Drosophile larvaire JNM Dissection
4 février 2009
Ce protocole démontre comment disséquer Drosophile en préparation pour l'immunohistochimie et / ou l'imagerie de la jonction neuromusculaire.
Cette procédure commence par placer une larve de troisième stade sur la plaque de dissection. Des épingles sont placées aux extrémités postérieure et antérieure de la larve. Des ciseaux sont utilisés pour ouvrir la larve et des pinces servent à retirer les organes internes.
Enfin, quatre épingles supplémentaires sont placées dans chaque coin de la paroi corporelle de la larve afin de la maintenir tendue pendant la fixation. Bonjour, je suis Jonathan Brent du laboratoire de Brian McCabe, du département de physiologie et de biophysique solide à la faculté de médecine de l'Université Columbia. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de dissection de la larve de drosophile et du MJ.
Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le développement synaptique de la jonction neuromusculaire. Commençons donc. Chez les larves de drosophile, il existe 30 muscles par hémisegment dont l'agencement au sein de la paroi corporelle périphérique est connu.
Un total de 35 neurones moteurs innerve ces muscles selon un schéma hautement stéréotypé. Pour accéder à la jonction neuromusculaire ou JNM, il est nécessaire de disséquer soigneusement chaque larve à l’aide d’une dissection appropriée. La JNM peut être utilisée pour l’imagerie en immunohistochimie ou en électrophysiologie.
Commencez la procédure en déposant une goutte de tampon HL 3.1 sur une plaque de dissection. Le tampon est préparé à l'avance et refroidi sur de la glace. Sélectionnez soigneusement une larve de troisième stade en phase de déplacement sur le côté du flacon à l’aide de pinces en acier inoxydable de grande taille.
Le mouvement indique que la larve n'est pas encore entrée en nymphose. Placer la larve avec le côté dorsal vers le haut dans la goutte de tampon sur la plaque de dissection. Le tampon froid anesthésiera la larve et la maintiendra immobile à l'aide de pinces. Insérer une épingle de mnuchin entre les sphères postérieures, puis placer une deuxième épingle près des crochets buccaux sombres de manière à étirer la larve et à la préparer à s'ouvrir.
À l’aide de ciseaux à ressort, effectuez une petite incision horizontale vers l’extrémité postérieure des larves. Insérez une lame des ciseaux dans la sci et pratiquez une incision dans le sens de la longueur en direction de l’extrémité antérieure de la larve. Ensuite, effectuez des incisions horizontales à l’extrémité antérieure des larves, à gauche et à droite de l’épingle.
Pour retirer des organes tels que l'intestin, ajoutez plusieurs gouttes de tampon HL 3.1 à l'animal ; l'intestin et les autres organes remonteront à la surface de la solution et pourront être écartés du corps à l'aide de pinces. Retirez également le système trachéal avec les autres organes. Exposez maintenant les muscles internes du corps en épinglant les lambeaux créés par les incisions.
Veillez à étirer les parois corporelles horizontalement et verticalement lors de la fixation des rabats. Retirez tous les fragments d'organes restants et rincez une fois.
En ajoutant du tampon HL 3.1 frais, la larve est désormais prête à être fixée avec du formaldéhyde préparé récemment, dilué à 3,5 % dans un XPBS. Immerger complètement les larves et le fixatif, puis attendre 25 minutes. Une fois la période de fixation terminée, laver les larves deux fois avec du tampon HL 3.1 pendant trois minutes. Retirer soigneusement les épingles, puis transférer les larves dans des tubes de 1,5 ml contenant du XPBS si nécessaire.
Les larves peuvent être conservées jusqu'à deux jours à quatre degrés Celsius. Pour des résultats optimaux, utilisez les larves disséquées immédiatement. Plusieurs composants essentiels caractérisent une larve de drosophile correctement disséquée.
Tout d'abord, faites attention à ne pas endommager les muscles, en particulier les muscles six, sept et quatre. Ensuite, l'animal doit être correctement étiré. Sinon, la jonction neuromusculaire pourrait ne pas être accessible ou discernable.
Ici, vous pouvez voir une larve correctement disséquée. La jonction neuromusculaire est clairement visible et le système est désormais prêt pour les expériences. Nous venons de vous montrer comment disséquer une larve œsophagienne afin d'étudier la jonction neuromusculaire.
Lors de cette procédure, il est important de préserver les muscles intacts. Si les muscles sont endommagés, il n'y aura pas de jonctions neuromusculaires à étudier. Voilà tout.
Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
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Aperçu
Ce protocole montre comment disséquer des larves de Drosophila en vue d'une immunohistochimie et/ou d'un examen de la jonction neuromusculaire. La procédure implique un positionnement précis des épingles ainsi que l'utilisation de ciseaux et de pinces pour préparer les larves à des analyses ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Immunohistochimie
Contexte
- Les larves de Drosophila sont couramment utilisées dans les études neurobiologiques.
