Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Pour couper des axones à l'aide de l'imagerie in vivo à deux photons, placez des embryons de poisson zèbre anesthésiés dans une goutte d'aros pendant sa solidification, dans une chambre spécialisée composée d'un support en TEFLON et d'une lame couvre-objet. Placez une lame de verre sur le dessus de la chambre, puis retournez-la complètement avant l'exotomie. Prenez une image préalable de l'axone que vous souhaitez couper avec un grossissement de 40 x, puis zoomez jusqu'à 70 x sur la région que vous désirez exotomiser.

Avec le laser éteint, augmentez la puissance du laser. Allumez brièvement le laser. Dans l'image résiduelle de l'axone, vous verrez des débris axonaux dispersés si l'exotomie est réussie.

Bonjour, je suis Georgia O'Brien. Bonjour, je suis Sandra Rigo. Et je suis Shauna Martin.

Nous appartenons au laboratoire d'Alvarez TI, du Département de biologie moléculaire cellulaire et développementale de l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'exodeuxièmephoton et d'imagerie confocale en lapse de temps sur des embryons de poisson zèbre vivants. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la dégénérescence et la régénération des axones sensoriels périphériques.

Commençons. Pour commencer, nous préparerons une solution à 1 % d'agarose à bas point de fusion pour l'encapsulation. Nous dissolvons l'agarose dans de l'eau doublement distillée en chauffant au micro-ondes, puis nous aliquotons dans de petites tubes que nous conservons dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius.

Les premiers embryons peuvent être placés dans une solution de Ringer contenant 5 % de PTU entre 22 et 24 heures après la fécondation afin d'inhiber la formation du pigment, qui est fortement autofluorescent et pourrait masquer les axones au microscope à deux photons. Ensuite, nous sélectionnons les embryons à imager et nous retirons leur chorion en les écartant délicatement à l’aide de pinces. Une fois les embryons sélectionnés, ils sont anesthésiés en ajoutant environ 0,02 % de trica au Ringer contenant le PTU.

Avant de poursuivre, vérifiez que les animaux ne réagissent pas au toucher. Préparez la chambre d'imagerie à long terme en appliquant de la graisse à vide sur un côté d'un anneau en verre ou en téflon et en le fixant sur une lame de couverture en verre. Veillez à ne pas transférer une grande quantité de Ringer PTU.

Transférez un embryon dans la solution d'agaro à 42 degrés à l'aide d'une pipette en verre. Ensuite, transférez l'embryon avec une goutte d'agaro sur une lamelle préparée. Une fois le transfert effectué, positionnez l'embryon comme souhaité pendant que l'agaro durcit.

Gardez à l'esprit que la chambre d'observation sera retournée une fois l'opération terminée, de sorte que le coulisseau en cuivre deviendra la surface supérieure. Si vous disposez d'une platine motorisée et que vous pouvez observer plusieurs emplacements simultanément, répétez ces étapes pour chaque embryon. Laissez complètement solidifier les géloses contenant l'agrobactérium.

Ensuite, remplir l'anneau avec de la solution de Ringer PTU tri-canine à 0,02 %. Enfin, appliquer de la graisse à vide sur l'autre face des anneaux. Puis les recouvrir d'une lame de verre.

Retournez les chambres d'étanchéité. Nous sommes maintenant prêts pour l'imagerie de deux autopsies exo de quatre tonnes. Pour préparer l'imagerie, placez les embryons montés sur un porte-objets dans le support sous le microscope.

Se concentrer sur un embryon à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x 0,8 d'ouverture numérique. Ensuite, allumer le laser. Régler le laser sur une longueur d'onde de 910 nanomètres et une puissance de 30 milliwatts.

Ouvrez le logiciel d'imagerie. Nous utilisons le logiciel Scan Image développé par Corals pour le laboratoire de Boar. À cette puissance, on peut balayer le champ à la recherche d'un axone candidat qui sera sectionné.

Une fois localisé, prendre une image de l'axone cible. Marquer les première et dernière positions en Z, acquérir l'image, puis réaliser une projection maximale des coupes en Z. Ensuite, effectuer un zoom de 70 x sur la branche de l'axone que vous souhaitez examiner en détail.

