Name: Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Découvrez la micromanipulation de cellules de levure Saccharomyces cerevisiae pour l'analyse génétique méiotique. Cette méthode permet de sélectionner des zygotes diploïdes et d'étudier la fonction des gènes avec précision.

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Le travail dans le laboratoire de l&#39;auteur est financée par les Instituts canadiens de recherche en santé, la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, les sciences naturelles et en génie Conseil de recherches et de l&#39;Université Concordia.

Construction de souches diploïdes Protocole pour la production de diploïdes par accouplement <ol><li> Les souches initiale doit être frappé sur milieu YPD, ou sélective, si nécessaire, pour produire des colonies isolées. Les deux souches haploïdes doit être de type sexuel opposé (c.-à-Mata et MATa). </li><li> En utilisant une boucle d&#39;inoculation stériles ramasser une petite partie d&#39;une colonie de l&#39;un des deux souches haploïdes. Sur une strie plaque YPD nouvelle fois la boucle dans une ligne droite à travers la plaque. Repérer le sens de la ligne avec une flèche sur le bas de la plaque. </li><li> Répétez cette opération pour la deuxième souche sur la même plaque YPD. Cette fois-strie perpendiculaire à la première colonie, en traversant la strie premier avec le second. Repérer le sens de la strie secondes et noter la zone où le strie seconde traverse la première fois. Cette zone sera le lieu où diploïdes seront produites. </li><li> Incuber la plaque YPD à 30 ° C pendant la nuit. </li><li> Réplique de la plaque plaque YPD sur des milieux sélectifs qui permettent de façon sélective la croissance des diploïdes nouvellement formé. </li><li> Choisissez une seule colonie, si possible, ou une petite portion de la ligne diploïde et strie sur le même milieu sélectif pour générer des colonies isolées. </li></ol> La sporulation et la digestion des asques Protocole <ol><li> Prélever des colonies unique à partir de la plaque au-dessus et faire des petits (1cm x 1cm) patchs sur la sporulation (SPO) plaques et incuber à 30 ° C pendant 3-7 jours à sporuler. </li><li> La sporulation peut être vérifié en regardant les cellules de chaque patch sous un microscope optique. Placez les cellules sur une lame de microscope dans ul 5-10 de l&#39;eau, placer une lamelle sur le dessus de la goutte, et rechercher la présence d&#39;asques. Si asques ne sont pas faciles à trouver ensuite remis dans l&#39;incubateur. </li><li> S&#39;il ya sporulation efficace dans l&#39;un des correctifs, de préparer un tube de 15 ml stériles conique avec 100 pi de jus de tétrade. </li><li> Choisissez les cellules contre ce patch sporulation avec une boucle d&#39;inoculation 3mm stérile (cellules devraient couvrir un quart de la boucle) et placer dans le jus de tétrade. Mélanger délicatement la boucle pour permettre aux cellules de se détacher de la boucle et mélanger avec la solution. </li><li> Laissez-les dans le jus de tétrade (contenant zymolyase) pour 4 à 10 minutes (selon la concentration et l&#39;activité de zymolyase et la souche elle-même). Ceci permet pour la digestion de la paroi cellulaire entourant les ascospores. </li><li> Marquer le haut et le bas de la région d&#39;inoculum sur une plaque YPD. </li><li> Facultatif. La réaction peut être stoppée en ajoutant 1 ml de glace froide stériles dH 2 O. Permettre aux cellules de se contenter de 5 minutes. Retirer 1ml à partir du surnageant, puis mélanger délicatement à la main et de garder sur la glace. </li><li> Prenez 5uL de cellules digérées partir de l&#39;étape 5 et placez doucement gouttes dans une ligne dans la région de l&#39;inoculum de la plaque pré-marqués YPD. </li><li> Utilisez une boucle d&#39;inoculation stérile 3mm à très doucement répandre la fois 1-3 gouttes dans une ligne tout juste de prendre contact avec