Name: Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Apprenez l'axotomie par imagerie à deux photons et la microscopie confocale en time-lapse sur embryons de poissons zèbres vivants. Cette méthode permet d'étudier la dégénérescence et la régénération des axones périphériques.

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Nous remercions Mark Terasaki pour des conseils initiaux sur l&#39;aide d&#39;un microscope à deux photons pour créer des lésions tissulaires locales, Kathy Joubin des conseils sur le montage d&#39;imagerie time-lapse, et les laboratoires Sagasti et Portera-Cailliau pour les discussions. Les premières expériences ont été effectuées par l&#39;AS en tant que boursier de la Fondation à l&#39;herbe Labs de biologie marine de Woods Hole, MA. Le travail dans le laboratoire Sagasti a été soutenue par des subventions de la Fondation de Whitehall, la Fondation Klingenstein, et un prix du Burroughs Wellcome Fund carrière dans les sciences biologiques.

Partie 1: Montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie <ol><li> Préparer 1% d&#39;agarose Low Melt solution pour incorporer. Dissoudre dans de l&#39;eau DI agarose par chauffage dans un four micro-ondes, partie aliquote dans des tubes de petits et de stocker dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius. </li><li> Sélectionnez embryons à des fins d&#39;imagerie et d&#39;enlever leurs chorions en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince. Les embryons peuvent être placés dans une solution à 5% Ringer PTU à 22-24 heures après fécondation (HPF) pour inhiber la formation de pigment. Cela améliore la clarté de l&#39;imagerie et est essentielle pour la réalisation à deux photons axotomies des axones sensoriels. Si le pigment naturel est autorisé à se former, l&#39;autofluorescence obscurcit axones sur le microscope à deux photons. Solution de Ringer pour le poisson zèbre contient 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM CaCl 2, et 5 mM d&#39;HEPES, pH 7,2. </li><li> Anesthetize embryons en ajoutant ~ 0,02% tricaïne à l&#39;Ringer PTU. Faire des animaux que ne sont pas sensibles au toucher avant de procéder. </li><li> Préparer la chambre de l&#39;imagerie à long terme en appliquant de la graisse à vide d&#39;un côté d&#39;un anneau de verre ou de téflon et se fixer sur une lamelle de verre. </li><li> Transfert d&#39;un embryon dans la solution 42 degrés agarose avec une pipette en verre, en prenant soin de ne pas transférer une grande partie du PTU Ringer, puis transférer l&#39;embryon avec une goutte d&#39;agarose sur une lamelle de préparation. </li><li> Position de l&#39;embryon en tant désiré que l&#39;agarose durcit. Gardez à l&#39;esprit que la chambre de l&#39;imagerie sera retourné lorsque vous avez terminé de telle sorte que la lamelle sera la surface supérieure. </li><li> Si vous avez une platine motorisée et peut emplacement des images multiples à la fois, répétez les étapes 1.4 à 1.6 pour chaque embryon. </li><li> Laisser l&#39;agarose pour complètement se solidifier, puis remplissez le ring avec 0,02% de Ringer tricaïne PTU. </li><li> Appliquer de la graisse à vide de l&#39;autre côté de l&#39;anneau (s), puis couvrir l&#39;anneau (s) avec une lame de verre. Retournez la chambre étanche (s) plus. Ces chambres peuvent être utilisés pour l&#39;imagerie des microscopes droits ou inversés. </li></ol> Partie 2: Deux photons axotomie utilisant une coutume construite à deux photons microscope avec un caméléon Ti-saphir au laser <ol><li> Préparer pour l&#39;imagerie. Placez l&#39;embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec un objectif de l&#39;eau (0,8 NA) 40X. Allumez le laser. Nous avons été en mesure de visualiser et reproductible dommages neurones exprimant la GFP en utilisant les paramètres suivants. Pour visualiser les axones à une puissance non-préjudiciable, mis au laser pour une longueur d&#39;onde de 910 nanomètres (nm) et une puissance de 30 milliwatts (mW énumérées sont la quantité d&#39;énergie à l&#39;échantillon). Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie. Nous utilisons un logiciel développé dans le laboratoire scanimage Karel Svoboda 2, 3. </li><li> Appuyez sur Focus pour numériser l&#39;embryon avec le laser à deux photons, localiser l&#39;axone vous souhaitez axotomize, et de capturer une image de ce axone. Marquer la première et dernière positions Z, d&#39;acquérir l&#39;image, et faire une projection maximale de la pile Z. </li><li> Zoom 70X sur la branche de l&#39;axone vous souhaitez axotomize et arrêter le balayage. Augmenter la mW à l&#39;échantillon à la puissance de 180 MW d&#39;endommager, et d&#39;effectuer un seul balayage avec le laser. Nous faisons cela en définissant le nombre de tranches de Z à 1 et en appuyant sur &quot;Grab&quot;. Cela devrait être suffisant pour rompre l&#39;axone. Voir la discussion des méthodes pour optimiser cette procédure pour votre microscope et le but expérimental. </li><li> Zoom arrière, réduire la puissance à 30 mW et prendre une image. </li></ol> Partie 3: deux photons axotomie sur 510 microscope confocal Zeiss / à deux photons <ol><li> Placez montés sur la scène d&#39;embryon et de le mettre en mise au point avec un objectif 25X d&#39;eau ou d&#39;autres objectifs appropriés. </li><li> Allumez les deux photons (910 nm) et d&#39;argon (488 nm) lasers dans un cadre multi-piste afin qu&#39;il soit possible de basculer de l&#39;un à l&#39;autre. Bien que les deux lasers sont utilisés pour détecter la GFP, l&#39;émission de deux photons est visualisé en rouge, et l&#39;émission laser à l&#39;argon avec du vert pour différencier les deux. </li><li> Utilisez le laser Argon pour identifier un axone de blesser. Sous Z paramètres marquer la première et la dernière optique. Prenez une image confocale et de créer une projection maximale de la pile Z. </li><li> Choisissez la région de l&#39;axone d&#39;être blessés et apporter cette région dans le foyer. Eteignez le laser Argon et tournez sur le laser à deux photons. Balayage de l&#39;échantillon avec les deux photons à une intensité laser de transmission ~ 9% de s&#39;assurer que l&#39;axone est encore en discussion. </li><li> Cliquez sur le bouton «stop» afin que l&#39;outil de recadrage sera disponible. Utiliser des cultures de zoomer sur la zone d&#39;intérêt. Habituellement on fait un zoom 70X à ~ (zoom peut être vérifiée dans le &quot;mode&quot; onglet). Sous l&#39;onglet &quot;Channels&quot; changer l&#39;intensité des deux photons de la transmission ~ 9% à la transmission de 15-20%. </li><li> Pour rompre un axone activer le «XY rapide&quot; enfoncée pendant environ 1 seconde et puis appuyez sur le bouton d&#39;arrêt pour éviter d&#39;endommager l&#39;excès. L&#39;axone doit être considéré comme des débris dispersés si la procédure a fonctionné. </li><li> Afin de s&#39;assurer que l&#39;axonea été endommagé revenir au laser Argon à 488 nm, prendre une autre image confocale, et de créer une projection maximale. </li></ol> Partie 4: confocale imagerie time-lapse sur Zeiss LSM 510 <ol><li> Préparer pour l&#39;imagerie. Si vous utilisez une platine chauffante, assurez-vous de l&#39;activer au moins 30 minutes avant la mise en place de votre time-lapse movie. Placez l&#39;embryon monté (s) sur un support de diapositives sous le microscope. Focus sur un embryon avec l&#39;objectif d&#39;air désirée. Nous utilisons un 20X, 0,5 objective NA. Ouvrez le logiciel d&#39;imagerie Zeiss LSM 510. Allumez les lasers appropriés et mettre en place la configuration souhaitée. Nous allons maintenant décrire un protocole détaillé pour l&#39;imagerie à long terme avec Zeiss LSM logiciel Time Multi. Ces méthodes peuvent être adaptées pour une utilisation sur votre microscope avec votre propre logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Définir la position et la configuration de votre premier embryon dans la fenêtre de temps Multi. Ouvrez le scanner, le stade, et les fenêtres de temps multiples. Activer balayage rapide sur la fenêtre de numérisation. Déplacer la scène à la position XY désiré. Marquer la première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Si vous êtes seulement un embryon d&#39;imagerie, cliquez sur le &quot;Lieu Unique&quot; onglet dans la fenêtre de temps Multi. Cliquez sur &quot;Remplacer XYZ&quot; puis sur &quot;Enregistrer configuration&quot;. Convenir lorsqu&#39;on lui a demandé d&#39;écraser la configuration précédente. Passez à l&#39;étape 4.4. Si vous avez une scène mécanisée, vous pouvez configurer de multiples endroits à des embryons de plusieurs images. Dans ce cas, vous devez sélectionner le «Multiple Locations onglet&quot; avant de définir les XYZ et de configuration de votre premier emplacement. Aussi, assurez-vous que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations&quot; onglet situé sur un emplacement 1, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit LOC 1, avant de cliquer sur enregistrer la configuration. </li><li> Définir la position et la configuration de votre embryons restants dans la fenêtre de temps Multi. Localisez