Name: Drosophile larvaire JNM immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Apprenez l'immunohistochimie sur larves de Drosophila pour visualiser les protéines impliquées dans le développement synaptique. Cette méthode permet d'étudier la régulation génétique de la formation des synapses.

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Avant de commencer <ol><li> Préparer les solutions suivantes: PBT (0,1% de Triton X100 dans du PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA dans PBT), et PBTN (END 2% en PBTB). </li><li> Disséquer larves de drosophile. S&#39;il vous plaît voir la Drosophile larvaire JNM dissection. </li></ol> L&#39;immunohistochimie <ol><li> Déplacer les larves d&#39;un tube de 1,5 ml contenant PBT. Laver les larves à deux reprises pendant 15 minutes dans du PBT. Remarque: pour se laver, placez le tube de 1,5 ml sur une table de mixage nutator. Retirer le liquide avec une pippetor et le remplacer avec du liquide frais. </li><li> Retirez le PBT. Laver à l&#39;PBTB deux fois pendant 30 minutes. </li><li> Retirez le PBTB. Laver à l&#39;PBTN deux fois pour 15 minutes. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps primaire dilué dans PBTN à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 º C la nuit. </li><li> Rincer deux fois avec PBTB. Note: pour la solution de rinçage ajouter et supprimer rapidement. </li><li> Laver deux fois pendant 15 minutes dans PBTB. </li><li> Laver à l&#39;PBTN pendant 30 minutes. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps secondaire (anticorps primaire et conjugués si vous en utilisez un) dilué dans PBTN. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium et laisser incuber pendant 1,5 heures à température ambiante. </li><li> Rincer deux fois avec PBTB. </li><li> Laver deux fois pendant 15 minutes avec PBTB. </li><li> Procéder au montage. </li></ol> Montage Remarque: dans le glycérol Mont si les échantillons seront imagés immédiatement. Mont de prolonger Or, si les échantillons seront stockés avant d&#39;imagerie (pour plus d&#39;une semaine) ou si les échantillons doivent être imagés à plusieurs reprises. Pour l&#39;utiliser, placez une bouteille de prolonger de 65 º C bain-marie pendant 2-3 minutes. Prenez une aliquote de prolonger d&#39;or et de garder sur un bloc de chaleur à 45-50 º C. <ol><li> Verser preps colorées en PBT dans un verre de montre. </li><li> Mettez un peu de glycérol sur une lame de verre propre pour le traitement. </li><li> Déplacer les animaux de glisser de traitement en les ramassant sur du verre de montre par un coin à l&#39;aide des pinces. Assurez-vous qu&#39;ils sont côte à cuticules vers le bas. </li><li> Retirez la tête et la queue avec une lame de rasoir frais sur la lame de verre de traitement. Un exacto couteau avec une lame # 16 fonctionne bien pour cela. </li><li> Sur une autre lame (montage de diapositives), mettre une petite goutte de glycérine / prolonger et étalez avec une pince propre. </li><li> Déplacer les animaux disséqués à la diapositive de montage par leur bord, en prenant soin de ne pas les inverser. Essayez de les monter en rangées dans la même orientation. Mont 6-8 animaux par diapositive. </li><li> Déposer une lamelle sur une longueur d&#39;avance en plaçant dans le glycérol / Prolonger et lentement le libérant. </li><li> Sceau de la diapositive avec un vernis à ongles. [Note Ne pas l&#39;image jusqu&#39;à ce que le vernis est sec. Cela prend généralement dix minutes. Pour les échantillons montés dans prolongent en or, laissez-les diapositives sécher pendant au moins trois heures avant d&#39;étanchéité ou d&#39;imagerie.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

L&#39;immunohistochimie (IHC) est vitale pour l&#39;étude de la biologie JNM, car elle permet la visualisation de la JNM. Ceci est accompli en utilisant des anticorps qui reconnaissent la membrane neuronale (par exemple, HRP), l&#39;presynapse (par exemple, CSP, SYT), et / ou le postsynapse (par exemple, DLG). Molécules de signalisation, des protéines de structure, ou de nouvelles protéines d&#39;intérêt peuvent aussi être colorées. Ensuite, les gènes peuvent être mutés ou missexpressed, et IHC peut détecter une perturb...

<table><tbody><tr><td>Stéréomicroscope &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel de précision n°1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Lames n°16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophile larvaire jnm immunohistochimie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Jonction neuromusculaire (JNM) est un système modèle établi utilisée pour l&#39;étude du développement synaptique et la plasticité. L&#39;utilisation généralisée de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Système de moteur est due à sa grande accessibilité. Elle peut être analysée avec une seule cellule de résolution. Il ya 30 muscles par hemisegment dont l&#39;agencement intérieur la paroi du corps périphériques sont connus. Un total de 31 neurones moteurs attachent à ces muscles dans un modèle qui a la haute fidélité. En utilisant la biologie moléculaire et la génétique, on peut créer des animaux transgéniques ou mutants. Ensuite, on peut étudier les conséquences du développement sur la morphologie et la fonction du MNJ. L&#39;immunohistochimie peut être utilisée pour l&#39;image clairement les composantes de la JNM. Dans cet article, nous montrons comment utiliser coloration des anticorps pour visualiser les<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires JNM.

Ce protocole montre comment effectuer la larve de drosophile immunohistochimie sur disséqués.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

La jonction neuromusculaire (NMJ) de la Drosophila est un système modèle établi utilisé pour l'étude du développement et de la plasticité synaptiques. L'utilisation généralisée...

Ce protocole décrit comment réaliser une coloration immunohistochimique sur des larves de gsof disséquées afin de visualiser les protéines impliquées dans le développement des synapses. Un tube de 1,7 mil est utilisé tout au long de la procédure pour l'incubation des anticorps primaires et secondaires, ainsi que pour les étapes de lavage. Les larves sont ensuite transférées sur une lame de traitement, où elles sont découpées à l’aide d’un couteau exacto ; les échantillons destinés à l’observation sont ensuite déplacés dans une goutte de réactif antifade.Sur une lame porteuse, un coverslip est finalement scellé à la lame à l’aide de vernis à ongles. Bonjour, je suis Jonathan Brent du laboratoire de Brian McCade, du département de physiologie et de biomécanique cellulaire du College of Physicians and Surgeons de l’Université Columbia. Nous utilisons cette procédure pour étudier la régulation génétique de la formation des synapses au niveau de la jonction neuromusculaire et du nœud en développement.Commençons. Avant de réaliser une immunohistochimie sur la larve de gsof n MJ, commencez par disséquer correctement les larves. Pour apprendre cette procédure, regardez l'article vidéo acco

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La morphologie, la taille et l’emplacement des organites intracellulaires sont conservés au cours de l’évolution et semblent affecter directement leur fonction. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus est devenu un objectif important de la biologie moderne. Nous montrons ici comment ces études peuvent être facilitées par l’application de techniques quantitatives.

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Apprenez l'immunohistochimie sur larves de Drosophila pour visualiser les protéines impliquées dans le développement synaptique. Cette méthode permet d'étudier la régulation génétique de la formation des synapses.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

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