Name: Impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez l'impression par microcontact pour la biologie cellulaire en utilisant la lithographie souple et la fibronectine sur verre. Cette méthode permet de recréer des environnements extracellulaires complexes pour étudier l'adhésion cellulaire.

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1. Préparation des solutions et des matériaux Ces étapes doivent être réalisées plusieurs jours à l&#39;avance. <ol><li> Lamelles de verre. Lamelles ont été nettoyés par immersion pendant 10 minutes dans une solution de détergent Linbro 7X: l&#39;eau, mélangée à un 1: 3 et chauffée, sous agitation, jusqu&#39;à ce qu&#39;il dégage. Lamelles ont été rincés abondamment à l&#39;eau déminéralisée, puis cuite au four à 450 ° C pendant 6 heures. Chargement des lamelles en racks coloration céramique (voir réactifs) ont simplifié ce processus. </li><li> Solution de protéines pour l&#39;estampage. Fibronectine Reconstituer en suivant les instructions des fabricants d&#39;une solution stock de 1 mg / ml de concentration. </li></ol> 2. Cast timbres du maître topologique Ces étapes peuvent être réalisées plusieurs jours à l&#39;avance. Timbres magasin pattern-up dans un plat couvert, comme une boîte de culture tissulaire. <ol><li> Enlever la poussière détacher de maître en utilisant un flux de comprimé, air filtré ou gaz inerte. </li><li> Placez le maître, côté à motifs en place, dans le fond d&#39;un plat en plastique juste plus grand que le maître. 60 - ou 100-mm boîtes de culture tissulaire sont bien adaptés à cet effet. </li><li> Dans un tube à centrifuger en polystyrène de 50 ml, mélanger les composants Sylgard dans un rapport de l&#39;agent de durcissement: la base d&#39;élastomère de 1: 10 en poids. Mélanger soigneusement en utilisant un dispositif en plastique, comme une pipette jetable. Préparer au moins 0,2 ml d&#39;élastomère par centimètre carré de surface plat. </li><li> Centrifuger le tube de 50 ml à 300 g pendant 5 min pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Verser l&#39;élastomère sur le maître, puis placer dans un dessiccateur sous vide, pendant 30 minutes. </li><li> Cure de l&#39;élastomère dans un four à 65 ° C pendant au moins 2 heures. Durcissement à température élevée et pour des résultats parfois plus en plus rigide élastomère. Laissez refroidir à température ambiante. </li><li> Séparer la feuille de timbres du maître. </li></ol> 3. Impression par microcontact de la fibronectine sur le verre <ol><li> Découpez un timbre unique. Timbres mesurant 4 mm x 4 mm à 1 cm X 1 cm dans la zone et 1 - 2 mm d&#39;épaisseur sont les plus faciles pour commencer. Côté tendance Placer sur une lame de verre ou un plat en plastique. </li><li> Placez timbre dans un nettoyeur à plasma, et le processus, sous vide, pendant 30 secondes. Un Harrick scientifique Plasma cleaner (voir équipement), fixé à son cadre le plus élevé de sortie sera de rendre la surface hydrophile PDMS. Plus conséquent fois dans la fissuration de l&#39;élastomère. </li><li> Diluer la solution de fibronectine à l&#39;eau déminéralisée à une concentration d&#39;emboutissage de 50 pg / ml. </li><li> Placer une petite goutte (10 - 50 pi) de l&#39;estampage solution sur le timbre. Elle se propage à travers la surface hydrophile. Ajoutez seulement assez de solution que la chute couvre le timbre, mais ne fonctionne pas sur les bords. Laissez absorber des protéines pour éradiquer pendant 5 minutes. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un Kimwipe ® ou d&#39;autres tissus de papier propre, mèche pied la plupart de la solution de protéines à partir du timbre, sans toucher la région à motifs. </li><li> Sécher la solution restante de la marque sous un courant d&#39;eau propre, sec, gaz inerte, tel que l&#39;azote. </li><li> En utilisant une pince à épiler, retirez le tampon de la lame de verre, inverser, et mettre en contact avec la lamelle de verre nettoyée (la surface à motifs). Placez un poids dessus pour promouvoir un bon contact. Le poids spécifique qui fournit la meilleure structuration dépend de la taille d&#39;un timbre et le modèle; commencer avec un poids de 5 g, et d&#39;ajuster entre estampées. Laisser timbre en contact avec la surface pendant 1 minutes. </li><li> Soigneusement démonter la pile, et le cachet distinct de lamelle. </li><li> Vigoureusement rincer la lamelle à motifs en PBS, puis de l&#39;eau déminéralisée, pour éliminer les protéines qui ne sont pas adsorbés à la surface. Lamelle à sec sous un courant d&#39;azote. </li></ol> Les résultats représentatifs Impression par microcontact est un puissant processus de molécules sur les surfaces de motifs. Ce processus a la possibilité de créer des fonctions avec des dimensions allant de quelques dizaines de micromètres à quelques centaines de nanomètres; dans la Fig. 1A, les logos sur la gauche sont chacun 200 um de hauteur, tandis que les taches vertes illustré dans la figure. 1B sont une um de diamètre et espacés à intervalles de 4 um, mesurée de centre à centre. Fig. 1B illustre également une propriété de la puissante impression par microcontact, à savoir qu&#39;il est et de processus additif. Plusieurs séries d&#39;impression par microcontact peut être appliquée à une surface unique de créer des systèmes multicomposants 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Figure A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Figure B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Le processus d&#39;impression par microcontact est conceptuellement simple et très robuste, ayant été appliqué à la structuration un large éventail de molécules sur une variété de substrats. Cependant, ce processus reste quelque chose d&#39;un art. La géométrie spécifique de la structure à créer, protéine à motifs, le poids appliqué, et le revêtement / conditions d&#39;emboutissage tous affecter la qualité d&#39;emboutissage. Par exemple, trop peu de poids, appliquée à grands traits, aboutit souvent à des lacunes dans le modèle comme on peu...