- La jonction neuromusculaire est une région essentielle pour l'étude de la transmission synaptique.
- Des techniques de dissection appropriées sont essentielles pour une imagerie et une analyse réussies.
- Ce protocole fournit une méthode normalisée pour la dissection des larves.
Objectif de l'étude
- Préparer les larves de Drosophila pour une analyse immunohistochimique.
- Faciliter l'imagerie de la jonction neuromusculaire.
- Standardiser les techniques de dissection afin d'assurer la reproductibilité dans la recherche.
Méthodes utilisées
- Placement de broches pour stabiliser les larves pendant la dissection.
- Utilisation de ciseaux pour ouvrir les larves.
- Retrait des organes internes à l’aide de pinces.
- Fixation de la paroi corporelle à des fins d’imagerie.
Résultats principaux
- Une dissection réussie permet une visualisation claire de la jonction neuromusculaire.
- Des méthodes standardisées améliorent la cohérence entre les expériences.
- Facilite des études ultérieures sur la fonction et le développement synaptiques.
- Constitue une base pour les recherches futures en neurobiologie de Drosophila.
Conclusions
- La dissection des larves de Drosophila est une étape cruciale pour la recherche en neurobiologie.
- Des techniques appropriées améliorent la qualité de l'analyse immunohistochimique.
- Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs du domaine.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La jonction neuromusculaire (JNM) de la larve de Drosophila constitue un modèle génétiquement accessible pour l'étude du développement synaptique et de la plasticité, offrant une grande accessibilité et une résolution au niveau cellulaire unique. Ce protocole de dissection permet une préparation reproductible de la JNM pour des applications ultérieures telles que l'imagerie, l'immunohistochimie et l'électrophysiologie, soutenant ainsi la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. En fournissant une méthode standardisée pour isoler et visualiser les structures synaptiques, cette technique renforce la fiabilité prédictive de l'évaluation des cibles neurobiologiques et la clarification des voies impliquées.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées à la fonction synaptique et aux voies du développement neurologique.
- Valeur opérationnelle : Contribue à la détection biologique des risques grâce à une visualisation de haute fidélité des schémas d'innervation entre les motoneurones et les muscles.
- Valeur prédictive : Facilite l'évaluation des interventions génétiques ou pharmacologiques sur la morphologie et la fonction de la jonction neuromusculaire.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques standardisés pour le criblage de composés avec un accès reproductible aux jonctions neuromusculaires.
- Résultats quantitatifs : Permet la mesure du nombre et de la taille des boutons synaptiques ainsi que de la localisation des protéines comme paramètres phénotypiques.
- Extensibilité : Permet le traitement parallèle de larves dans le cadre de campagnes de criblage à débit moyen.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise des mécanismes synaptiques conservés, applicables à la validation de cibles dans les troubles neurodégénératifs et neuromusculaires.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les découvertes génétiques chez Drosophila et la biologie synaptique des mammifères par l'intermédiaire de voies conservées.
- Dérisquage mécanistique : Permet une évaluation précoce de l'interaction avec la cible et de la modulation de la voie dans un système vivant et intact.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le flux de travail de dissection s'intègre aux premières étapes de la découverte en permettant la vérification d'hypothèses, progresse vers l'identification de candidats thérapeutiques à partir de phénotypes synaptiques quantifiables, et soutient la validation préclinique par un criblage phénotypique pertinent pour la maladie.
- Biologie de la découverte : Facilite la clarification des voies synaptiques et la validation fonctionnelle des cibles grâce à la visualisation directe de la jonction neuromusculaire.
- Écrans de sélection : Fournit des préparations prêtes à l'analyse, offrant des lectures structurales et fluorescentes reproductibles pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Génère des données morphologiques et immunohistochimiques quantitatives destinées à l'analyse comparative entre conditions.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les mécanismes synaptiques de Drosophila et les modèles précliniques via des voies moléculaires conservées.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'évaluation de cibles neurologiques dans le cadre de multiples campagnes de découverte.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les études synaptiques.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation, la reproductibilité et la possibilité de généralisation de la préparation de la jonction neuromusculaire entre différents laboratoires.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant une détection précoce de la toxicité synaptique ou de l'engagement de la cible.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles neurologiques en fonction des résultats fonctionnels synaptiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation de Drosophila, en microchirurgie et en microscopie à fluorescence.
- Dépend de plaques de dissection, d'épingles à insectes, de ciseaux à ressort, de pinces et de tampon HL 3.1.
- Exige une standardisation de la tension d'épinglage et des conditions de tampon entre les utilisateurs.
- Les considérations d'adaptation incluent les stades larvaires variables et les fonds génétiques affectant l'intégrité musculaire.
- Les limites pratiques comprennent la nécessité d'une grande dextérité manuelle et le risque de lésion musculaire si la dissection est imprécise.