votre embryon suivante, puis appuyez balayage rapide, de déplacer la scène dans la position souhaitée XY, et marquer votre première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur stop, puis mi, également dans la fenêtre de numérisation. Attendez que le scan de la tranche moyenne de Z à la fin, puis appuyez position de la marque dans la fenêtre de la scène. Cliquez sur &quot;Remplacer XYZ». Vérifiez que le menu déroulant juste en dessous du «Multiple Locations&quot; onglet situé sur un emplacement 2, et que le menu déroulant de la section de configuration multi dit Loc 2, puis cliquez sur &quot;Sauvegarder la configuration&quot;. Convenir lorsqu&#39;on lui a demandé d&#39;écraser la configuration précédente. Répétez ce processus pour les embryons restants. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;acquisition d&#39;images dans la fenêtre multi Loc. Choisissez l&#39;option GR-GL dans la «Liste des Blocs&quot; section, puis entrez le nombre désiré de répétitions du groupe. C&#39;est le nombre de fois que le confocale va acquérir une image à chaque endroit. Entrez le délai d&#39;attente désirée dans la section Paramètres. C&#39;est la quantité de temps depuis le début d&#39;une répétition d&#39;imagerie pour le début de la prochaine répétition. Sélectionnez &quot;ZStackXY&quot; dans la section de configuration. Entrez votre nom de fichier de base dans la section du bas. Cliquez sur &quot;DB Image Sélectionner&quot; et choisissez votre mdb. Cliquez sur le bouton &quot;Options&quot;. Sélectionnez votre dossier mdb d&#39;enregistrer des fichiers temp. Cochez la case &quot;garder l&#39;image finale ouverte&quot;, &quot;enregistrer l&#39;image finale», et «milieu de la pile z&quot;. Sélectionnez attendre intervalle. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre des options. Cliquez sur &quot;Start Time&quot;. Laisser la fenêtre ouverte pour l&#39;heure multi durée de l&#39;imagerie. </li><li> Analysez vos données. Lorsque l&#39;imagerie time-lapse est terminée, le logiciel Time multi compilera tous vos fichiers temporaires dans un dossier récapitulatif pour chaque emplacement. Si vous voulez arrêter le film avant qu&#39;il ne soit terminé, veillez à appuyer sur «Terminer» au lieu de &quot;Stop&quot;, de sorte qu&#39;un fichier de synthèse sera créé. Les fichiers temporaires et fichiers résumé doit être automatiquement enregistré dans le dossier désigné mdb. Dans le menu du logiciel LSM, cliquez sur &quot;View 3D&quot;, puis &quot;projection&quot;. Avec votre dossier de synthèse sélectionnée dans le menu déroulant, cliquez sur &quot;Appliquer&quot;. Cela va générer des projections maximum de la pile Z pour chaque image confocale. Sur le menu du logiciel LSM, cliquez sur &quot;Fichier&quot;, puis &quot;Exporter&quot;. Enregistrer les projections maximales comme une série de fichiers TIF. Vous pouvez alors créer un film de la série de fichiers tif en utilisant ImageJ ou QuickTime Pro. Les axones dans les images LSM peut être tracé en trois dimensions en utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image (par exemple à partir NeuroLucida MicroBrightfield) pour générer des informations quantitatives détaillées sur la morphologie des axones. </li></ol> Partie 5: Les résultats représentatifs Une expérience réussie se traduira par une représentation exacte de la dynamique cellulaires de récupération axone d&#39;une blessure. Votre embryons seront en bonne santé après l&#39;imagerie, sans la dégénérescence visible et un battement de coeur solide. Le axotomie devrait entraîner des dommages précis, ne coupant la branche définie de l&#39;axone. Il devrait y avoir aucune blessure aux axones environnante et la mort cellulaire minime. Nous croyons que nous voyons la mort d&#39;une seule cellule épidermique directement sur le site de axotomie dans ~ 50% des expériences. Si vous observez plus de dégâts, vous devriez optimiser vos deux photons du protocole tel que décrit dans la discussion.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Nous avons utilisé les méthodes décrites avec précision axotomize périphériques axones sensoriels et d&#39;observer directement la régénération chez l&#39;embryon de poisson zèbre vivant. À long terme time-lapse imagerie confocale chez le poisson zèbre peut être utilisé pour observer les nombreux processus développementaux in vivo. La procédure axotomie deux photons décrit peut être modifié pour de nombreuses différentes objectifs expérimentaux. Nous avons utilisé la même procédure générale pour l&#39;ablation ...

deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Le poisson zèbre ont longtemps été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement en imagerie time-lapse de l&#39;embryon vivant transparente. Nous décrivons ici une méthode pour monter embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie et de démontrer comment automatiser la capture de time-lapse images à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Nous décrivons également une méthode pour créer contrôlée, des dommages précis pour chaque branche d&#39;axones sensoriels périphériques chez le poisson zèbre en utilisant la puissance centrée sur un laser femtoseconde monté sur un microscope à deux photons. Les paramètres pour la réussite à deux photons axotomie doit être optimisé pour chaque microscope. Nous allons démontrer à deux photons axotomie la fois sur une mesure construite à deux photons microscope et d&#39;un Zeiss 510 / confocale à deux photons pour fournir deux exemples. Zebrafish trijumeau neurones sensoriels peuvent être visualisées dans une ligne de transgéniques exprimant la GFP conduit par un promoteur neurone sensoriel spécifique 1. Nous avons adapté ce modèle de poisson zèbre trijumeau d&#39;observer directement la régénération des axones sensoriels dans la vie des embryons de poisson zèbre. Les embryons sont anesthésiés avec tricaïne et positionnée dans une goutte d&#39;agarose comme il se solidifie. Immobilisé embryons sont scellés dans une chambre remplie d&#39;imagerie phénylthiourée (PTU) de Ringer. Nous avons constaté que les embryons peuvent être continuellement imagée dans ces chambres pour les 12-48 heures. Une seule image confocale est alors capturé afin de déterminer l&#39;endroit désiré de axotomie. La région d&#39;intérêt est située sur le microscope à deux photons par imagerie par les axones sensoriels sous faible, non dommageable pouvoir. Après un zoom avant sur le site désiré de axotomie, la puissance est augmentée et un seul balayage de cette région définie est suffisante pour rompre l&#39;axone. Plusieurs emplacement imagerie time-lapse est alors mis en place sur un microscope confocal d&#39;observer directement la récupération d&#39;une blessure axonale.

