Name: Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Apprenez la mutagenèse dirigée de plasmides entiers pour la biologie moléculaire en utilisant une méthode simple et économique. Cette technique permet d'introduire des substitutions de bases avec succès.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Principe de la méthode: La mutagenèse dirigée de plasmides entière expliqué dans cette vidéo est une méthode de mutagenèse qui vous permet de modifier un gène cible clonée par substitution, délétion ou d&#39;insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il agit en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, portant la mutation désirée sous forme d&#39;inadéquation au plasmide d&#39;origine, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Après l&#39;élimination du plasmide d&#39;origine de la réaction du plasmide muté est transformé en E. coli. Les étapes suivantes sont à des fins de dépistage seulement, car l&#39;efficacité de la mutation de cette méthode n&#39;est pas 100%. La procédure complète prend trois jours, mais la partie principale peut être fait en une journée. 1.0 La première journée: 1.1 réaction thermocyclage: D&#39;origine plasmidique: Cette mutagenèse dirigée protocole qui fonctionne le mieux avec des plasmides à 10ko. Agrandir Les plasmides sont un peu difficiles à muter avec cette méthode et peut prendre un peu de patience et d&#39;adaptation des conditions de thermocyclage et / ou de cellules compétentes. En outre, le plasmide qui vous travaillez avec doit être isolé à partir d&#39;un barrage + souche de bactéries. Pour la réaction thermocyclage vous aurez besoin de 10 à 60 END du plasmide vous voulez muter. Primaires: Avant que vous pouvez configurer votre réaction thermocyclage vous devez avoir vos amorces à portée de main. Vous avez besoin d&#39;environ 150 ng de chaque primer mutagène. Il est ok, si vous prenez 1,5 pi d&#39;une dilution 1:10 100 actions pM. Il ya quelques règles simples que vous devez tenir compte lorsque vous concevez votre amorces mutagènes: <ul><li> Les amorces devraient être complémentaires les unes aux autres </li><li> Les amorces doivent être entre 25 et 45 nucléotides de long </li><li> Les mutations dans la forme de l&#39;inadéquation de la plasmide d&#39;origine doivent être contenues dans les deux amorces </li><li> Les décalages doivent être centrées dans l&#39;amorce et flanqué d&#39;au moins 8 nucléotides de chaque côté </li><li> Les amorces doivent avoir un contenu en GC d&#39;au moins 40% </li><li> Les amorces devraient extrémité 5 premiers et 3 premiers avec un ou plusieurs Gs ou Cs </li><li> Les amorces ne doivent pas être phosphorylée, et ils n&#39;ont pas à être FPLC ou PAGE purifiée, simplement dessalée qu&#39;ils devraient être. </li><li> Pour le calcul de Tm vous n&#39;avez pas besoin d&#39;aucune formule, mais Tm sur le certificat d&#39;expédition doit être supérieure à 60 ° C. </li><li> À des fins de dépistage, il est pratique pour insérer ou supprimer un site de restriction avec votre mutation. En raison de la dégénérescence du code génétique il ya beaucoup de possibilités pour insérer un site de restriction avec votre mutation désirée. Le site du New England Biolabs fournit un outil pour trouver un tel site de restriction approprié. Entrez simplement votre séquence de l&#39;amorce codant pour la séquence d&#39;acides aminés que vous désirez, en utilisant le code d&#39;ambiguïté pour l&#39;ADN. L&#39;outil de recherche d&#39;enzymes vous dira quels sites de restriction peuvent être introduits en parallèle à votre mutation désirée. Si vous ne pouvez pas trouver tout site de restriction possible ou pratique de cette façon, vous pouvez insérer un nouveau site de restriction concernant les sans code génétique sur le site de mutation. Par la suite, vous pouvez utiliser ce plasmide comme matrice pour une série de mutations dans lequel ce site de restriction sera supprimée par l&#39;insertion de la nouvelle amorces mutagènes. Cette approche peut être très pratique si vous avez l&#39;intention de faire une série de mutations sur le même site du plasmide. </li></ul> ADN-polymérase: Pour cette méthode, vous avez besoin d&#39;une ADN-polymérase thermostable qui présente une activité exonucléase 3&#39;-5 &#39;et crée des extrémités franches. Nous utilisons toujours recombinante Pfu-polymérase du Fermentas. Si vous avez des problèmes avec les étapes d&#39;amplification, vous pouvez essayer une polymérase de qualité supérieure, mais pour la plupart des fins de la Pfu standard sera suffisant. Remplissez la réaction avec dNTP, polymérase tampon et d&#39;eau. 1,2 conditions thermocyclage Le thermocycleur doit être mis en place de la façon suivante. La phase initiale de dénaturation et récurrent est réglé sur 30 sec à 95 ° C. La température de recuit des amorces ne doivent pas être calculées avec des formules compliquées. En général, nous réglez la température de recuit à 55 ° C et le temps de recuit à une minute. Pour amorces de 25 à 30 nucléotides qui vous allez utiliser pour la plupart, cela fonctionne pour nous 95% du temps. Quoi qu&#39;il en soit, si cela ne devrait pas travailler, essayez simplement varier la température de recuit entre 50 - et 60 ° C. La température dépend de l&#39;élongation de la polymérase vous utilisez. Dans cette démonstration, nous utilisons la Pfu polymérase du Fermentas, qui appelle à une température d&#39;élongation de 72 ° C. Le temps d&#39;élongation varie en fonction de la taille du plasmide. Nous calculons toujours 1 min par ko, et ajouter une minute supplémentaire pour que lestemps. Par exemple, pour un plasmide 9kb nous choisirions 10min que le temps d&#39;élongation. 