Name: Photo-induite réticulation des protéines non modifiées (PICUP) appliqué à des peptides amyloïdogéniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Découvrez la méthode PICUP pour analyser la distribution des oligomères de peptides amyloïdogéniques impliqués dans les maladies neurodégénératives. Cette technique permet d'étudier les propriétés structurales des protéines.

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Ce travail a été soutenu par des subventions et des AG027818 AG030709 du NIH / NIA, 2005/2E de la Fondation Larry L. Hillblom, IIRG-07-58334 de l&#39;Association Alzheimer, et 07-65798 de la Californie ministère de la Santé publique.

1. La préparation de peptides <ol><li> Peser ~ 100-200 ug de peptide lyophilisé en utilisant une microbalance et transférer dans étiquetés, siliconé, microtubes de faible adsorbant. Ici, nous utilisons les séquences humaines de l&#39;Aß40, Aß42, la calcitonine, et GRF. </li><li> Ici, nous utilisons des peptides pré-traitées avec 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour obtenir homogène, sans agrégat préparatifs. Cette étape est nécessaire car pré-formé des agrégats induire l&#39;agrégation rapide des protéines amyloïdogénique, qui aboutissent à une mauvaise reproductibilité des expériences 5. D&#39;autres méthodes telles que la filtration et de la SEC peuvent également être utilisées pour obtenir sans agrégat préparatifs pour PICUP 6. </li><li> Pour traiter les peptides avec HFIP, pré-refroidir le conteneur de HFIP sur glace à l&#39;intérieur d&#39;une hotte porter une protection adéquate (HFIP est volatile et toxique). Refroidissement d&#39;une bouteille de 250 ml nécessite généralement 10-15 min. Ajouter HFIP de pré-réfrigérée tubes contenant lyophilisats peptide pour obtenir une concentration de peptide nominale de 0,5 mM. </li><li> Soniquer les solutions de peptide dans un sonicateur bain-marie pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Vortex doucement et incuber les tubes pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Réfrigérer les tubes sur la glace (pendant 1 min), et de diviser les solutions en 10-50-ul aliquotes de 0,6 ml, étiqueté faible adsorbant tubes. </li><li> Retirer HFIP par évaporation sous un léger courant d&#39;azote, ou laisser les tubes ouverts dans la hotte du jour au lendemain. Pour l&#39;évaporation pendant la nuit, placer les tubes ouverts dans un rack et les couvrir avec une grande feuille de Kimwipes pour empêcher la poussière et la contamination particulaire. </li><li> Exsiccate l&#39;HFIP restent sous vide dans un lyophilisateur, ou un concentrateur centrifuge pendant 30 min, ou dans un dessicateur attaché à une entrée vide pendant 2 h. Le produit final sera un film de peptide dans le bas des tubes de microcentrifugation. Si elle est correctement exsiccated, les tubes peuvent être stockés pendant de longues périodes étanches (mois) à -20 ou -80 ° C. </li></ol> 2. Solubilisation des peptides HFIP-traitée et la photo de réticulation <ol><li> Avant de solubiliser les peptides HFIP-traités pour la réticulation des réactions, on a besoin pour préparer la réticulation et des réactifs de trempe. </li><li> Peser le persulfate d&#39;ammonium (APS, M. 228,2 g / mol) et de préparer une solution à 20 mM dans phosphate de sodium 10 mM, pH 7,4. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. </li><li> Préparer une solution mM de Tris (2,2-bipyridyle) dichlororuthénium (II) hexahydraté (RuBpy, M. 748,63 g / mol) dans 10 mM phosphate de sodium, pH 7,4. Mélanger à l&#39;aide d&#39;un vortex et de vérifier la dissolution complète. Protéger le tube de la lumière en utilisant du papier d&#39;aluminium. </li><li> Pour analyse SDS-PAGE après réticulation, un réactif trempe commode est de 5% β-mercaptoéthanol dans le tampon d&#39;échantillon 2 × SDS-PAGE. Alternativement, 1 M dithiothréitol (DTT, M. 154,5 g / mol) dans de l&#39;eau déminéralisée ou un tampon approprié peut être utilisé. </li><li> Films peptide HFIP-traitées sont dissous dans NaOH dilué d&#39;abord, puis un tampon phosphate de sodium est ajouté pour obtenir la concentration de peptide ~ 30 pM. Ajouter 60 mM de NaOH suivie d&#39;eau déminéralisée dans le tube contenant le film peptide tel que NaOH et l&#39;eau représentent 10 et 45% du volume final, respectivement. Racler le film peptide hors les murs à l&#39;intérieur du tube de centrifugeuse à l&#39;aide de la pointe, mélanger par pipetage de haut en bas, et soniquer pendant 5 min dans un sonicateur bain-marie. </li><li> Ajouter 45% phosphate de sodium 20 mM, pH 7,4, mélanger par pipetage, et centrifuger à 16000 g pendant 10 min. Mettez