<table><tbody><tr><td>Nettoyeur à plasma</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Exsiccateur</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Kit de marquage des protéines</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Support pour coloration</td><td>Réactif</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Lames couvre-objets</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Réactif</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Réseau de diffraction</td><td>Réactif</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

La capacité de protéines modèle et d&#39;autres biomolécules sur des substrats est important pour saisir la complexité spatiale de l&#39;environnement extracellulaire. Développement de l&#39;impression par microcontact par le groupe Whitesides (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) Dans le milieu des années 1990 a révolutionné ce domaine en faisant de la microélectronique / techniques de microfabrication accessibles aux laboratoires axés sur les sciences de la vie. Implémentations initiales de cette méthode utilisée polydiméthylsiloxane (PDMS) timbres pour créer des modèles de produits chimiques sur des surfaces fonctionnalisées matériels<sup&gt; 1</sup&gt;. Depuis lors, une série d&#39;approches innovantes ont été développées pour les molécules autre motif, y compris les protéines<sup&gt; 2</sup&gt;. Cette vidéo montre le processus de base de création des timbres de PDMS et les utilise pour des protéines motif, que ces mesures sont difficiles à exprimer avec précision des mots. Nous nous concentrons sur la structuration de la fibronectine de la matrice extracellulaire de protéines sur des lamelles de verre comme un exemple précis de structuration. Un élément important du processus d&#39;impression par microcontact est un maître topologique, à partir de laquelle les timbres sont exprimés; les régions soulevé et abaissé du maître sont reflétées dans le timbre et définissent le modèle final. Typiquement, un maître est constitué d&#39;un wafer de silicium recouvert de résine photosensible et ensuite modelé par photolithographie, comme c&#39;est le cas ici. Création de master comportant un modèle spécifique nécessite un équipement spécialisé, et il est préférable d&#39;aborder en consultation avec un centre de fabrication ou de l&#39;installation. Cependant, presque tout substrat avec la topologie peut être utilisé comme un maître, comme des réseaux de diffraction en plastique (voir Réactifs pour un exemple), et ces maîtres fortuite de fournir facilement disponibles, les modèles simples. Ce protocole commence au point d&#39;avoir un maître dans la main.