Nous décrivons ici une méthode pour le montage embryons de poissons zèbres à long terme d&#39;imagerie, l&#39;imagerie à deux photons et les tissus des dommages-techniques, et time-lapse imagerie confocale.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Le poisson-zèbre est utilisé depuis longtemps pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement grâce à l'imagerie en accéléré de l'embryon vivant et transparent.

Pour couper des axones à l'aide de l'imagerie in vivo à deux photons, placez des embryons de poisson zèbre anesthésiés dans une goutte d'aros pendant sa solidification, dans une chambre spécialisée composée d'un support en TEFLON et d'une lame couvre-objet. Placez une lame de verre sur le dessus de la chambre, puis retournez-la complètement avant l'exotomie. Prenez une image préalable de l'axone que vous souhaitez couper avec un grossissement de 40 x, puis zoomez jusqu'à 70 x sur la région que vous désirez exotomiser.Avec le laser éteint, augmentez la puissance du laser. Allumez brièvement le laser. Dans l'image résiduelle de l'axone, vous verrez des débris axonaux dispersés si l'exotomie est réussie.Bonjour, je suis Georgia O'Brien. Bonjour, je suis Sandra Rigo. Et je suis Shauna Martin.Nous appartenons au laboratoire d'Alvarez TI, du Département de biologie moléculaire cellulaire et développementale de l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'exodeuxièmephoton et d'imagerie confocale en lapse de temps sur des embryons de poisson zèbre vivants. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la dégénérescence et la régénération des axones sensoriels périphériques.Commençons. Pour commencer, nous préparerons une solution à 1 % d'agarose à bas point de fusion pour l'encapsulation. Nous dissolvons l'agarose dans de l'eau doublement distillée en chauffant au micro-ondes, puis nous aliquotons dans de petites tubes que nous conservons dans un bloc chauffant à 42 degrés Celsius.Les premiers embryons peuvent être placés dans une solution de Ringer contenant 5 % de PTU entre 22 et 24 heures après la fécondation afin d'inhiber la formation du pigment, qui est fortement autofluorescent et pourrait masquer les axones au microscope à deux photons. Ensuite, nous sélectionnons les embryons à imager et nous retirons leur chorion en les écartant délicatement à l’aide de pinces. Une fois les embryons sélectionnés, ils sont anesthésiés en ajoutant environ 0,02 % de trica au Ringer contenant le PTU.Avant de poursuivre, vérifiez que les animaux ne réagissent pas au toucher. Préparez la chambre d'imagerie à long terme en appliquant de la graisse à vide sur un côté d'un anneau en verre ou en téflon et en le fixant sur une lame de couverture en verre. Veillez à ne pas transférer une grande quantité de Ringer PTU.Transférez un embryon dans la solution d'agaro à 42 degrés à l'aide d'une pipette en verre. Ensuite, transférez l'embryon avec une goutte d'agaro sur une lamelle préparée. Une fois le transfert effectué, positionnez l'embryon comme souhaité pendant que l'agaro durcit.Gardez à l'esprit que la chambre d'observation sera retournée une fois l'opération terminée, de sorte que le coulisseau en cuivre deviendra la surface supérieure. Si vous disposez d'une platine motorisée et que vous pouvez observer plusieurs emplacements simultanément, répétez ces étapes pour chaque embryon. Laissez complètement solidifier les géloses contenant l'agrobactérium.Ensuite, remplir l'anneau avec de la solution de Ringer PTU tri-canine à 0,02 %. Enfin, appliquer de la graisse à vide sur l'autre face des anneaux. Puis les recouvrir d'une lame de verre.Retournez les chambres d'étanchéité. Nous sommes maintenant prêts pour l'imagerie de deux autopsies exo de quatre tonnes. Pour préparer l'imagerie, placez les embryons montés sur un porte-objets dans le support sous le microscope.Se concentrer sur un embryon à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x 0,8 d'ouverture numérique. Ensuite, allumer le laser. Régler le laser sur une longueur d'onde de 910 nanomètres et une puissance de 30 milliwatts.Ouvrez le logiciel d'imagerie. Nous utilisons le logiciel Scan Image développé par Corals pour le laboratoire de Boar. À cette puissance, on peut balayer le champ à la recherche d'un axone candidat qui sera sectionné.Une fois localisé, prendre une image de l'axone cible. Marquer les première