Name: Lhomme in vivo des essais biologiques pour la mesure de tissu-spécifique des médiateurs inflammatoires et nociceptifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez la microdialyse cutanée in vivo pour mesurer les médiateurs inflammatoires et nociceptifs chez l'homme. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la douleur dans les tissus inflammés.

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L&#39;induction de l&#39;inflammation expérimentale: <ol><li> Un coup de soleil au premier degré est induite chez les non-tanné la peau d&#39;une cuisse avec l&#39;aide d&#39;un étalonnage, source de rayons ultraviolets B (Saalmann Multitester CFF LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Allemagne). Le coup de soleil est induite 24 heures avant de commencer une expérience microdialyse en appliquant trois fois la quantité de rayons UVB nécessaire pour causer des rougeurs complète de la peau exposée, ou trois fois la dose minimale érythémateuse (DME). Le MED est déterminé dans chaque sujet avant le lancement du projet. Livraison précise d&#39;énergie est assurée avec un UV-mètre (12 RM, le Dr Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Allemagne). </li></ol> Cathéter et la collecte de l&#39;échantillon: <ol><li> Préparer une aire de repos avec des gants stériles, 1 porte-aiguille stérile, une seringue 1cc embout Luer avec une jauge de 23 (G) l&#39;aiguille, une seringue avec une aiguille 1cc 30G, 1% de lidocaïne, tampons d&#39;alcool, 2x2 compresses de gaze stériles, cathéters microdialyse attachée à une fin à une aiguille 23G 4cm (dialyse cutanée, Erlangen, Allemagne), et des tubes de 1,5 ml de collecte Microcent (E &amp; K Scientific, Santa Clara, CA.) avec une solution inhibiteur de protéase 4μl par échantillon 100 ul sur glace sèche. solution inhibiteur de la protéase est faite par instruction du fabricant en utilisant des comprimés inhibiteur de protéase cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne). </li><li> Préparer une solution à 1% d&#39;albumine humaine dans la solution de Ringer lactate et de l&#39;attirer dans la seringue embout Luer 1cc, en veillant à l&#39;absence de bulles d&#39;air restant dans la seringue. </li><li> Charger la seringue avec le 1% d&#39;albumine humaine enrichie solution de Ringer lactate dans le berceau (microdialyse multi-seringue en rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) monté sur une pompe à perfusion de haute précision (pompe 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Assurez-vous que la barre de la pompe à perfusion de conduite de la seringue est en plein contact avec le piston de la seringue. Réglez le débit de la pompe après avoir vérifié que le diamètre de seringue a été correctement entré dans la pompe. Taux de perfusion couramment utilisés varient entre 2 à 4μl/min. </li><li> Définir la zone que vous prévoyez pour recueillir votre échantillon à partir. Lors de l&#39;échantillonnage d&#39;une zone créée artificiellement enflammés, tels que les coups de soleil décrit ci-dessus, le plan sur l&#39;insertion du cathéter au bord de l&#39;insolation. </li><li> Nettoyez une petite zone sur les bords opposés de la lésion, ou sur le site vous avez l&#39;intention de recueillir votre échantillon à partir, avec l&#39;alcool. Ces zones seront nettoyées à l&#39;insertion prévu et les points de sortie pour le cathéter. Injecter juste assez lidocaïne intra-cutanée (en témoigne blanchissement de la peau à l&#39;injection) sur ces sites afin de créer une bulle très petite taille (maximum de 2 mm). L&#39;injection de quantité limitée tels des échanges intra-cutanée de lidocaïne à l&#39;entrée et de sortie du cathéter de microdialyse ne devrait pas modifier les résultats de l&#39;essai biologique, mais ne font l&#39;insertion du cathéter significativement moins douloureuse pour les sujets de l&#39;étude. </li><li> Utiliser des techniques aseptiques, insérer le cathéter de microdialyse avec l&#39;aide d&#39;une aiguille 23G attachés sur toute la longueur de la zone de la peau explorées. La profondeur de l&#39;insertion est à l&#39;interface entre derme et l&#39;hypoderme. Insertion à une profondeur suffisante peut être vérifié optiquement. Comme l&#39;aiguille et le cathéter attachés sont déplacés vers l&#39;avant, l&#39;aiguille doit provoquer un peu de place-plissement de la peau ainsi que quelques blanchissement de la peau. Aucun saignement devrait se produire. Si le saignement ne se produit, cela indique que l&#39;aiguille se trouve plus profond que prévu et la profondeur d&#39;insertion doit être ajustée. Une fois que l&#39;aiguille a été poussé à travers le point de sortie de la peau, rincer les cathéters avec 1% d&#39;albumine enrichi solution de Ringer lactate jusqu&#39;à ce que vous voyez gouttelettes le long de la longueur du cathéter. Ceci est fait en prenant soin d&#39;insérer la fin aiguille d&#39;une seringue (aiguille 23G) dans l&#39;extrémité distale du cathéter de microdialyse et injectant lentement solution. </li><li> Après le rinçage du cathéter tirez doucement sur l&#39;aiguille pour nourrir le cathéter fixé par la peau. Une manipulation délicate est nécessaire parce que les cathéters sont de petit diamètre, et par conséquent fragile. Tirez le cathéter jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement à travers la peau, c&#39;est à dire la base du tube en plastique intégrant plus de l&#39;extrémité distale du cathéter touche la peau au point d&#39;entrée. Comme mentionné ci-dessus, peu ou pas de saignements à la fin de la procédure confirme le positionnement du cathéter optimal. </li><li> Fixez l&#39;extrémité distale du cathéter à la pointe de l&#39;aiguille de la seringue 23G de repos dans le rack de la pompe à perfusion. Les soins sont nécessaires pour éviter la perforation de l&#39;aiguille à travers la paroi du cathéter, ce qui causerait des fuites potentielles. </li><li> Couper l&#39;aiguille à l&#39;extrémité proximale du cathéter. </li><li> En utilisant ¼ de pouce ruban rose, fixez le tube de 1,5 ml de collecte préparés Microcent à la peau à proximité du site de sortie du cathéter. Placez l&#39;extrémité du cathéter dans le tube de collecte pour permettre la collecte des microdialysat. Démarrer la pompe de perfusion à r prédéterminésmangé et par intermittence vérifier que le volume livré et recueillies correspondent. Dans le cas où les volumes ne correspondent pas, la fuite du site d&#39;entrée de peau doit être exclu (peut parfois être résolu en tirant sur la partie du cathéter qui est incorporé par les tubes en plastique plus étroitement sur le site d&#39;entrée de peau). Alternativement, un cathéter peut être nécessaire de remplacer si les volumes livrés et recueillis ne correspondent pas. </li><li> Une fois l&#39;échantillonnage terminé, les échantillons sont placés sur la glace sèche jusqu&#39;à ce stockage à -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;utilisation combinée des techniques de microdialyse et la technologie immuno multiplex est un précieux temps réel, in vivo bioessai humaine offrant un aperçu des événements biochimiques dans les tissus d&#39;intérêt. Combiné avec des tests comportementaux tels que tests de douleur, la méthode permet d&#39;étudier les interactions complexes des produits biochimiques médiation douleur et l&#39;inflammation. La méthode est prometteuse pour 1) l&#39;identification de biomarqueurs spécifiques de tissu médiation douleur et l&#39;inflammatio...

