Name: Drosophile larvaire JNM immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Apprenez l'immunohistochimie sur larves de Drosophila pour visualiser les protéines impliquées dans le développement synaptique. Cette méthode permet d'étudier la régulation génétique de la formation des synapses.

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Avant de commencer <ol><li> Préparer les solutions suivantes: PBT (0,1% de Triton X100 dans du PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA dans PBT), et PBTN (END 2% en PBTB). </li><li> Disséquer larves de drosophile. S&#39;il vous plaît voir la Drosophile larvaire JNM dissection. </li></ol> L&#39;immunohistochimie <ol><li> Déplacer les larves d&#39;un tube de 1,5 ml contenant PBT. Laver les larves à deux reprises pendant 15 minutes dans du PBT. Remarque: pour se laver, placez le tube de 1,5 ml sur une table de mixage nutator. Retirer le liquide avec une pippetor et le remplacer avec du liquide frais. </li><li> Retirez le PBT. Laver à l&#39;PBTB deux fois pendant 30 minutes. </li><li> Retirez le PBTB. Laver à l&#39;PBTN deux fois pour 15 minutes. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps primaire dilué dans PBTN à température ambiante pendant 1 heure ou à 4 º C la nuit. </li><li> Rincer deux fois avec PBTB. Note: pour la solution de rinçage ajouter et supprimer rapidement. </li><li> Laver deux fois pendant 15 minutes dans PBTB. </li><li> Laver à l&#39;PBTN pendant 30 minutes. </li><li> Incuber dans l&#39;anticorps secondaire (anticorps primaire et conjugués si vous en utilisez un) dilué dans PBTN. </li><li> Couvrir de papier d&#39;aluminium et laisser incuber pendant 1,5 heures à température ambiante. </li><li> Rincer deux fois avec PBTB. </li><li> Laver deux fois pendant 15 minutes avec PBTB. </li><li> Procéder au montage. </li></ol> Montage Remarque: dans le glycérol Mont si les échantillons seront imagés immédiatement. Mont de prolonger Or, si les échantillons seront stockés avant d&#39;imagerie (pour plus d&#39;une semaine) ou si les échantillons doivent être imagés à plusieurs reprises. Pour l&#39;utiliser, placez une bouteille de prolonger de 65 º C bain-marie pendant 2-3 minutes. Prenez une aliquote de prolonger d&#39;or et de garder sur un bloc de chaleur à 45-50 º C. <ol><li> Verser preps colorées en PBT dans un verre de montre. </li><li> Mettez un peu de glycérol sur une lame de verre propre pour le traitement. </li><li> Déplacer les animaux de glisser de traitement en les ramassant sur du verre de montre par un coin à l&#39;aide des pinces. Assurez-vous qu&#39;ils sont côte à cuticules vers le bas. </li><li> Retirez la tête et la queue avec une lame de rasoir frais sur la lame de verre de traitement. Un exacto couteau avec une lame # 16 fonctionne bien pour cela. </li><li> Sur une autre lame (montage de diapositives), mettre une petite goutte de glycérine / prolonger et étalez avec une pince propre. </li><li> Déplacer les animaux disséqués à la diapositive de montage par leur bord, en prenant soin de ne pas les inverser. Essayez de les monter en rangées dans la même orientation. Mont 6-8 animaux par diapositive. </li><li> Déposer une lamelle sur une longueur d&#39;avance en plaçant dans le glycérol / Prolonger et lentement le libérant. </li><li> Sceau de la diapositive avec un vernis à ongles. [Note Ne pas l&#39;image jusqu&#39;à ce que le vernis est sec. Cela prend généralement dix minutes. Pour les échantillons montés dans prolongent en or, laissez-les diapositives sécher pendant au moins trois heures avant d&#39;étanchéité ou d&#39;imagerie.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

L&#39;immunohistochimie (IHC) est vitale pour l&#39;étude de la biologie JNM, car elle permet la visualisation de la JNM. Ceci est accompli en utilisant des anticorps qui reconnaissent la membrane neuronale (par exemple, HRP), l&#39;presynapse (par exemple, CSP, SYT), et / ou le postsynapse (par exemple, DLG). Molécules de signalisation, des protéines de structure, ou de nouvelles protéines d&#39;intérêt peuvent aussi être colorées. Ensuite, les gènes peuvent être mutés ou missexpressed, et IHC peut détecter une perturb...