et dernière positions en Z, acquérir l'image, puis réaliser une projection maximale des coupes en Z. Ensuite, effectuer un zoom de 70 x sur la branche de l'axone que vous souhaitez examiner en détail.Augmentez la puissance à 180 milliwatts et réglez le nombre de tranches Z à une. Lancez un balayage unique à l'aide du laser en appuyant sur « grab ». Cela devrait suffire à sectionner l'axone, mais il est nécessaire d'optimiser cette procédure en fonction de votre microscope et de votre objectif expérimental.Enfin, effectuez un zoom arrière. Réduisez la puissance à 30 milliwatts et prenez une image de notre axone récemment sectionné. Si un microscope à deux photons sur mesure n'est pas disponible dans votre laboratoire, le microscope confocal à deux photons Zes cinq 10 peut également être utilisé pour sectionner les axones.Nous commençons par placer l'embryon monté sur la platine et l'ajuster au foyer à l'aide d'un objectif à immersion dans l'eau de 25 x. Ensuite, activez les lasers à deux photons et au gaz argon dans un réglage multi-piste afin de pouvoir passer de l'un à l'autre. Bien que les deux lasers soient utilisés pour détecter la GFP, l'émission à deux photons est visualisée en rouge et l'émission du laser au gaz argon en vert.Pour les différencier, utilisez le laser Argonne afin d'identifier un axone devant résister dans les conditions Z. Marquez les première et dernière coupes optiques. Prenez une image confocale et créez une projection maximale du Zack.Éteignez le laser à argon et allumez le balayage laser à deux photons à une intensité d'environ 9 % de transmission. Pour vous assurer que l'axone est toujours au point, cliquez sur le bouton d'arrêt afin que l'outil de recadrage soit disponible. Utilisez le recadrage pour effectuer un zoom sur la zone d'intérêt.Nous effectuons habituellement un zoom d’environ 70 x. Choisissez la région de l’axone à endommager et mettez cette région au point. Le niveau de zoom peut être vérifié dans l’onglet mode.Ensuite, sous l'onglet canaux, modifiez l'intensité des deux photons, en passant d'environ 9 % de transmission à une transmission comprise entre 15 et 30 %. Pour activer les nouveaux paramètres, cliquez sur le bouton XY rapide, puis cliquez rapidement sur arrêter. Afin d'éviter des dommages excessifs, l'axone doit apparaître sous forme de débris dispersés si la procédure a fonctionné.Enfin, afin de s'assurer que l'axone a effectivement été endommagé, revenez au laser argon de 488 nanomètres. Prenez une autre image en microscopie confocale et créez une projection maximale des Zacks. Maintenant que nous vous avons montré deux méthodes pour sectionner les axones à l'aide de la microscopie laser à deux photons, nous allons examiner l'imagerie confocale en temps réel de la régénération en utilisant le ZES LSM 510.Pour préparer l'imagerie en lapse de temps, veillez à allumer le plateau chauffant au moins 30 minutes avant de configurer votre film en lapse de temps. Placez les embryons montés sur un porte-échantillon sous le microscope. Focalisez-vous sur un embryon à l’aide de l’objectif à air souhaité.Nous utilisons un objectif de 20 x 0,5 d'ouverture numérique, ouvrons le logiciel d'imagerie Zeiss LSM five 10, puis activons les lasers appropriés et configurons la configuration souhaitée. Ouvrez la fenêtre de balayage et les fenêtres temporelles multiples. Si vous disposez du logiciel multi-temporel, définissez la position et la configuration de votre premier embryon dans la fenêtre temporelle multiple.Activez la numérisation rapide dans la fenêtre de balayage, puis déplacez la platine à la position XY souhaitée. Marquez la première et la dernière position Z dans la fenêtre de balayage. Appuyez sur arrêt, puis également sur milieu dans la fenêtre de balayage, et attendez la fin du balayage de la coupe Z centrale.Ensuite, appuyez sur marquer la position dans la fenêtre de la platine. Si vous n'observez qu'un seul embryon, cliquez sur l'onglet emplacement unique dans la fenêtre multi-temporelle. Cliquez sur remplacer X, y, Z. Puis cliquez sur enregistrer la configuration.Acceptez lorsque vous êtes invité à remplacer la configuration précédente. Vous pouvez maintenant définir les paramètres pour l'acquisition d'images dans la fenêtre multi lo. Si vous disposez d'une platine motorisée, vous pouvez configurer plusieurs emplacements pour imager