Augmentez la puissance à 180 milliwatts et réglez le nombre de tranches Z à une. Lancez un balayage unique à l'aide du laser en appuyant sur « grab ». Cela devrait suffire à sectionner l'axone, mais il est nécessaire d'optimiser cette procédure en fonction de votre microscope et de votre objectif expérimental.

Enfin, effectuez un zoom arrière. Réduisez la puissance à 30 milliwatts et prenez une image de notre axone récemment sectionné. Si un microscope à deux photons sur mesure n'est pas disponible dans votre laboratoire, le microscope confocal à deux photons Zes cinq 10 peut également être utilisé pour sectionner les axones.

Nous commençons par placer l'embryon monté sur la platine et l'ajuster au foyer à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau de 25 x. Ensuite, activez les lasers à deux photons et au gaz argon dans un réglage multi-piste afin de pouvoir passer de l'un à l'autre. Bien que les deux lasers soient utilisés pour détecter la GFP, l'émission à deux photons est visualisée en rouge et l'émission du laser au gaz argon en vert.

Pour les différencier, utilisez le laser Argonne afin d'identifier un axone devant résister dans les conditions Z. Marquez les première et dernière coupes optiques. Prenez une image confocale et créez une projection maximale du Zack.

Éteignez le laser à argon et allumez le balayage laser à deux photons à une intensité d'environ 9 % de transmission. Pour vous assurer que l'axone est toujours au point, cliquez sur le bouton d'arrêt afin que l'outil de recadrage soit disponible. Utilisez le recadrage pour effectuer un zoom sur la zone d'intérêt.

Nous effectuons habituellement un zoom d’environ 70 x. Choisissez la région de l’axone à endommager et mettez cette région au point. Le niveau de zoom peut être vérifié dans l’onglet mode.

Ensuite, sous l'onglet canaux, modifiez l'intensité des deux photons, en passant d'environ 9 % de transmission à une transmission comprise entre 15 et 30 %. Pour activer les nouveaux paramètres, cliquez sur le bouton XY rapide, puis cliquez rapidement sur arrêter. Afin d'éviter des dommages excessifs, l'axone doit apparaître sous forme de débris dispersés si la procédure a fonctionné.

Enfin, afin de s'assurer que l'axone a effectivement été endommagé, revenez au laser argon de 488 nanomètres. Prenez une autre image en microscopie confocale et créez une projection maximale des Zacks. Maintenant que nous vous avons montré deux méthodes pour sectionner les axones à l'aide de la microscopie laser à deux photons, nous allons examiner l'imagerie confocale en temps réel de la régénération en utilisant le ZES LSM 510.

Pour préparer l'imagerie en lapse de temps, veillez à allumer le plateau chauffant au moins 30 minutes avant de configurer votre film en lapse de temps. Placez les embryons montés sur un porte-échantillon sous le microscope. Focalisez-vous sur un embryon à l’aide de l’objectif à air souhaité.

Nous utilisons un objectif de 20 x 0,5 d'ouverture numérique, ouvrons le logiciel d'imagerie Zeiss LSM five 10, puis activons les lasers appropriés et configurons la configuration souhaitée. Ouvrez la fenêtre de balayage et les fenêtres temporelles multiples. Si vous disposez du logiciel multi-temporel, définissez la position et la configuration de votre premier embryon dans la fenêtre temporelle multiple.

Activez la numérisation rapide dans la fenêtre de balayage, puis déplacez la platine à la position XY souhaitée. Marquez la première et la dernière position Z dans la fenêtre de balayage. Appuyez sur arrêt, puis également sur milieu dans la fenêtre de balayage, et attendez la fin du balayage de la coupe Z centrale.

Ensuite, appuyez sur marquer la position dans la fenêtre de la platine. Si vous n'observez qu'un seul embryon, cliquez sur l'onglet emplacement unique dans la fenêtre multi-temporelle. Cliquez sur remplacer X, y, Z. Puis cliquez sur enregistrer la configuration.

