Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Cette procédure commence par l’accouplement de deux cellules de levure haid génétiquement différentes. Les diploïdes sont sélectionnés par placage réplique sur un milieu qui ne permet la croissance que des diploïdes. Les diploïdes sont ensuite patchés sur des plaques de sation ou sous forme d’asci.

Les asques sont disséqués avec l’haplos placé à un endroit défini sur la plaque. Une fois que les haplos résultants ont atteint une colonie visible, la plaque est répliquée dans un milieu sélectionné pour identifier le génotype des cellules individuelles. Bonjour, je m’appelle Adrian Morris.

Et je m’appelle Audrey Mahe. Et nous venons du laboratoire du Dr Michael Satcher de l’Université Concordia à Montréal. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de dissection de la levure qui est généralement appelée ra.

Utilisez cette procédure dans notre laboratoire pour instruire les souches d’haplo D avec de nouveaux génotypes et pour étudier les effets du mélange de deux mutations ensemble. Alors commençons : Pour construire une souche diploïde, deux souches haplo de types d’accouplement opposés sont accouplées. Dans notre cas, les souches haplo sont d’abord brayées sur un milieu approprié YPD pour produire des colonies uniques à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélever une petite partie d’une colonie dans l’une des deux souches haplo sur une nouvelle plaque YPD et tracer la boucle.

Une fois en ligne droite à travers l’assiette, marquez la direction de la traînée avec une flèche au bas de l’assiette. Ensuite, prélevez une petite partie d’une colonie de l’autre souche haplo sur la même plaque YPD. Stries perpendiculaires à la première souche, croisant la première stries avec la deuxième marque, dans la direction de la deuxième souche.

Et notez la zone où la deuxième traînée se croise. Le premier. C’est dans cette zone que les diploïdes seront produits.

Incuber la plaque YPD à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Après la réplique de la plaque d’incubation d’une nuit, la plaque YPD sur un milieu sélectionné qui permettra la croissance sélective des diploïdes nouvellement formés. Incuber l’assiette toute la nuit à 30 degrés Celsius.

Une fois que les diploïdes ont poussé sur l’assiette, choisissez une seule colonie si possible, ou une petite partie de la traînée diploïde en traînée sur le même milieu sélectif pour générer des colonies uniques. Une fois la souche diploïde obtenue, choisissez des colonies individuelles et faites de petites plaques sur les plaques de sporulation. Incuber à 30 degrés Celsius pendant trois à sept jours pour sporuler.

Pour vérifier la sporulation, examinez les cellules de chaque parcelle au microscope optique. Placez les cellules sur un microscope. Glissez-y cinq à 10 microlitres d’eau.

Placez une lamelle sur la gouttelette et recherchez la présence d’asques. Si vous demandez ou si vous n’êtes pas facile à trouver, tournez l’assiette vers l’incubateur. S’il y a une sporulation efficace Dans l’un des patchs, préparez un tube conique stérile de 15 millilitres avec 100 microlitres de jus tétra

Prélevez des cellules de ce patch de sporulation avec une boucle d’inoculation stérile de trois millimètres et placez-les dans le jus de tétrade. Faites tourner doucement la boucle pour permettre aux cellules de tomber de la boucle et mélangez-les à la solution. Laissez les cellules dans le jus de tétrade pendant quatre à 10 minutes.

Cela permet la digestion de la paroi cellulaire entourant les spores d’ASCO. Pour préparer une plaque pour la dissection des asques, marquez le haut et le bas de la région de l’inoculum sur une plaque YPD. Lorsque les cellules sont suffisamment digérées, prélevez cinq microlitres de cellules digérées et placez délicatement des gouttes en ligne dans la région de l’inoculum de la plaque YPD pré-marquée avec une boucle d’inoculation stérile de trois millimètres.

Étalez très doucement les gouttes une à trois fois dans l’alignement tout en entrant à peine en contact avec la tarière. Laissez le liquide absorber dans la tarière. Vous êtes maintenant prêt à commencer la dissection des asci.

Pour commencer la dissection des asci, placez la plaque de dissection sous le microscope de micromanipulation singer MSM system 200. Concentrez-vous sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l’autre moitié est vide. Mettez lentement l’aiguille au point, de sorte qu’elle touche la région vide du champ.

Le contact entre l’aiguille et la gélose est perçu comme un cercle noir foncé qui se précise lentement. Une fois que l’aiguille est entrée en contact avec l’aer, retirez-la un peu pour vérifier qu’aucune cellule n’a été déposée dans la zone où l’aiguille a touché l’aer. Cela permet de s’assurer que l’aiguille ne contient pas de cellules provenant d’une utilisation précédente.

Allez à la matrice en position A et faites une marque en perçant la tarière. Encore une fois, il s’agit d’aider à déterminer l’orientation de la plaque. S’il est enlevé, la dissection avant est terminée.

Passez en mode recherche. Localisez un ascus. Les quatre spores d’ASCUS d’un ASCUS doivent toujours être attachées les unes aux autres.

Deux spores d’ASCUS peuvent être légèrement plus grandes que les deux autres. Évitez de choisir des asques là où une spore d’ASCA est lâche et non connectée au reste des spores d’ASCA. Pour ramasser un ascus, amenez lentement l’aiguille vers la plaque.

Lorsque l’ombre de la micro-aiguille est visible, alignez-la avec l’asque à cueillir. Déplacez l’aiguille jusqu’à ce que le contour noir d’un cercle soit visible. Touchez la tétrade avec ce cercle, puis retirez rapidement l’aiguille.

