Name: Drosophile larvaire JNM Dissection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Apprenez la dissection de larves de Drosophila pour l'imagerie de la jonction neuromusculaire. Cette méthode standardisée permet d'étudier la transmission synaptique et le développement neuronal.

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Avant de commencer <ol><li> Toutes les cultures doivent être cultivées à 25 ° C. </li><li> HL3.1 tampon dissection peut être préparé à l&#39;avance. Prenez une aliquote de 50 ml de HL3.1 et le garder sur la glace. </li><li> Préparer 15 ml de formaldéhyde 3,5% frais dans HL3.1. Gardez-le sur la glace. </li></ol> Dissection des larves <ol><li> Mettre une goutte de HL3.1 froid sur le plateau de dissection. Cela permet de garder l&#39;animal de se dessécher et de l&#39;étourdissement rend plus facile à travailler. </li><li> Utilisation de la pince à long, sélectionnez une errance troisième stade larvaire et le placer dans la goutte de HL3.1. </li><li> Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation de pinces pour saisir courte une épingle minutien. Placez la broche entre les stigmates postérieurs. L&#39;animal sera généralement tenter de s&#39;éloigner en rampant de la broche qui s&#39;allongea et de le rendre plus facile pour vous de placer une épingle carrément dans la tête de la larve à proximité de la crochets bouche. Étirez l&#39;animal hors de la longueur. Cela vous aidera à maximiser la quantité de paroi du corps exposées que vous pouvez réaliser pendant la coupe. Remarque: Si vous choisissez à la broche de la tête la première, l&#39;animal peut envelopper son corps autour de l&#39;axe ou le fouet de son corps d&#39;avant en arrière ce qui rend difficile à cerner. Vous pouvez habituellement contrer cela en supprimant le HL3.1 et mettre une goutte douce froide étonnante de l&#39;animal à nouveau. Le scientifique ambidextres pouvez aussi attraper l&#39;animal et le maintenir en place. </li><li> Des ciseaux à ressort aide faire une incision horizontale juste en avant à la broche postérieure sur la face dorsale de la larve. Placer une lame des ciseaux dans l&#39;incision et faire une coupe verticale le long de la ligne médiane dorsale vers la fin rostrale de la larve. A la tribune de l&#39;animal faire des incisions horizontales à gauche et à droite de l&#39;épingle. Remarque: le résultat final devrait ressembler à un I sur la face dorsale de la larve dans l&#39;axe rostrocaudal. </li><li> Enlever les organes. Commencez par mettre quelques gouttes supplémentaires de HL3.1 sur la larve. Cela permettra aux organes de flotter jusqu&#39;à l&#39;extérieur du corps vous permettant de les retirer plus facilement. D&#39;abord, enlever le système trachéal. Deuxièmement, l&#39;utilisation de la pince pour saisir le reste des organes et de les supprimer. </li><li> Lors de l&#39;étape 3, vous faites un rabat à gauche et volet droit de la paroi du corps. Epingler les rabats dans un sens horaire en veillant à étirer la paroi du corps à la fois horizontalement et verticalement. </li></ol> Fixation Fixer chaque animal dans du formol 3,5% en HL3.1 pendant 25 minutes. Laver l&#39;animal à deux reprises en HL3.1 pendant 5 minutes. Stockage Retirez les broches et le transfert des larves dans un tube de 1,5 ml contenant du PBS 1X. Si vous prévoyez d&#39;utiliser l&#39;image de la JNM fusionné étiquettes fluorescentes, vous devriez l&#39;image des animaux dans les deux jours. Vous pouvez stocker les larves disséquées pour une semaine au maximum à 4 ° C. Les résultats représentatifs Il ya plusieurs éléments clés pour une larve de drosophile bien disséqué. D&#39;abord, il faut prendre des précautions supplémentaires pour ne pas endommager les muscles, surtout les muscles 4, 6 et 7. Ce sont les muscles les plus populaires pour étudier et, si elles sont endommagées jeter le filet de préparation et de disséquer un autre animal. Deuxièmement, on doit s&#39;assurer que l&#39;animal est au maximum étirée de sorte que chaque muscle et JNM peuvent être distinguées.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

La technique de dissection démontré dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des larves de drosophile pour une variété de techniques expérimentales. Si les balises protéine fluorescente sont présents, les larves peuvent être montés et imagé immédiatement. Sinon, immunomarquage peuvent être effectuées afin de marquer spécifiques compartiments synaptiques. En outre, l&#39;électrophysiologie peut facilement être effectuée sur des larves disséquées afin d&#39;évaluer le fonctionnement de la neurotransmissi...

HL3 Tampon Dissection: (en mm) 70 NaCl, KCl 5, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 tréhalose, le saccharose 115, et 5 HEPES, pH 7,3.<br /<br /&gt; Sylgard Plate Dissection: Mélanger doucement (pour éviter les bulles) 10h01 dans un bécher. Versez la préparation dans une boîte de Petri (toutes tailles). Autoriser Sylgard pour guérir la nuit dans 37C incubateur.

drosophile larvaire jnm dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Jonction neuromusculaire (JNM) est un système modèle établi utilisée pour l&#39;étude du développement synaptique et la plasticité. L&#39;utilisation généralisée de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Système de moteur est due à sa grande accessibilité. Elle peut être analysée avec une seule cellule de résolution. Il ya 30 muscles par hemisegment dont l&#39;agencement intérieur la paroi du corps périphériques sont connus. Un total de 35 neurones moteurs attachent à ces muscles dans un modèle qui a la haute fidélité. En utilisant la biologie moléculaire et la génétique, on peut créer des animaux transgéniques ou mutants. Ensuite, on peut étudier les conséquences du développement sur la morphologie et la fonction du MNJ. Afin d&#39;accéder à la JNM pour l&#39;étude, il est nécessaire de bien décortiquer chaque larve. Dans cet article, nous démontrons comment bien décortiquer<em&gt; Drosophile</emLarves&gt; pour l&#39;étude du MNJ en supprimant tous les organes internes, tout en laissant intacte la paroi du corps. Cette technique est adaptée pour préparer les larves de l&#39;imagerie, l&#39;immunohistochimie ou l&#39;électrophysiologie.