Impression par microcontact est largement utilisé pour les protéines et autres molécules tendance sur les surfaces de matériaux. Nous démontrons les étapes de base de ce processus, l&#39;estampage modèles de la fibronectine sur le verre.

Impression par microcontact de protéines pour la biologie cellulaire

La capacité de structurer des protéines et d'autres biomolécules sur des substrats est essentielle pour reproduire la complexité spatiale de l'environnement extracellulaire. ...

La micro-impression par contact est utilisée pour implanter des protéines et d'autres molécules sur des surfaces de matériaux afin de recréer la complexité des environnements extracellulaires. Pour commencer la micro-impression par contact, on crée d'abord un modèle topologique, puis on utilise la lithographie souple pour mouler un tampon à partir du modèle en Sylgard. Le tampon peut être recouvert de protéines, puis utilisé pour transférer ces protéines sur une nouvelle surface sur laquelle les cellules peuvent adhérer.Bonjour, je m'appelle Chen. Je viens du laboratoire du Dr. Lance Camp en génie biomédical à l'Université Columbia. Bonjour, je suis GT du département de génie mécanique.Bonjour, je suis Lance Kem du Département de génie biomédical de l'Université Columbia. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la manière dont les cellules réagissent à des arrangements complexes de protéines dans leur environnement extracellulaire. Cette méthode a été mise au point au milieu des années 1990 par le laboratoire de George Whitesides et est devenue un outil largement utilisé et précieux.Il existe de nombreuses variantes de cette technique, mais aujourd'hui, G et Co U vont démontrer le processus de base de la micro-impression par contact. Commençons donc. Pour la micro-impression par contact, vous devez préparer les lamelles et la solution protéique pour le tamponnage plusieurs jours à l'avance.Commencez par immerger les lamelles dans la solution limbo pendant 10 minutes en chauffant et en agitant jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Ce processus, ainsi que les étapes suivantes de nettoyage et de stockage, peuvent être simplifiés en plaçant les lamelles dans des porte-lamelles en céramique. Rincez ensuite abondamment les lamelles avec de l'eau déionisée et faites-les sécher au four à 45 degrés Celsius pendant six heures.Pour préparer la solution protéique, reconstituez la fibronectine selon les instructions du fabricant afin d'obtenir une concentration de un milligramme par millilitre. Ces stocks sont conservés congelés à moins 20 degrés Celsius. Les aliquotes de travail sont temporairement stockées à quatre degrés Celsius.Les matrices de moulage peuvent être préparées plusieurs jours avant l'expérience. Ces matrices peuvent être conservées avec le motif vers le haut dans un plat couvert, comme une boîte de culture tissulaire. Pour commencer, retirez d'abord la poussière libre du moule maître à l'aide d'un courant d'air comprimé filtré ou de gaz inerte.Ensuite, placez le modèle maître côté face vers le haut au fond d'un plat en plastique, légèrement plus grand que le modèle maître et recouvert de feuille d'aluminium. Des boîtes de culture tissulaire de 60 ou 100 millimètres conviennent bien à cet usage. Dans le tube à centrifuger en polystyrène de 50 millilitres, mélangez les composants du cyl guard dans un rapport d'un pour dix en poids entre l'agent de durcissement et la base d'élastomère.Mélanger soigneusement à l’aide d’un instrument en plastique jetable, comme une pointe de pipette. Préparer suffisamment d’élastomère pour qu’il y ait au moins 0,2 millilitre d’élastomère par centimètre carré de surface de boîte. Centrifuger le tube de 50 millilitres à 300 G pendant cinq minutes.Pour éliminer les bulles d'air après la centrifugation ou sur l'élastomère au-dessus du moule maître, placez-le sous vide, par exemple dans un dessiccateur, pendant 30 minutes. Ensuite, polymérisez l'élastomère dans une étuve à 65 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Une polymérisation à des températures plus élevées et pendant des durées plus longues donne un élastomère plus rigide.Après durcissement, laissez le moule refroidir à