Assurez-vous que tous les quatre nous demandent, que les spores d’un asque ont adhéré à l’aiguille et qu’aucune cellule supplémentaire ne faisant partie de cet asque n’a été captée par la micro-aiguille. Une fois que l’asque a été capté par la micro-aiguille, tirez la micro-aiguille loin de la plaque et allez vers la matrice. Pour le premier ascus, allez à la position un.

Placez l’asque vers le bas en touchant la plaque avec la micro-aiguille et en la tirant jusqu’à ce qu’elle soit quatre fois. Demandez-nous que les spores se détachent de la micro-aiguille en tapotant doucement le bras de l’aiguille ou la plate-forme tenant la plaque YPD est souvent utile. À cette étape.

Continuez à localiser, prélever et placer les ASCI à des positions consécutives sur la matrice jusqu’à ce que le nombre souhaité d’ASCI ait été obtenu. Prenez note de chaque poste où un ASCUS est déplacé. Lorsque le nombre souhaité d’asques a été choisi, retournez à chaque demande et séparez les quatre cellules en taquinant avec l’aiguille, en tapotant doucement la plate-forme ou une combinaison des deux.

Ramassez les cellules en laissant une derrière vous. Transférez le reste. Demandez à E une nouvelle position dans la matrice et répétez jusqu’à chaque demande.

L’APO dans chaque asque est séparé en rangées de quatre. Une dissection d’asci est terminée. Placez la plaque YPD dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant plusieurs jours pour observer le schéma de croissance.

Une fois que les asques disséqués ont grandi, répliquez-les plaquez-les dans un milieu sélectif. Si nécessaire, il s’agit d’une plaque qui a été plaquée comme une réplique et la plaque de dissection d’origine et la plaque sélective ont grandi pendant la nuit. Les résultats observés sur la plaque sélective doivent être notés et la cellule haplo appropriée identifiée et sélectionnée.

Dans les cas où les diploïdes ne peuvent pas être identifiés sur des plaques sélectives, il faut sélectionner manuellement des haplos accouplés appelés zygotes qui sont facilement identifiables à un stade précoce après l’accouplement. La procédure de préparation des cellules haploïdes et d’accouplement est identique à celle déjà décrite, sauf que la région où le diploïde doit se trouver est examinée après des temps d’incubation plus courts à 30 degrés Celsius. Nous constatons que quatre à six heures constituent un bon point de départ, mais que la durée devrait finalement être déterminée empiriquement.

Vérifiez la présence de zygotes au microscope optique, les zygotes apparaîtront sous forme de cellules en forme d’haltère, avec ou sans bourgeon, ramassez les cellules avec une boucle d’inoculation de trois millimètres et placez-les doucement dans 100 microlitres d’eau stérile. Une fois que les cellules ont été transférées sur une plaque YPD pré-marquée, utilisez une boucle d’inoculation de trois millimètres pour étaler les gouttes en une ligne très doucement, tout en entrant à peine en contact avec la tarière. Laissez le liquide absorber dans la tarière.

Passez au microscope de dissection. Concentrez-vous sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l’autre moitié est vide. Mettez lentement l’aiguille au point de manière à ce qu’elle touche la région vide du champ.

Comme indiqué précédemment. Vérifiez que l’aiguille ne contient pas de cellules provenant d’une utilisation précédente. Allez à la matrice en position A et faites une marque en perçant la tarière.

Encore une fois pour aider à déterminer l’orientation de la plaque. Passez en mode recherche et localisez un zygote. Prenez le zygote avec l’aiguille.

Placez les zygotes individuellement sur la matrice. Laissez les zygotes se développer pendant plusieurs jours. Fixez les cellules diploïdes sur des plaques de sporulation et procédez comme dans la troisième partie.

L’accouplement de deux souches d’haplo de types d’accouplement opposés génère une souche diploïde. Cette planche YPD montre les résultats d’un accouplement entre une souche sensible à la température avec une atrophie de bœuf lu two et une souche de type sauvage. Les souches digérées sont réparties dans la région de l’inoculum à gauche, où l’on voit une croissance épaisse entre les deux lignes noires.

Les asques qui ont été disséqués poussent uniformément dans la matrice de droite. Lorsque cette plaque YPD a été répliquée sur une plaque de chute de leucine SD, nous voyons la croissance de deux à deux pour le marqueur LU deux indiquant qu’une spore ASCO valide a été disséquée. La plaque originale de YPD a également été reproduite sur une autre plaque YPD et incubée à une température plus élevée de 37 degrés Celsius, où la croissance de deux à deux confirme qu’une spore d’ASCO a été disséquée.

Nous venons de vous montrer comment créer deux cellules de haid et sélectionner des diploïdes. Basée sur deux méthodes différentes, l’une utilise des marqueurs tropiques et l’autre est basée sur la morphologie cellulaire. En utilisant cette procédure, il est tellement, tellement important de se rappeler de sélectionner les cellules haid nouvellement construites à partir d’une dissection tétra, dont les marqueurs atrophiques sont représentés comme prédits.

Il est également important de se rappeler de ne pas trop digérer ou sous-digérer. Le tétra en tant qu’asques n’a pas réussi à rester ensemble dans les tétrades, qui ont été trop digérées et sont difficiles à séparer dans les tétrades qui ont été sous-digérées. Donc c’est tout.

Bonne chance dans vos expériences.