plusieurs embryons.Dans ce cas, vous devez sélectionner l'onglet « emplacements multiples » avant de définir les coordonnées X, Y, Z et la configuration de votre premier emplacement. Assurez-vous également que le menu déroulant situé juste en dessous de l'onglet des emplacements multiples soit réglé sur l'emplacement un, et que le menu déroulant dans la section de configuration indique « multi lo un ». Avant de cliquer sur « enregistrer la configuration », définissez la position et la configuration de vos embryons restants dans la fenêtre multi-temps.Localisez votre prochaine numérisation rapide de l'embryon, puis déplacez la platine en position XY souhaitée et marquez vos première et dernière positions Z dans la fenêtre de numérisation. Appuyez sur arrêt. Ensuite, au milieu également dans la fenêtre de numérisation, attendez la fin de la numérisation de la coupe Z médiane.Ensuite, appuyez sur marquer la position. Dans la fenêtre de la platine, cliquez sur remplacer X, Y, Z. Vérifiez que le menu déroulant juste en dessous de l'onglet emplacements multiples est réglé sur l'emplacement deux et que le menu déroulant dans la section configuration indique multi lobes deux. Cliquez ensuite sur enregistrer la configuration. Acceptez. Lorsqu'on vous demande de remplacer la configuration précédente, répétez ce processus pour les embryons restants.Configurez les paramètres d'acquisition d'image dans la fenêtre multi lo. Sélectionnez l'option GR GL dans la liste de la section de bloc. Saisissez ensuite le nombre souhaité de répétitions de groupe.Il s'agit du nombre de fois que le microscope confocal acquerra une image à chaque emplacement. Saisissez l'intervalle de poids souhaité dans la section des paramètres. Ceci correspond à la durée entre le début d'une répétition d'acquisition d'image et le début de la suivante.Sélectionnez Zack XY dans la section de configuration. Saisissez votre nom de fichier de base dans la section inférieure. Cliquez sur «&nbsp;Sélectionner la base de données d'images&nbsp;» et choisissez votre base de données.Cliquez sur le bouton options, puis sélectionnez votre dossier MDB pour y enregistrer également les fichiers temporaires. Cochez l'option pour conserver l'image finale ouverte. Enregistrez l'image finale, au milieu de Zack, et sélectionnez l'intervalle de poids.Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre des options, puis cliquez sur l'heure de début. Laissez la fenêtre multi-temps ouverte pendant toute la durée de l'acquisition d'images. Il est maintenant temps d'analyser vos données.Lorsque l'acquisition d'images en lapse de temps est terminée, le logiciel multi-time regroupera tous vos fichiers temporaires en un fichier récapitulatif pour chaque emplacement. Si vous souhaitez arrêter le film avant qu'il ne soit complet, veillez à appuyer sur «&nbsp;terminer&nbsp;» plutôt que sur «&nbsp;arrêter&nbsp;», afin qu'un fichier récapitulatif soit créé.Les fichiers temporaires et les fichiers récapitulatifs doivent être automatiquement enregistrés dans le dossier MDB désigné. Voici un exemple représentatif d'un film en microscopie confocale en laps de temps après une exotomie à 54 heures post-fécondation. La première image montre une vue dorsale de l'axone avant l'exotomie, avec une flèche jaune indiquant le site d'exotomie au temps suivant.Le film en accéléré commence moins d'une heure après l'extirpation et dure 12 heures. Une série confocale est collectée toutes les 20 minutes. Ce film confocal en accéléré est enregistré en utilisant les mêmes paramètres à 78 heures post-fécondation.La première image montre une vue latérale de l’axone avant l’exsoudure, avec une flèche jaune pointant vers le site d’exsoudure. Nous venons de vous montrer comment provoquer des lésions tissulaires précises et visualiser des embryons de poisson zèbre vivants à l’aide de l’exsoudure par laser à deux photons et d’une imagerie confocale en laps de temps. Lors de cette procédure, il est important d’optimiser la puissance utilisée pour l’exsoudure laser à deux photons afin d’éviter des dommages excessifs.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Dans cette vidéo, des techniques pour multicolor confocale imagerie time-lapse et l'ablation des cellules ciblées sont fournis. Time-lapse d'imagerie est utilisée pour surveiller le comportement de plusieurs types cellulaires...