température ambiante. Enfin, séparez la feuille de tampons du moule, puis taillez le tampon aux dimensions du moule pour le micro-contact. Imprimez d'abord la fibre nin sur les lamelles de verre.Découpez un seul tampon mesurant de quatre millimètres sur quatre millimètres à un centimètre sur un centimètre de surface et d’un à deux millimètres d’épaisseur ; ces dimensions sont les plus faciles pour commencer. Placez le tampon, côté motif vers le haut, sur une lame de verre ou dans une petite boîte en plastique. Ensuite, placez le tampon dans un nettoyeur à plasma et traitez-le sous vide pendant 30 secondes.Un nettoyeur à plasma scientifique Herrick réglé sur son réglage de sortie le plus élevé rendra la surface de PDMS hydrophile. Si ce traitement est appliqué pendant des durées plus longues, cela entraînera des fissures dans l'élastomère. Diluez la solution de ninhydrine à l'aide de PBS jusqu'à une concentration d'empreinte de 50 microgrammes par millilitre.Une fois la solution prête, déposez une petite goutte d’environ 10 à 50 microlitres de la solution d’empreinte sur le tampon. La solution s’étendra sur la surface hydrophile. Ajoutez uniquement suffisamment de solution pour que la goutte recouvre le tampon sans déborder des bords.Laisser la protéine s'adsorber sur le tampon pendant cinq minutes. Ensuite, utiliser un essuie-tout Kim ou un autre papier propre pour absorber la majeure partie de la solution protéique du tampon sans toucher la zone structurée. Sécher le reste de la solution sur le tampon à l'aide d'un flux d'azote ou d'un autre gaz inerte propre et sec.Une fois sec, utilisez des pinces pour retirer le tampon de la lame de verre, retournez-le et placez-le en contact avec le couvre-verre nettoyé, en faisant glisser la surface à structurer. Déposez un poids sur le dessus du tampon afin d'assurer un bon contact.Le poids spécifique qui assure le meilleur dessin dépend de la taille et du motif du tampon. Commencez avec un poids de cinq grammes et ajustez entre chaque impression. Laissez le tampon en contact avec la surface pendant une minute.Une fois terminé, démonter soigneusement l'empilement et séparer violemment le tampon du coverslip. Rincer le coverslip imprimé dans du PBS, puis dans de l'eau déionisée afin d'éliminer les protéines non adsorbées à la surface ; sécher le coverslip sous un flux d'azote. L'impression par microcontact est un procédé puissant permettant de créer des motifs de molécules sur des surfaces.Dans cet exemple, nous imprimons selon un motif la fibronectine marquée par un fluorochrome en reprenant la forme du logo de notre établissement. Chaque logo mesure 200 micromètres de hauteur. Un avantage important de ce procédé est que plusieurs cycles d’impression par microcontact peuvent être combinés sur une même surface, comme dans cet exemple où deux anticorps différents sont superposés sur une surface unique.Dans ce cas, les points verts mesurent un micromètre de diamètre et sont espacés de quatre micromètres. Nous utilisons ces surfaces pour étudier la manière dont les cellules intègrent plusieurs signaux de l'environnement extracellulaire. Dans ce film, des lymphocytes T naïfs sont déposés sur un réseau de points contenant des anticorps dirigés contre des récepteurs de la surface cellulaire.Les cellules détectent et interagissent avec ces caractéristiques, s'organisant spontanément en réseaux irréguliers. Le procédé de micro-impression par contact est conceptuellement simple et très robuste, ayant été appliqué au dessin de motifs pour une grande variété de molécules sur divers substrats. Toutefois, ce procédé reste encore quelque peu empirique.La géométrie spécifique du motif à créer, la protéine à implanter, le poids appliqué et les conditions d'enduction et de tamponnage influent tous sur la qualité du tamponnage. Nous démontrons l'implantation de fibronectine sur du verre comme point de départ fiable pour l'apprentissage de ces techniques. Vous venez de voir les bases du tamponnage par microcontact lors de cette procédure.N'oubliez jamais de respecter les précautions de sécurité en laboratoire. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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