<table><tbody><tr><td>Stéréomicroscope &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont n°5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur rotatif Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel de précision n°1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Lames n°16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Réactif antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophile larvaire jnm immunohistochimie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

L&#39;<em&gt; Drosophile</em&gt; Jonction neuromusculaire (JNM) est un système modèle établi utilisée pour l&#39;étude du développement synaptique et la plasticité. L&#39;utilisation généralisée de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Système de moteur est due à sa grande accessibilité. Elle peut être analysée avec une seule cellule de résolution. Il ya 30 muscles par hemisegment dont l&#39;agencement intérieur la paroi du corps périphériques sont connus. Un total de 31 neurones moteurs attachent à ces muscles dans un modèle qui a la haute fidélité. En utilisant la biologie moléculaire et la génétique, on peut créer des animaux transgéniques ou mutants. Ensuite, on peut étudier les conséquences du développement sur la morphologie et la fonction du MNJ. L&#39;immunohistochimie peut être utilisée pour l&#39;image clairement les composantes de la JNM. Dans cet article, nous montrons comment utiliser coloration des anticorps pour visualiser les<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires JNM.

Ce protocole montre comment effectuer la larve de drosophile immunohistochimie sur disséqués.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

La jonction neuromusculaire (NMJ) de la Drosophila est un système modèle établi utilisé pour l'étude du développement et de la plasticité synaptiques. L'utilisation généralisée...