18 cycles sont suffisantes pour créer suffisamment muté plasmide pour l&#39;utilisation ultérieure. Maintenir le nombre de cycles de basse, vous fait également gagner du temps. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Figure 1" width="600" height="287" /> 1,3 Gelcheck après réaction thermocyclage L&#39;amplification de succès devrait être vérifiée en effectuant une électrophorèse. Directement après le vélo est terminée, charge de 5 ul de la réaction sur un gel à 1% d&#39;agarose TAE. Si l&#39;amplification a été un succès, vous devriez voir une bande distincte. Toutefois, si l&#39;ADN nouvellement synthétisé n&#39;est pas clairement visible sur le gel, vous pouvez essayer de précipiter toute la réaction et l&#39;utiliser pour la transformation à l&#39;étape suivante. Pour nous, cela a rarement travaillé, mais il vaut la peine de donner un essai. La meilleure chose à faire si la réaction ne fonctionne pas est d&#39;ajuster la température de recuit. 1,4 digestion Dpnl: Avant la transformation du plasmide original qui a servi de modèle doit être retiré de la réaction pour éviter de solides antécédents. Cela se fait par digestion de restriction avec Dpnl. Cette endonucléase de restriction ne coupe que méthylé plasmide. Sa reconnaissance et site de restriction est la séquence GATC alors A doit être méthylées. Lorsque la digestion avec Dpnl seul le plasmide d&#39;origine non muté qui a été isolée à partir d&#39;un barrage + souche est ensuite coupée, le plasmide muté nouvellement synthétisées qui n&#39;est pas méthylé n&#39;est pas affectée par Dpnl. Il suffit d&#39;ajouter 1-2 ul Dpnl à la réaction et incuber c&#39;est au moins une heure à 37 °. Lorsque vous utilisez le Fast digérer Dpnl le temps d&#39;incubation peut être réduit à environ 15 minutes. La qualité de votre Dpnl et le temps d&#39;incubation de cette digestion de restriction détermine grandement la force de vos antécédents avec le plasmide non muté sera. 1.5 Transformation: Après digestion du plasmide Dpnl est prêt pour la transformation en l&#39;autorité compétente E. cellules coli. Il suffit d&#39;ajouter 5 ul de la réaction de digestion Dpnl dans les cellules compétentes et de réaliser la transformation tel que recommandé dans votre laboratoire. Dans notre cas, nous utilisons la procédure de choc thermique en incubant le mélange de bactéries plasmide sur la glace pendant 30 min puis choc thermique c&#39;est à 42 ° C pendant 90 sec. Après l&#39;ajout de 200 ul SOC-solution, les bactéries sont incubées, secouer vigoureusement, à 37 ° C pendant 1 h. Après 1 heure du bactéries sont étalées sur la sélection d&#39;agar. Jour deux 2,0 2.1 Dépistage d&#39;une partie des clones 1: Sélection des clones Parce que l&#39;efficacité mutation n&#39;est pas à 100% vous avez besoin de l&#39;écran de votre mutants. Nous faisons cela par digestion de restriction dans lequel nous vérifier la présence ou l&#39;absence de site de restriction auquel nous avons ajouté ou supprimé par l&#39;intégration d&#39;apprêt. A cet effet, nous avons l&#39;habitude ramasser huit colonies et les cultiver pendant la nuit pour la préparation de plasmide sur le lendemain. 3.0 La troisième journée 3.1 Dépistage d&#39;une partie des clones 2: digestion de restriction avec l&#39;enzyme marqueur Le troisième jour, vous effectuez une préparation Mini et la digestion de restriction ultérieurs avec votre marqueur enzymatique. Sur le gel vous pouvez alors voir lequel de vos clones porteurs de la mutation désirée et ceux qui pas. La méthode de dépistage à l&#39;aide la digestion de restriction fonctionne très bien. Néanmoins, vous devez confirmer votre mutation réussie par séquençage.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Mutagenèse dirigée est une méthode qui mutagenèse fournit un moyen rapide de muter un gène porté par un plasmide. La réaction peut être fait tout en une seule journée. Avec cette méthode, il suffit d&#39;une paire d&#39;amorces complémentaires portant les mutations souhaitées et une polymérase Pfu relecture tels que-polymérase. Le plasmide nouvellement synthétisés peuvent être séparés du plasmide parental en digérant la réaction avec l&#39;enzyme de restriction Dpnl. Cette enzyme digère l&#39;ADN méthylé uniquement. Par...