de côté des aliquotes de peptides non réticulés mélangé avec le réactif de trempe pour les contrôles négatifs. </li><li> Réglez la caméra obturateur de retard à 1 s. Au temps d&#39;irradiation plus élevés, de vastes réactions radicalaires peuvent provoquer la dégradation des protéines. Chargez l&#39;obturateur. Temps d&#39;irradiation peut avoir besoin d&#39;être optimisé en utilisant la méthode avec une nouvelle protéine. </li><li> Une réaction typique est PICUP effectuée dans un volume de 20 ul de réaction. Transfert 18 ul de la solution de peptide dans une paroi mince, claire, 0,2 ml, tube de PCR. </li><li> Pour la solution de peptide, ajoutez 1 RuBpy ul suivie par une APS ul et mélanger les réactifs par pipettage (la concentration finale de RuBpy et APS dans le mélange réactionnel sera de 0,05 et 1 mM, respectivement). </li><li> Placer rapidement le tube de réaction dans un flacon en verre de 1,8 ml. Placer le flacon à l&#39;intérieur du soufflet attaché à l&#39;avant du boîtier de l&#39;appareil. Fixez le protecteur d&#39;objectif et appuyez sur le déclencheur afin que l&#39;échantillon est irradié pendant 1 s à l&#39;intérieur du soufflet. </li><li> Après irradiation des échantillons, prendre rapidement le flacon hors du soufflet et le tube de PCR de la fiole. Vite arrêter la réaction en ajoutant 1 TNT ul ou 10 ul de tampon réduisant l&#39;échantillon PAGE. Répétez la réaction de chaque aliquote de peptide. </li><li> Les mélanges réactionnels peuvent maintenant être congelés à -20 ° C pour le stockage pour une durée maximale de 7 jours ou conservés sur la glace avant l&#39;analyse par SDS-PAGE et coloration argentée. </li></ol> 3. SDS-PAGE et coloration ruban-des produits de peptide réticulé <ol><li> Routine SDS-PAGE et coloration argentée sont effectuées pour visualiser réticulé peptides. </li><li> Charge 5 ul du mélange réactionnel par voie d&#39;obtenir ~ 130 pmol de peptide par voie. </li><li> Inclure des quantités similaires de non réticulé peptides pour la comparaison. Inclure également une échelle de protéines standards de rapprochement visuel de poids moléculaire des bandes peptidiques. </li><li> Exécutez le gel en utilisant un appareil d&#39;électrophorèse sur gel de la norme. Nous utilisons le XCell SureLock mini-cellule du système d&#39;Invitrogen et effectuer argent coloration en fonction de la publication Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Guide électrophorèse sur gel. </li></ol> Partie 4: Résultats Représentant (figure 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Figure 1" /> Figure 1: gels de polyacrylamide coloré à l&#39;argent montrant non réticulé (-) et photo-réticulé (+) GRF, la calcitonine, Aß40 et Aß42 SDS-PAGE et coloration argentée analyses de PICUP généré Aß40 oligomères montrent intensités des bandes à peu près similaire de monomère travers tétramère, suivie par une forte diminution de l&#39;abondance des oligomères supérieurs 7. Non réticulé Aß40 migre avec un compatible avec celui du monomère 7 M.. Aß42 montre une distribution oligomère distinctes taille. Aß42 oligomères comprennent 2-3 groupes 8. Le premier groupe, monomère par trimère, affiche intensité décroissante avec l&#39;ordre oligomère croissante. Dans le second groupe, une distribution gaussienne-like est observée entre tétramère et heptamère, avec un maximum à pentamère et hexamère. Le troisième groupe, qui n&#39;est pas représenté ici, contient des oligomères de M. ~ Da 30,000-60,000 8. Ces oligomères supérieurs de M. sont généralement observés à l&#39;aide SEC isolé LMW Aß42 mais pas peptide préparé par filtration ou 6 traitements HFIP. Non réticulé Aß42 produit principalement deux bandes, une bande de monomère et un large trimère / tétramère de bande, qui est un artefact induit par SDS 5,9. La calcitonine donne une distribution de taille oligomère qui diverge fortement d&#39;une diminution exponentielle monotone dans le monomère région par tétramère, suggérant la pré-existence de dimères, trimères, tétramères et 7. Le contrôle polypeptide, GRF, produit une distribution d&#39;oligomères monotone allant de dimères grâce hexamère tels que les montants relative apparente des oligomères baisse de façon exponentielle avec la masse moléculaire augmente. Dans d&#39;autres expériences, des oligomères supérieurs pourraient également être visualisés 7. Le nombre exact et les intensités relatives des bandes oligomère peut varier quelque peu entre les expériences en fonction de la concentration en protéines, la quantité de protéines chargées sur le gel et le temps utilisé pour l&#39;étape de développement dans le protocole de coloration argentée.