<table><tbody><tr><td>Cathéter de microdialyse</td><td>Outil</td><td>Dialyse dermique</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pompe 22</td><td>Outil</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Outil</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiomètre RM-12 IP-65</td><td>Outil</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur complet de protéinase</td><td>Réactif</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Microtube centrifuge</td><td>Outil</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumine à 5 %</td><td>Réactif</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Soluté de Ringer lactaté</td><td>Réactif</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Autre</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;homme in vivo des essais biologiques pour la mesure de tissu-spécifique des médiateurs inflammatoires et nociceptifs

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Ce bio-essai in vivo humaine peut être utilisée pour étudier des volontaires humains et des patients. Les échantillons sont prélevés à partir de sites pertinents, tels que les tissus de la peau via des cathéters insérés microdialyse aseptique (dialyse cutanée, Erlangen, Allemagne). Illustré dans cet exemple est la collection de liquide interstitiel de la peau enflammée expérimentalement chez des volontaires humains. Prélèvement d&#39;échantillon peut être combiné avec d&#39;autres tests expérimentaux. Par exemple, l&#39;évaluation simultanée de produits biochimiques libérés localement et de la sensibilité subjective à un stimulus douloureux de la peau enflammée expérimentalement fournit l&#39;essentiel biochimique et comportementale lien d&#39;identifier des biomarqueurs de la douleur et l&#39;inflammation. Présenté test dans l&#39;organisme humain vivant permet de comprendre mécanistes dans les processus spécifiques de tissus sous-jacents des douleurs et / ou l&#39;inflammation. La méthode est également bien adapté pour examiner l&#39;efficacité des interventions existantes ou nouvelles - telles que de nouveaux candidats médicaments - ciblant le traitement des affections douloureuses et / ou inflammatoire. Cet article propose une description détaillée sur l&#39;utilisation des techniques de microdialyse pour recueillir le liquide interstitiel lésion cutanée expérimentale enflammées des sujets de l&#39;étude humaine. Les échantillons de liquide interstitiel sont généralement traitées avec l&#39;aide de tests immunologiques multiplexe array billes permettant titrant jusqu&#39;à 100 analytes dans des échantillons de faible volume de 50 microlitres.