Acceptez lorsque vous êtes invité à remplacer la configuration précédente. Vous pouvez maintenant définir les paramètres pour l'acquisition d'images dans la fenêtre multi lo. Si vous disposez d'une platine motorisée, vous pouvez configurer plusieurs emplacements pour imager plusieurs embryons.

Dans ce cas, vous devez sélectionner l'onglet « emplacements multiples » avant de définir les coordonnées X, Y, Z et la configuration de votre premier emplacement. Assurez-vous également que le menu déroulant situé juste en dessous de l'onglet des emplacements multiples soit réglé sur l'emplacement un, et que le menu déroulant dans la section de configuration indique « multi lo un ». Avant de cliquer sur « enregistrer la configuration », définissez la position et la configuration de vos embryons restants dans la fenêtre multi-temps.

Localisez votre prochaine numérisation rapide de l'embryon, puis déplacez la platine en position XY souhaitée et marquez vos première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur arrêt. Ensuite, au milieu également dans la fenêtre de numérisation, attendez la fin de la numérisation de la coupe Z médiane.

Ensuite, appuyez sur marquer la position. Dans la fenêtre de la platine, cliquez sur remplacer X, Y, Z. Vérifiez que le menu déroulant juste en dessous de l'onglet emplacements multiples est réglé sur l'emplacement deux et que le menu déroulant dans la section configuration indique multi lobes deux. Cliquez ensuite sur enregistrer la configuration. Acceptez. Lorsqu'on vous demande de remplacer la configuration précédente, répétez ce processus pour les embryons restants.

Configurez les paramètres d'acquisition d'image dans la fenêtre multi lo. Sélectionnez l'option GR GL dans la liste de la section de bloc. Saisissez ensuite le nombre souhaité de répétitions de groupe.

Il s'agit du nombre de fois que le microscope confocal acquerra une image à chaque emplacement. Saisissez l'intervalle de poids souhaité dans la section des paramètres. Ceci correspond à la durée entre le début d'une répétition d'acquisition d'image et le début de la suivante.

Sélectionnez Zack XY dans la section de configuration. Saisissez votre nom de fichier de base dans la section inférieure. Cliquez sur « Sélectionner la base de données d'images » et choisissez votre base de données.

Cliquez sur le bouton options, puis sélectionnez votre dossier MDB pour y enregistrer également les fichiers temporaires. Cochez l'option pour conserver l'image finale ouverte. Enregistrez l'image finale, au milieu de Zack, et sélectionnez l'intervalle de poids.

Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre des options, puis cliquez sur l'heure de début. Laissez la fenêtre multi-temps ouverte pendant toute la durée de l'acquisition d'images. Il est maintenant temps d'analyser vos données.

Lorsque l'acquisition d'images en lapse de temps est terminée, le logiciel multi-time regroupera tous vos fichiers temporaires en un fichier récapitulatif pour chaque emplacement. Si vous souhaitez arrêter le film avant qu'il ne soit complet, veillez à appuyer sur « terminer » plutôt que sur « arrêter », afin qu'un fichier récapitulatif soit créé.

Les fichiers temporaires et les fichiers récapitulatifs doivent être automatiquement enregistrés dans le dossier MDB désigné. Voici un exemple représentatif d'un film en microscopie confocale en laps de temps après une exotomie à 54 heures post-fécondation. La première image montre une vue dorsale de l'axone avant l'exotomie, avec une flèche jaune indiquant le site d'exotomie au temps suivant.

Le film en accéléré commence moins d'une heure après l'extirpation et dure 12 heures. Une série confocale est collectée toutes les 20 minutes. Ce film confocal en accéléré est enregistré en utilisant les mêmes paramètres à 78 heures post-fécondation.

La première image montre une vue latérale de l’axone avant l’exsoudure, avec une flèche jaune pointant vers le site d’exsoudure. Nous venons de vous montrer comment provoquer des lésions tissulaires précises et visualiser des embryons de poisson zèbre vivants à l’aide de l’exsoudure par laser à deux photons et d’une imagerie confocale en laps de temps. Lors de cette procédure, il est important d’optimiser la puissance utilisée pour l’exsoudure laser à deux photons afin d’éviter des dommages excessifs.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.