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</ol>

PICUP a été développé à l&#39;origine pour étudier les complexes protéiques stables 2. La méthode a été appliquée plus tard à l&#39;étude quantitative de la protéine amyloïde métastable assemblées, y compris Aßi 10, prions et les maladies associées à la PrP Sc 11, et α-synucléine 12. Les facteurs les plus importants qui doivent être considérés lors de la conception d&#39;une expérience PICUP sont la stoechiométrie des réactifs, temps d&#39;irradiation, et la procédure de préparation d&#39;échantil...

<table><tbody><tr><td>Lampe incandescente Dolan-Jenner de 200 W</td><td>Autre</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Modèle 170-D</td><td>La chaleur générée par la lampe d&amp;#8211;n'affecte pas les échantillons lors de courtes périodes d'incubation.</td></tr><tr><td>corps d'appareil photo reflex 35 mm</td><td>Outil</td><td>Pentax</td><td>modèle SP500</td><td>Dans notre dispositif, un soufflet est fixé au boîtier de l'appareil photo afin de constituer une chambre pratique pour l'irradiation de l'échantillon placé à 10 cm de la source lumineuse.</td></tr><tr><td>Tubes PCR clairs à paroi mince</td><td>Autre</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 fourni par Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Vials en verre (1,8 mL)</td><td>Autre</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, fourni par Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Réactif</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Réactif</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utiliser sous une hotte.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 et A&amp;#946;42</td><td>Réactif</td><td>Laboratoire des biopolymères de l'UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonine</td><td>Réactif</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipyridyl)dichlororuthénium(II) hexahydraté</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Couvrir le tube de RuBpy avec du papier d'aluminium pour protéger le réactif de la lumière ambiante. Le RuBpy est préparé frais à chaque utilisation et doit être employé dans les 48 heures.</td></tr><tr><td>Persulfate d'ammonium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Agiter vigoureusement jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Le APS est préparé frais à chaque utilisation et doit être utilisé dans les 48 heures. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercaptopropyl&amp;#8211;éthanol</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Peut être utilisé lorsque l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE est réalisée.</td></tr><tr><td>Tampon d'échantillonnage Novex Tricine SDS (2x)</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-cellule</td><td>Outil</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gels Novex Tricine (10-20 %)</td><td>Autre</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration Silver Express</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

photo-induite réticulation des protéines non modifiées (picup) appliqué à des peptides amyloïdogéniques