<table><tbody><tr><td>Polymerase Pfu (recombinante ou native)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 or EP0501</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de dNTP à 10 mM</td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI ou DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>désalinisées</td></tr></tbody></table>

mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d&#39;un plasmide d&#39;origine. Avec cette méthode, le gène cible clonés peuvent être modifiés par substitution, délétion ou d&#39;insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il fonctionne tout simplement en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, porteurs de la mutation souhaitée, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Dans ce tutoriel vidéo, nous démontrons une manière facile et rentable d&#39;introduire des substitutions de bases dans un plasmide. Le protocole fonctionne avec des réactifs standard et est indépendant de kits commerciaux, qui sont souvent très coûteux. L&#39;application de ce protocole peut réduire le coût total d&#39;une réaction à un huitième de ce qu&#39;il en coûte en utilisant certains des kits commerciaux. Dans cette vidéo, nous avons également des commentaires sur les étapes essentielles du processus et donner des instructions détaillées sur la façon de concevoir les amorces mutagènes.

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d&#39;un plasmide d&#39;origine. Ici nous démontrons une manière facile et rentable d&#39;introduire des substitutions de bases dans un plasmide standard en utilisant des réactifs.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

La mutagenèse dirigée de plasmides entiers est un moyen simple de créer de légères variations d'un plasmide original. Avec cette méthode, le plasmide cloné...

Bonjour. Je m'appelle Mark Blo. Je suis étudiant diplômé en biologie à l'Université de Mines en Allemagne. Aujourd'hui, mon ami Kajo et moi aimerions vous montrer comment réaliser une neurogenèse dirigée maison.La méthode a été initialement développée par Ethal et adaptée par de nombreuses autres personnes. Ainsi, lorsque vous consultez Internet aujourd'hui, vous trouverez de nombreux protocoles différents qui varient selon des points plus ou moins importants. Aujourd'hui, nous aimerions vous présenter une méthode simple et économique qui fonctionne bien pour nous.Commençons donc. Pour cette expérience, vous avez besoin d'une ADN polymérase thermostable et correctrice. Nous utilisons toujours la polymérase PFU de chez Fermenters.Logically.Vous avez également besoin du tampon polymérase, des dNTP, du mélange et de l'eau. De plus, vous avez besoin de l'enzyme de restriction DpnI, de cellules compétentes d'Escherichia coli, d'une plaque d'agar, de bouillon de culture bactérienne et d'une série de cure-dents. La partie la plus essentielle et critique de cette méthode est la conception des amorces mutagènes.Il existe quelques consignes simples à prendre en compte lors de la conception d

homemade-site-directed-mutagenesis-of-whole-plasmids

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ici nous démontrons un protocole simple de créer une bibliothèque aléatoire mutant pour une séquence cible donnée. Nous montrons comment cette méthode, qui est réalisée in vivo chez Escherichia coli, peuvent être couplées avec des sélections fonctionnelles d'évoluer de nouvelles activités enzymatiques.