Une technique est présentée pour la collection in-vivo d&#39;échantillons de liquide interstitiel des tissus à partir de sites pertinents (peau ici, expérimentalement enflammés) pour la mesure de médiation biochimiques douleur et l&#39;inflammation.

L&#39;homme in vivo des essais biologiques pour la mesure de tissu-spécifique des médiateurs inflammatoires et nociceptifs

Ce bioessai humain in vivo peut être utilisé pour étudier des volontaires et des patients humains. Des échantillons sont prélevés sur des sites tissulaires pertinents, tels que la peau, via...

Cette vidéo commence 24 heures après l'induction d'un coup de soleil expérimental sur la cuisse d'un patient à l'aide d'une source lumineuse UV calibrée. Après l'application d'un anesthésique local, un cathéter de microdialyse est inséré entre les couches cutanée et sous-cutanée, puis est tiré à travers la peau. Une seringue de perfusion est fixée à l'extrémité proximale du cathéter, et l'activation de la pompe de perfusion induit l'écoulement et la collecte du microlysat.Les échantillons recueillis peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que l'analyse des médiateurs de la nociception et de l'inflammation soit prête à être effectuée. Bonjour, je suis Martin Angst, du Département d'anesthésie de l'Université Stanford. Et bonjour, je suis Martha Tingle, infirmière chercheuse principale et responsable du Laboratoire de la Douleur Humaine, fondé par le Dr Angst en 1995 ici à l'Université Stanford.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure pour la mise en place de cathéters de microdialyse dans la peau inflammée expérimentale de participants humains afin de recueillir le liquide interstitiel. Nous utilisons cette technique dans notre laboratoire pour étudier la libération tissulaire spécifique de biochimiques essentiels à la médiation de la douleur et de l'inflammation. Commençons donc.Un modèle d'inflammation cutanée expérimentale est l'érythème solaire artificiel. Un coup de soleil de premier degré est induit à l'aide d'une source calibrée d'ultraviolets B. L'administration précise de l'énergie est assurée par un mètre UV.Les coups de soleil sont généralement induits en appliquant deux à trois fois la quantité de lumière UVB nécessaire pour provoquer une rougeur. Avant de prélever les échantillons, préparez un espace de travail équipé de gants stériles, d'un porte-aiguille stérile et de seringues de type Luer de 1 ml munies d'aiguilles de calibre 23 et de calibre 30. Vous aurez également besoin de cathéters de microdialyse reliés à une extrémité à une aiguille de 23G de quatre centimètres. Les prélèvements seront recueillis dans des tubes de collecte microcentrifugés de 1,5 millilitre contenant quatre microlitres de solution d'inhibiteur de protéase par échantillon de 100 microlitres. La solution d'inhibiteur de protéase est préparée conformément aux instructions du fabricant à l'aide de comprimés de cocktail d'inhibiteurs de protéase. Préparez une solution d'albumine humaine à 1 % dans une solution de Ringer lactatée et aspirez-la dans une seringue Luer de 1 ml, en veillant à ce qu'il ne reste aucune bulle d'air dans la seringue. Chargez la seringue contenant la solution de Ringer lactatée enrichie en albumine humaine à 1 % dans le berceau fixé sur une pompe d'infusion de haute précision. Plusieurs seringues peuvent être chargées simultanément afin d'obtenir des échantillons de liquide interstitiel à partir de différents sites.Veillez à ce que la barre de la pompe d'infusion qui actionne la seringue soit en contact complet avec le piston de la seringue. Réglez le débit de la pompe après avoir confirmé que le diamètre de la seringue a été correctement saisi dans la pompe. Les débits d'infusion couramment utilisés varient généralement entre deux et quatre microlitres par minute.Vous êtes maintenant prêt à placer le cathéter avant la pose du cathéter. La zone à partir de laquelle les échantillons sont prélevés doit être définie lors du prélèvement sur une zone inflammatoire artificiellement créée, comme un coup de soleil induit expérimentalement. Prévoyez d'insérer le cathéter au bord du coup de soleil.Nettoyez une petite zone située aux bords opposés de la lésion ou du site C dont vous prélevez l'échantillon à l'aide de compresses imprégnées d'alcool ; ces zones nettoyées constitueront les points d'insertion et de sortie prévus pour le cathéter. À l’aide d’une seringue d’un cm³ munie d’une aiguille de calibre 30, injectez de la lidocaïne à 1 % jusqu’à ce qu’un bombement cutané soit visible lors de l’injection ; injectez juste assez de lidocaïne à ces emplacements pour former un très petit bleb dont la taille maximale ne dépasse pas deux millimètres. L’injection d’une petite quantité de lidocaïne aux points d’entrée et de sortie du cathéter de microdialyse rend l’insertion du cathéter moins douloureuse pour les sujets, sans toutefois affecter les résultats des dosages biologiques, en utilisant des techniques aseptiques.Insérez les cathéters de microdialyse à l'aide de l'aiguille de 23 gauge fixée, sur toute la longueur de la zone cutanée explorée. La profondeur d'insertion se situe à l'interface entre le derme et le tissu sous-cutané. Une pénétration adéquate peut être vérifiée visuellement lors de l'avancement de l'aiguille et du cathéter qui y est attaché.L'aiguille doit provoquer un léger repli vers le haut de la peau ainsi qu'un blanchissement cutané. Aucun saignement ne doit survenir ; si un saignement se produit, cela signifie que l'aiguille se trouve plus profondément que prévu et que la profondeur d'insertion doit être ajustée.Une fois que l'aiguille a traversé le point de sortie de la peau, tirez délicatement sur l'aiguille pour introduire le cathéter attaché à travers la peau. Une manipulation douce est essentielle car les cathéters ont un petit diamètre et sont très fragiles. Tirez sur le cathéter jusqu'à ce qu'il soit entièrement passé à travers la peau, c'est-à-dire jusqu'à la base du tube en plastique plus large.Le bout distal du cathéter intégré doit toucher la peau au point d'entrée. Là encore, peu ou pas de saignement devrait survenir, ce qui indique que le cathéter a été correctement mis en place. Pour commencer la collecte des échantillons, rincez d'abord les cathéters avec une solution de ringer lactate enrichie en albumine à 1 %.Cela se fait en insérant soigneusement une seringue équipée d'une aiguille de calibre 23 dans l'extrémité distale du cathéter de microdialyse et en injectant lentement la solution. Rincer le cathéter jusqu'à l'apparition de gouttelettes le long de sa longueur ainsi qu'à son extrémité. Après le rinçage, fixer l'extrémité distale du cathéter à l'extrémité de l'aiguille de calibre 23 de la seringue placée dans le support de la pompe d'infusion.Évitez de percer l'aiguille à travers la paroi du cathéter, ce qui pourrait provoquer une fuite potentielle en utilisant du ruban rose de un quart de pouce. Fixez le tube de collecte micro-cent de 1,5 millilitre préparé contre la peau, près du côté de sortie du cathéter. Placez l'extrémité du cathéter dans le tube de collecte afin de permettre la collecte du lysat micro.Démarrer la pompe de perfusion à la vitesse prédéterminée et vérifier périodiquement que le volume délivré correspond bien au volume recueilli, au cas où les volumes ne concorderaient pas. Vérifier s’il y a une fuite au niveau du point d’entrée dans la peau. Les fuites au site d’entrée peuvent parfois être corrigées en tirant plus fermement la partie du cathéter insérée par le tube en plastique sur le site d’entrée cutané.Alternativement, un cathéter peut nécessiter d'être remplacé si les volumes délivrés et recueillis ne correspondent pas une fois l'échantillonnage terminé. Les échantillons sont placés sur de la glace sèche jusqu'à leur stockage à moins 80 degrés Celsius.Nous venons de vous montrer comment recueillir le liquide interstitiel à partir d'une peau expérimentale enflammée à l'aide de cathéters de microdialyse. Nous sommes désormais prêts à analyser les échantillons obtenus par des dosages immunoanalytiques visant à détecter des marqueurs biochimiques de la douleur et de l'inflammation. Lors de cette procédure, il est important de manipuler les cathéters avec beaucoup de précaution, de les avancer lentement en maintenant la tubulure détendue, et il peut être utile de lubrifier les cathéters avant l'insertion avec une petite quantité de la solution stérile que vous avez préparée pour la phase d'infusion de l'étude.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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