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

L&#39;assemblage des protéines amyloïdogéniques en oligomères toxiques est un événement majeur dans la pathogenèse des maladies repliement des protéines, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, de Parkinson et les maladies de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique héréditaire, et diabète de type 2. En raison de la nature métastable de ces assemblages de protéines, il est difficile d&#39;évaluer leur distribution en taille oligomère quantitativement en utilisant les méthodes classiques, telles que l&#39;électrophorèse, la chromatographie diffusion de la lumière, la fluorescence, ou dynamique. Les oligomères de protéines amyloïdogéniques existent sous forme de mélanges métastable, dans lequel les oligomères se dissocient en monomères et d&#39;associer en grandes assemblées simultanément. PICUP stabilise les populations oligomère par reticulation covalente et lorsqu&#39;il est combiné avec des méthodes de fractionnement, tels que le sulfate de sodium électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodecyl (SDS-PAGE) ou chromatographie d&#39;exclusion stérique (SEC), offre des instantanés de PICUP les distributions de taille oligomère qui existaient avant la Croix -lier. Ainsi, PICUP permet la visualisation et l&#39;analyse quantitative des populations en protéines métastable et peut être utilisé pour surveiller les relations d&#39;assemblage et décrypter entre les modifications de séquence et d&#39;oligomérisation<sup&gt; 1</sup&gt;. Mécaniste, PICUP implique la photo-oxydation de Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dans un tris (bipyridyle) Ru (II) complexes (RuBpy) à Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Par irradiation avec une lumière visible en présence d&#39;un accepteur d&#39;électrons. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Est un puissant oxydant à un électron capable d&#39;abstraire un électron d&#39;une molécule de protéine voisins, générant une protéine radicale<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Les radicaux sont instables et hautement réactives et donc des espèces disparaissent rapidement à travers une variété de réactions intra-et intermoléculaires. Un radical peut utiliser l&#39;énergie élevés d&#39;un électron non apparié à réagir avec un autre monomère de protéine formant un dimère, radical qui perd ensuite un atome d&#39;hydrogène et de formes stables, de manière covalente liés dimère. Le dimère peut alors réagir davantage à travers un mécanisme similaire avec des monomères ou des dimères d&#39;autres pour former des oligomères d&#39;ordre supérieur. Avantages de relative PICUP d&#39;autres photo-chimiques ou de méthodes de réticulation<sup&gt; 3,4</sup&gt; Inclure court (≤ 1 s) d&#39;exposition à la non-destructive de la lumière visible, pas besoin de<i&gt; Pré facto</i&gt; Modification de la séquence native, et de longueur nulle reticulation covalente. En outre, PICUP permet de réticulation des protéines au sein de pH et de température, y compris les paramètres physiologiques. Ici, nous montrons l&#39;application de PICUP de réticulation de trois protéines amyloïdogéniques les 40 - et 42-amyloïde β-résidus de protéines variantes (Aß40 et Aß42), et la calcitonine, et une protéine de contrôle, l&#39;hormone de croissance Facteur (GRF).

Photo-induit de réticulation des protéines non modifiées (PICUP) permet de caractériser la distribution de taille oligomère de mélanges de protéines métastable. Nous démontrons l&#39;application de PICUP à trois peptides représentatifs amyloïdogéniques les 40 - et 42-résidus formes d&#39;amyloïde β-protéine, et la calcitonine, et un peptide contrôle l&#39;hormone de croissance facteur de libération.

Photo-induite réticulation des protéines non modifiées (PICUP) appliqué à des peptides amyloïdogéniques

L'assemblage de protéines amyloïdogènes en oligomères toxiques est un événement déterminant dans la pathogenèse des maladies liées au mauvais repliement des protéines, notamment la maladie d'Alzheimer, ...