Ce protocole décrit comment réaliser une coloration immunohistochimique sur des larves de gsof disséquées afin de visualiser les protéines impliquées dans le développement des synapses. Un tube de 1,7 mil est utilisé tout au long de la procédure pour l'incubation des anticorps primaires et secondaires, ainsi que pour les étapes de lavage. Les larves sont ensuite transférées sur une lame de traitement, où elles sont découpées à l’aide d’un couteau exacto ; les échantillons destinés à l’observation sont ensuite déplacés dans une goutte de réactif antifade.Sur une lame porteuse, un coverslip est finalement scellé à la lame à l’aide de vernis à ongles. Bonjour, je suis Jonathan Brent du laboratoire de Brian McCade, du département de physiologie et de biomécanique cellulaire du College of Physicians and Surgeons de l’Université Columbia. Nous utilisons cette procédure pour étudier la régulation génétique de la formation des synapses au niveau de la jonction neuromusculaire et du nœud en développement.Commençons. Avant de réaliser une immunohistochimie sur la larve de gsof n MJ, commencez par disséquer correctement les larves. Pour apprendre cette procédure, regardez l'article vidéo accompagnant intitulé Dissection de la larve de Drosophila n MJ.Pour commencer la procédure, préparez trois solutions fraîches. Premièrement, préparez la solution PBT en ajoutant un détergent au PBS fraîchement préparé. Deuxièmement, prélevez un aliquot d'albumine de sérum bovin et ajoutez-le à une solution PBT.Pour préparer le PBTB troisième, prenez un sérum de chèvre normal aqua et ajoutez-le à la solution PB TB afin d'obtenir la solution PBTN. Après avoir préparé ces solutions, transférez les larves dans un tube de 1,5 ml contenant 1 ml de PBT. Ce rinçage constitue le premier lavage.Chaque lavage consiste à remplacer la solution dans laquelle les larves sont immergées, puis à incuber les larves sur un mélangeur rotatif lent. Ne pas transférer les larves d'un tube à un autre, car cela pourrait les endommager. Ce premier lavage dure 15 minutes à température ambiante.Après 15 minutes de mélange, remplacez le PBT par du PBT frais à l’aide d’une pipette et lavez les larves pendant encore 15 minutes. Lors du changement des solutions de lavage, veillez toujours à ne pas endommager les larves. Une fois les lavages au PBT terminés, lavez les larves dans du PBTB pendant 30 minutes.Répétez ce lavage avec une solution fraîche pendant encore 30 minutes. Le lavage avec le PBTB est alors terminé. Effectuez deux lavages avec le PBTN, de 15 minutes chacun.Au cours de la deuxième étape de lavage, l'anticorps primaire peut être dilué dans du PBTN à la concentration de travail souhaitée. Après le lavage, incuber les larves dans ce mélange d'anticorps pendant une heure avec un mélange doux à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius. Une fois l'incubation terminée, aspirer la solution d'anticorps primaire et rincer rapidement les larves plusieurs fois avec du PBTB afin d'éliminer tout anticorps résiduel.Pour préparer les larves pour l'incubation suivante avec l'anticorps, laver une fois dans du PBTB pendant 15 minutes, puis laver deux fois dans du PBTN pendant 30 minutes. Diluer l'anticorps secondaire dans du PBTN à la concentration de travail souhaitée et incuber les larves dans ce mélange pendant une heure et demie. À température ambiante, veiller à couvrir les larves afin d'éviter l'exposition à la lumière et de minimiser le photoblanchiment du fluorochrome quatre.Après une heure et demie, retirez la solution d'anticorps secondaire et rincez les larves plusieurs fois supplémentaires dans du PBTB. Lavez ensuite les larves dans du PBTV deux fois pendant 15 minutes chacune. Tous les lavages restants et le stockage des larves doivent être effectués en limitant au maximum l'exposition à la lumière ; veillez donc à les maintenir couverts.Transférez les larves du tube de 1,5 ml dans du PBT sur une lame de verre pour traitement. Les larves sont maintenant prêtes à être montées : montez les larves colorées dans une solution de Gold prolongée chauffée à 65 degrés Celsius au bain-marie pendant deux à trois minutes. Ensuite, prenez un Eloqua et maintenez-le sur un bloc chauffant réglé à 50 degrés Celsius.Appliquez un peu de PB TB sur une lame de traitement. Transférez les larves dans le PB TB. Orientez les larves côté cuticule vers le bas à l’aide d’un scalpel de lame numéro 16, puis découpez les têtes et les queues des larves.Vous pouvez également utiliser un rasoir pour cette étape. Préparez maintenant la lame de montage en déposant sur une lame propre 40 microlitres de prolongation or provenant de l'aliquot chauffé, puis répartissez-la à l'aide de pinces propres. Utilisez des pinces.Transférez soigneusement six à huit larves préparées de la lame de traitement vers la lame de montage. Essayez de les maintenir dans la même orientation et placez-les avec leur cuticule vers le bas afin de monter les larves. Déposez une lamelle au-dessus de la solution prolongée.Placez-le sur un bord à la périphérie de la flaque prolongée et laissez glisser délicatement la lamelle pour recouvrir les échantillons. Scellez les bords de la lamelle sur la lame avec le vernis à ongles épais et bon marché de votre couleur préférée. Laissez sécher la lame pendant au moins trois heures.Si les lames doivent être observées une seule fois et immédiatement après leur préparation, la solution prolongée d'or peut alors être remplacée par du glycérol. Le temps de séchage du vernis à ongles et du glycérol est alors d'environ 10 minutes, contre trois heures avec tout protocole de coloration. L'objectif est d'obtenir un signal spécifique élevé combiné à un fond faible.Cela est obtenu en utilisant des anticorps de haute qualité et en effectuant soigneusement les étapes de blocage et de lavage. Ces images montrent des synapses de type sauvage ainsi que celles provenant d'une souche de drosophile exprimant un récepteur BMP de type deux muté, connu sous le nom de wishful thinking ou mutant witch. La membrane neuronale est colorée en bleu à l'aide d'un anticorps dirigé contre la peroxydase de raifort.Les vésicules synaptiques, en rouge, sont marquées avec un anticorps anti-synaptique. La post-synapse, en vert, est marquée avec un anticorps dirigé contre Discs large. Ces résultats ont montré que la mutation du récepteur BMP de type deux, wit, produit un phénotype de sous-développement synaptique.Ce mutant a été essentiel pour établir les protéines morphogénétiques osseuses comme des signaux rétrogrades régulant le nombre de boutons terminaux synaptiques. Nous venons de vous montrer comment réaliser une immunohistochimie sur une jonction neuromusculaire larvaire œsophagienne. Lors de l'exécution de cette procédure.Il est important d'exécuter la procédure avec un bon synchronisme afin d'assurer une reproductibilité maximale et un fond faible. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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