Ce protocole démontre comment disséquer<em&gt; Drosophile</emLarves&gt; en préparation pour l&#39;immunohistochimie et / ou l&#39;imagerie de la jonction neuromusculaire.

Drosophile larvaire JNM Dissection

La jonction neuromusculaire (JNM) de la Drosophila est un système modèle établi, utilisé pour l'étude du développement et de la plasticité synaptiques. L'utilisation généralisée...

Cette procédure commence par placer une larve de troisième stade sur la plaque de dissection. Des épingles sont placées aux extrémités postérieure et antérieure de la larve. Des ciseaux sont utilisés pour ouvrir la larve et des pinces servent à retirer les organes internes.Enfin, quatre épingles supplémentaires sont placées dans chaque coin de la paroi corporelle de la larve afin de la maintenir tendue pendant la fixation. Bonjour, je suis Jonathan Brent du laboratoire de Brian McCabe, du département de physiologie et de biophysique solide à la faculté de médecine de l'Université Columbia. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure de dissection de la larve de drosophile et du MJ.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le développement synaptique de la jonction neuromusculaire. Commençons donc. Chez les larves de drosophile, il existe 30 muscles par hémisegment dont l'agencement au sein de la paroi corporelle périphérique est connu.Un total de 35 neurones moteurs innerve ces muscles selon un schéma hautement stéréotypé. Pour accéder à la jonction neuromusculaire ou JNM, il est nécessaire de disséquer soigneusement chaque larve à l’aide d’une dissection appropriée. La JNM peut être utilisée pour l’imagerie en immunohistochimie ou en électrophysiologie.Commencez la procédure en déposant une goutte de tampon HL 3.1 sur une plaque de dissection. Le tampon est préparé à l'avance et refroidi sur de la glace. Sélectionnez soigneusement une larve de troisième stade en phase de déplacement sur le côté du flacon à l’aide de pinces en acier inoxydable de grande taille.Le mouvement indique que la larve n'est pas encore entrée en nymphose. Placer la larve avec le côté dorsal vers le haut dans la goutte de tampon sur la plaque de dissection. Le tampon froid anesthésiera la larve et la maintiendra immobile à l'aide de pinces. Insérer une épingle de mnuchin entre les sphères postérieures, puis placer une deuxième épingle près des crochets buccaux sombres de manière à étirer la larve et à la préparer à s'ouvrir.À l’aide de ciseaux à ressort, effectuez une petite incision horizontale vers l’extrémité postérieure des larves. Insérez une lame des ciseaux dans la sci et pratiquez une incision dans le sens de la longueur en direction de l’extrémité antérieure de la larve. Ensuite, effectuez des incisions horizontales à l’extrémité antérieure des larves, à gauche et à droite de l’épingle.Pour retirer des organes tels que l'intestin, ajoutez plusieurs gouttes de tampon HL 3.1 à l'animal ; l'intestin et les autres organes remonteront à la surface de la solution et pourront être écartés du corps à l'aide de pinces. Retirez également le système trachéal avec les autres organes. Exposez maintenant les muscles internes du corps en épinglant les lambeaux créés par les incisions.Veillez à étirer les parois corporelles horizontalement et verticalement lors de la fixation des rabats. Retirez tous les fragments d'organes restants et rincez une fois.En ajoutant du tampon HL 3.1 frais, la larve est désormais prête à être fixée avec du formaldéhyde préparé récemment, dilué à 3,5 % dans un XPBS. Immerger complètement les larves et le fixatif, puis attendre 25 minutes. Une fois la période de fixation terminée, laver les larves deux fois avec du tampon HL 3.1 pendant trois minutes. Retirer soigneusement les épingles, puis transférer les larves dans des tubes de 1,5 ml contenant du XPBS si nécessaire.Les larves peuvent être conservées jusqu'à deux jours à quatre degrés Celsius. Pour des résultats optimaux, utilisez les larves disséquées immédiatement. Plusieurs composants essentiels caractérisent une larve de drosophile correctement disséquée.Tout d'abord, faites attention à ne pas endommager les muscles, en particulier les muscles six, sept et quatre. Ensuite, l'animal doit être correctement étiré. Sinon, la jonction neuromusculaire pourrait ne pas être accessible ou discernable.Ici, vous pouvez voir une larve correctement disséquée. La jonction neuromusculaire est clairement visible et le système est désormais prêt pour les expériences. Nous venons de vous montrer comment disséquer une larve œsophagienne afin d'étudier la jonction neuromusculaire.Lors de cette procédure, il est important de préserver les muscles intacts. Si les muscles sont endommagés, il n'y aura pas de jonctions neuromusculaires à étudier. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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