On pense que les oligomères solubles de protéines amyloïdogènes, en raison de leurs propriétés cytotoxiques, sont à l'origine de la physiopathologie des maladies neurodégénératives. Ces oligomères se forment et se dissocient continuellement en solution, un fait qui complique les études structurales essentielles au développement de molécules inhibitrices permettant de contourner ce problème.La méthode utilisée est le réticulage induit par la lumière de protéines non modifiées, ou « pickup ». Cette méthode consiste à exposer des peptides amyloïdogènes désagrégés et solubilisés à des réactifs de réticulage, puis à une impulsion d'une seconde de lumière intense afin de lier covalemment les dimères et les oligomères. La distribution des tailles des oligomères peut ensuite être analysée par des techniques biochimiques classiques.Bonjour, je suis Far Rahimi du laboratoire Batan du département de neurologie à l'Université de Californie à Los Angeles. Je suis Al Mai du laboratoire Bean. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de réticulation induite par la lumière de protéines non modifiées.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour générer des oligomères stabilisés de la protéine bêta-amyloïde et étudier les modifications structurales sur la distribution des oligomères. Cette procédure a été initialement publiée par Fancy et Coate pour l'étude de complexes protéiques stables. La méthode a ensuite été appliquée par Battan et d'autres chercheurs à l'étude quantitative d'assemblages protéiques amyloïdes métastables, incluant le prion bêta et l'alpha-synucléine.Commençons. Pour commencer le protocole, on ajoute de l’HEXA fluoro ISOPROPANOL ou HFIP, préalablement refroidi sur glace, dans un tube en silicone à faible absorption contenant de un à 200 microgrammes de peptide lyophilisé, de sorte que la concentration finale soit d’environ 0,5.Le HFIP millimolaire empêche les peptides amyloïdogènes de s'agréger et améliorera la reproductibilité des résultats. Maintenant, soniquez le tube de peptide pendant cinq minutes, à température ambiante.Lorsque la sonication est terminée, vortexer doucement les tubes et les laisser incuber 30 minutes à température ambiante. Après 30 minutes, refroidir les peptides sur de la glace pendant une minute. Les peptides refroidis peuvent désormais être divisés en aliquotes de 10 à 50 microlitres dans des tubes de 0,6 ml à faible absorption.Placez ensuite les tubes dans la hotte avec les bouchons retirés. Pour permettre l'évaporation de l'HFIP pendant la nuit, enveloppez le support de tubes et les essuie-tout Kim afin d'empêcher les poussières de pénétrer dans les tubes. Une fois que la majeure partie de l'HFIP s'est évaporée, tout résidu d'HFIP doit être éliminé en plaçant les tubes dans un ex sous vide pendant deux heures.Le produit final est une fine couche de film peptidique à l'intérieur des tubes. Ces tubes peuvent être conservés pendant plusieurs mois à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius. Pour commencer les étapes de solubilisation et de réticulation photochimique, le film peptidique est d'abord dissous dans une solution d'hydroxyde de sodium diluée.Après avoir ajouté l'hydroxyde de sodium, de l'eau déionisée puis du tampon phosphate, la solution finale doit contenir 45 % de tampon phosphate, 45 % d'eau et 10 % de solution d'hydroxyde de sodium. Si un film protéique résiduel subsiste sur les parois du tube, grattez-le pour l'incorporer à la solution. À l'aide d'une pipette, aspirez et expulsez plusieurs fois les peptides en suspension, puis soniquez pendant une à deux minutes dans un bain à ultrasons Sonica.Après la sonication, ajoutez la solution de phosphate et mélangez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ensuite, centrifugez le tube à 16 000 G pendant 10 minutes. Pendant que la centrifugeuse tourne, préparez votre appareil photo pour les étapes de réticulation photochimique.Le délai de l'obturateur de l'appareil photo doit être réglé sur une seconde et l'obturateur doit être armé. Une fois la centrifugation terminée, préparer des aliquotes de 18 microlitres de la solution peptidique dans des tubes PCR transparents de 0,2 ml. Ces aliquotes seront utilisées pour le photo-crosslinking.Veillez à mettre de côté une partie de la solution de peptide destinée à servir de contrôle négatif juste avant la réticulation. Ajoutez un microlitre de sulfate d'ammonium cérique et un microlitre de ruthénium. Placez ensuite rapidement le tube à l'intérieur d'un flacon en verre de 1,8 M et insérez le flacon à l'intérieur du soufflet fixé à l'avant du boîtier de l'appareil photo.Fermez l'appareil photo avec le protecteur d'objectif et appuyez sur l'obturateur. L'échantillon est désormais irradié pendant une seconde. À des durées d'irradiation plus longues, des réactions radicalaires importantes provoquent la dégradation des protéines.Une fois irradié, récupérez rapidement le tube PCR de 0,2 mil et ajoutez 10 microlitres de tampon d'échantillonnage au PAGE préparé contenant du bêta-mercaptoéthanol. Les peptides réticulés peuvent être conservés jusqu'à sept jours à moins 20 degrés Celsius. Avant électrophorèse SDS-PAGE, fractionnement et coloration argentique.Pour analyser les peptides réticulés, une électrophorèse SDS-PAGE suivie d'une coloration argent peut être utilisée afin d'estimer les volumes à charger : cinq microlitres du mélange réactionnel devraient produire environ 130 picomoles de peptide. Il est recommandé d'utiliser le système Xcel Sherlock mini cell d'In Vitrogen pour l'électrophorèse sur gel et de réaliser la coloration argent. Selon la publication d'In Vitrogen IM 1 0 0 2, guide d'électrophorèse sur gel préformé sans NOx, analysez votre gel SDS-PAGE après coloration argent ; le polypeptide témoin non réticulé, GRF, migre principalement sous forme de monomère.Le GRF réticulé produit une distribution continue de toutes les formes d'agrégats allant du dimère à l'hexamère, de sorte que l'intensité relative apparente des bandes diminue de façon exponentielle avec l'augmentation de la masse moléculaire. La calcitonine non réticulée migre principalement sous forme de monomère et partiellement sous forme de dimère. La calcitonine réticulée donne une distribution des tailles d'agrégats qui s'écarte fortement d'une diminution exponentielle monotone dans cette région.Monoxyde à tétramère suggérant la préexistence de dimères, trimères et tétramères non réticulés. Une bêta 40 migre uniquement sous forme de monomère ; un prélèvement a généré une bêta 40. Tous les ligaments montrent des intensités de bande approximativement similaires pour le monomère jusqu'au tétramère, suivies d'une diminution de l'abondance des oligomères supérieurs pour tous les ligaments.Un produit réticulé. La bêta 42 produit principalement deux bandes, une bande monomère et une bande de trimère. La bande de tétramère est un artefact produit par la réticulation SDS.Aβ42 présente une distribution de taille d'oligomères bien distincte comprenant deux groupes. Le premier groupe, du monomère au trimer, montre une intensité décroissante avec l'ordre croissant des oligomères. Dans le second groupe, une distribution en forme de pic est observée entre le tétramère et l'heptamère, avec un maximum au pentamère et à l'hexamère.Nous venons de vous montrer comment effectuer la réticulation de la protéine à l’aide de pika selon cette procédure. Il est important de garder à l’esprit que, lorsqu’on utilise une protéine amyloïdogène, il faut s’assurer que les préparations sont exemptes d’agrégats afin d’obtenir des résultats reproductibles. Les conditions présentées ici, ainsi que ces expériences, peuvent être modifiées expérimentalement en fonction des lytes d’intérêt. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec l'expérience de pickup.