Protocoles de sélection mutagenèse et fonctionnelles pour l&#39;évolution dirigée de protéines dans les E. coli</em

Source : Tomás, J. M., et al. Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre l’amplification dépendante de l’initiateur d’un plasmide suicide chez E. coli. Le plasmide, qui porte un gène de résistance aux antibiotiques, ne se réplique qu’en présence d’une protéine initiatrice codée par l’hôte. Après électroporation et incubation dans un milieu de récupération, le mélange est plaqué sur...

Amplification d’un plasmide suicide chez un hôte bactérien

Source : Lea-Smith, D. J., et al. Génération de mutants marqués et sans marqueurs chez des espèces cyanobactériennes modèles. J. Vis. Exp. (2016)La vidéo montre une méthode pour générer des mutants marqués par des antibiotiques chez les cyanobactéries. Le protocole commence par la culture de cyanobactéries, suivie d’étapes de centrifugation et de lavage qui préservent les piles de surface. Un plasmide porteur d’un gène de résistance aux antibiotiques flanqué de séquences homologues est ensuite...

Génération de mutants marqués aux antibiotiques chez les cyanobactéries par recombinaison homologue

Nous présentons un protocole pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation site unique mutagenèse complets de protéines en utilisant le séquençage à haut débit. Fait important, cette approche utilise des paires d'amorces orthogonales pour multiplexer la construction et le séquençage bibliothèque. Les résultats représentatifs en utilisant TEM-1 β-lactamase sélectionnée à une dose cliniquement pertinente de l'ampicilline sont fournis.

Un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

Expansion du code génétique est un outil puissant pour étudier un large éventail de processus biologiques, y compris l’acétylation protéique. Nous démontrons un protocole facile à exploiter cette technique pour générer de façon homogène acétylé de protéines à des sites spécifiques dans les cellules d’Escherichia coli .

Un protocole Facile à générer des protéines relativement acétylées chez Escherichia Coli

Cet article décrit une méthodologie détaillée pour la mutagénèse aléatoire d’un gène cible chez la levure. À titre d’exemple, nous ciblons rpt4 +, qui code une sous-unité du protéasome 19 s et écran pour les mutations qui déstabilisent l’hétérochromatine.

Gène-cible de la mutagénèse aléatoire pour sélectionner des Mutants de protéasome déstabilisant de l’hétérochromatine chez la levure

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).

Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli

Des endonucleases de restriction avec une nouvelle spécificité de séquence peuvent être développées à partir d’enzymes reconnaissant une séquence partiellement dégénérée. Ici, nous fournissons un protocole détaillé que nous avons utilisé avec succès pour modifier la spécificité de la séquence de l’enzyme NlaIV. Les ingrédients clés du protocole sont la compartimentation in vitro de la réaction de transcription/traduction et la sélection de variantes avec de nouvelles spécificités séquences.

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

Le présent protocole décrit de nouveaux outils pour les tests de liaison SPR afin d’examiner la liaison CV-N à l’HA, à la glycoprotéine S, aux glycanes de type hybride apparentés et aux oligosaccharides à haute teneur en mannose. SPR est utilisé pour déterminer le KD pour lier le CV-N dimérique ou monomère à ces glycanes.

Ingénierie d’agents antiviraux par résonance plasmonique de surface

Ici, nous présentons un protocole pour réduire les modifications de l’ADN dans les bactériophages à l’aide de l’enzyme NgTET, permettant une mutagenèse CRISPR-Cas efficace et sans cicatrice. Cette méthode facilite le génie génétique des phages pour des applications en biotechnologie et en phagothérapie.

Mutagénèse précise des phages avec des systèmes CRISPR-Cas assistés par NgTET

Apprenez la mutagenèse dirigée de plasmides entiers pour la biologie moléculaire en utilisant une méthode simple et économique. Cette technique permet d'introduire des substitutions de bases avec succès.

Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Explorer plus de vidéos