoin sans amorce.

Une fois les réactions préparées, effectuez des amplifications PCR dans un thermocycleur équipé d’un couvercle chauffant. Ensuite, diluez les produits 1 à 20 en ajoutant 1 microlitre de produits PCR à 19 microlitres de tampon TE. À l’aide de ces produits dilués, préparez le deuxième mélange PCR d’amplification. Ensuite, utilisez un thermocycleur pour effectuer la deuxième PCR.

Pour isoler les fragments de PCR, préparez un gel d’agarose à 1 % en ajoutant 1 gramme d’agarose pour 100 millilitres de tampon TAE. Faites fondre le mélange pendant deux minutes au micro-ondes, puis ajoutez la coloration SYBR Safe ou le bromure d’éthidium. Versez le mélange fondu dans un bac à gel et laissez-le prendre.

Pendant que le gel durcit, pipetez des gouttelettes de 1 microlitre de colorant de chargement 6X sur un morceau de parafilm correspondant au nombre d’échantillons. Ajouter 5 microlitres d’échantillon à chaque gouttelette. Maintenant, chargez les échantillons, ainsi qu’une échelle d’ADN de 1 kilobase, sur le gel. Faites fonctionner le gel à 120 volts pendant environ 45 minutes ou jusqu’à ce que le front du colorant soit à 75 % du gel.

Lorsque le gel a fini de couler, vérifiez les bandes de gel sous un transilluminateur UV. Localisez les bandes et découpez-les à l’aide d’un scalpel. Purifiez les fragments d’ADNc à l’aide d’un kit de colonne de spin disponible dans le commerce. Une fois purifiés, les fragments d’ADNc peuvent être stockés à moins 20 degrés Celsius ou utilisés immédiatement pour une analyse plus approfondie.

Avant cette expérience, deux transcrits de Drosophila dSmad2 ont été annotés dans la base de données génomique de la drosophile, FlyBase. Sur la base de l’épissage attendu de ce gène, deux produits devraient être identifiés par le protocole RACE à trois primes.

Les résultats de cette expérience révèlent toutefois trois transcrits différents pour dSmad2. Parmi les produits prédits, un transcrit est prédominant et un autre est exprimé à un niveau inférieur. De plus, un produit plus petit non décrit auparavant, visible à 750 paires de bases, a été détecté.