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Les aptamères sont sélectionnés par ribo-/deoxyribo-oligonucleotides...

Sélection d&#39;aptamères pour amyloïde β-protéine, l&#39;agent causal de la maladie d&#39;Alzheimer

Les protéines peuvent soit adopter une structure native, soit se replier en amyloïde insoluble. Les conditions qui favorisent la voie de mauvais repliement conduisent à la formation de différents types de fibrilles amyloïdes. Les méthodes décrites ici permettent une conversion rapide des protéines natives en amyloïde in vitro.

Génération rapide d’amyloïde à partir de protéines natives in vitro

Bien que le transport des protéines de la surface cellulaire est relativement facilement étudiée en visualisant le trafic des protéines intracellulaires est beaucoup plus difficile. Ici, nous utilisons des constructions incorporant GFP photoactivable et démontrons une méthode pour suivre avec précision la protéine précurseur de l'amyloïde à partir de l'appareil de Golgi à compartiments en aval et de suivre son jeu.

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Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.

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Nous rapportons ici un protocole de purification par HPLC sur mesure qui produit de haute pureté bêta-amyloïde 42 (Aß42) et de bêta-amyloïde 40 (Aß40) peptides, capable de former des oligomères. Bêta-amyloïde est un peptide hydrophobe fortement l'agrégation prédisposé impliquée dans la maladie d'Alzheimer. La nature amyloïdogène du peptide rend sa purification un défi.

Un protocole Purification Tailored HPLC que les rendements de haute pureté amyloïde bêta 42 et bêta-amyloïde 40 Peptides, capable de former Oligomère

Le dépôt amyloïde est une caractéristique des différentes maladies et afflige beaucoup de différents organes. Cet article décrit l’application de la fluorescence luminescents oligothiophènes conjugués coloration en combinaison avec les techniques de microscopie de fluorescence. Cette méthode de coloration représente un outil puissant pour la détection et à l’exploration des agrégats de protéine dans les configurations cliniques et scientifiques.

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Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Ce protocole décrit comment préparer des oligomères bêta-amyloïdes d’un peptide synthétique in vitro et d’évaluer les quantités relatives des oligomères bêta-amyloïdes par une dot blot analyse.

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Un protocole pour la synthèse d’un 1, 2-dithiolane modifiée peptide et la caractérisation des structures supramoléculaires résultant de la peptide auto-assemblage.

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Cet article décrit comment la microscopie à deux photons sensible à la polarisation pourrait être appliquée pour caractériser l’organisation locale au sein de superstructures-sphérolites amyloïdes sans marquage. Il décrit également comment préparer et mesurer l’échantillon, assembler la configuration requise et analyser les données pour obtenir des informations sur l’organisation locale des fibrilles amyloïdes.

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Ici, nous présentons une méthode systématique décrivant l’auto-assemblage quasi-réversible des agrégats d’or 20 nm enrobés de bêta-amyloïde 1-40 (Aβ 1-40). Le réseau quasi-réversible dépendant de la taille nanométrique entre les peptides a été corrélé avec des acides aminés spécifiques ou des sections du monomère Aβ 1-40.

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Découvrez la méthode PICUP pour analyser la distribution des oligomères de peptides amyloïdogéniques impliqués dans les maladies neurodégénératives. Cette technique permet d'étudier les propriétés structurales des protéines.

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