Multicolor imagerie time-lapse de poisson zèbre transgénique: Visualisation des cellules souches rétiniennes Activé par ablation cellulaire ciblée neuronale

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Cette vidéo décrit la méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant l’axotomie laser à deux photons et en observant la récupération axonale après une blessure.

L’axotomie laser à deux photons : une méthode pour endommager les axones chez les embryons de poisson-zèbre et observer la récupération axonale

Source : Williams, A. L., et al. Imagerie multi-photonique Time Lapse pour visualiser le développement en temps réel : visualisation des cellules de la crête neurale en migration dans les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo présente un protocole d’imagerie time-lapse multiphotonique permettant de visualiser la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre en temps réel avec une haute résolution.

Visualisation de la migration des cellules de la crête neurale dans un embryon de poisson-zèbre à l’aide de l’imagerie multiphotonique en accéléré

Time-lapse imagerie confocale est une technique puissante utiles pour caractériser le développement embryonnaire. Ici, nous décrivons la méthodologie et de caractériser la morphogenèse craniofaciale dans le type sauvage, ainsi que PDGFRA, Smad5, et SMO embryons mutants.

Analyser craniofaciale morphogenèse chez le poisson zèbre Utilisation de 4D microscopie confocale

La mitose est essentielle à tout organisme vivant et les défauts entraînent souvent le cancer et des troubles du développement. En utilisant ce protocole d’imagerie et le poisson-zèbre comme système modèle, les chercheurs peuvent visualiser la mitose dans un organisme vertébré vivant et la multitude de défauts qui se produisent lorsque les processus mitotiques sont défectueux.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Une combinaison des techniques optiques avancées de lecture avec excitation de fluorescence multi-photons longue longueur d’onde de laser a été mis en œuvre pour capturer l’imagerie haute résolution, en trois dimensions, en temps réel de la migration de la crête neurale en Tg (sox10:EGFP) et les embryons de poissons zèbres Tg (foxd3:GFP).

Multiphotonique Time Lapse imagerie de visualiser le développement en temps réel : visualisation de la migration des cellules neurales de crête dans des embryons de poisson-zèbre

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

Nous faisons la démonstration d’une méthode qui tire parti de la microscopie confocale à balayage rapide pour effectuer une imagerie en direct des cellules microgliales dans le tectum optique du poisson-zèbre en développement, permettant ainsi l’analyse de la dynamique de ces cellules in vivo.

Imagerie en direct et caractérisation de la dynamique de la microglie chez l’embryon de poisson-zèbre

Apprenez l'axotomie par imagerie à deux photons et la microscopie confocale en time-lapse sur embryons de poissons zèbres vivants. Cette méthode permet d'étudier la dégénérescence et la régénération des axones périphériques.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

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