l&#39;agar-agar. </li><li> Laisser le liquide à absorber dans la gélose (Si l&#39;étape 7 est omis, c&#39;est à ce moment de la digestion de la paroi cellulaire externe sera réduit ou arrêt). Passez à la microscope à dissection. </li></ol> Dissection d&#39;Asques Protocole Notez que le protocole suivant est décrit pour un microscope Système Chanteur MSM micromanipulation 200. Ce protocole peut être suivie avec de légères modifications en cas d&#39;utilisation d&#39;un micromanipulateur manuelle comme un micromanipulateur Zeiss MR. <ol><li> Focus sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l&#39;autre moitié est vide. Porter lentement l&#39;aiguille dans l&#39;accent de telle sorte qu&#39;il touche la région vide du champ. Cela permettra d&#39;assurer que l&#39;aiguille ne contiennent pas de cellules à partir d&#39;un usage antérieur. Le contact entre l&#39;aiguille et l&#39;agar-agar est considéré comme un cercle noir foncé qui vient lentement dans le foyer. </li><li> Aller à la matrice à la position A1 et faire une marque en perçant la gélose à nouveau. C&#39;est pour aider à déterminer l&#39;orientation de la plaque si elle est prise hors du microscope avant la fin. </li><li> Passez en mode de recherche. Localiser un asques. De préférence, choisissez asques qui sont dans des zones où les cellules sont bien étalées. Évitez les zones avec des amas de cellules. Les quatre ascospores à partir d&#39;un asques devrait toujours être attachés les uns aux autres. Deux ascospores peut être légèrement plus grand que les deux autres. Evitez la cueillette asques où l&#39;on ascospores est lâche et pas connecté au reste de la ascospores. </li><li> Ramassez un asque avec l&#39;aiguille. Porter lentement l&#39;aiguille jusqu&#39;à l&#39;assiette. Quand l&#39;ombre de la micro-aiguille est vu, la ligne de cette place avec l&#39;asque à être cueillis. Encore une fois l&#39;approche de l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que la silhouette noire d&#39;un cercle (la pointe de l&#39;aiguille) est vu. Touchez la tétrade avec ce cercle puis retirez rapidement l&#39;aiguille loin. Assurez-vous que tous les quatre ascospores à partir d&#39;un asque ont adhéré à l&#39;aiguille et qu&#39;aucune des cellules supplémentaires ont été recueillies sur la micro-aiguille qui ne font pas partie de cette asque. </li><li> Tirez sur la micro-aiguille loin de la plaque et aller à la matrice (pour l&#39;asque d&#39;abord, aller àposition A1). Prenez note de chaque position où un asque est déplacé. Placez l&#39;asque par toucher la plaque avec la micro-aiguille et écartant jusqu&#39;à ce que tous quatre ascospores se détacher de la micro-aiguille. Tapotant doucement sur le bras d&#39;aiguille ou de la plate-forme maintenant la plaque YPD est souvent utile à cette étape. </li><li> Répétez les étapes 3-5 et le lieu asques bas à des positions consécutives sur la matrice jusqu&#39;à ce que le nombre souhaité d&#39;asques ont été cueillis. </li><li> Retournez à chaque asque et de briser les quatre cellules à part par des taquineries avec l&#39;aiguille, en tapant la plate-forme en douceur ou une combinaison des deux. Ramassez les cellules laissant un derrière à une nouvelle position dans la matrice jusqu&#39;à ce que chaque ascospores dans chaque asque est séparé en rangées de quatre. </li><li> Placer la plaque YPD dans un incubateur à 30 ° C pendant plusieurs jours pour observer le modèle de croissance. </li><li> Plaque Replica les cellules disséqué au milieu sélectif si nécessaire. </li></ol> Relocalisation des zygotes Protocole <ol><li> Streak sur deux souches haploïdes de types sexuels opposés sur le support approprié pour obtenir des colonies isolées. </li><li> Maté ces deux souches comme décrit ci-dessus et permettent de passer de 4 à 6 heures (ou toute la nuit si nécessaire). </li><li> Vérifiez zygotes sous un microscope optique. Zygotes apparaîtra comme forme d&#39;haltère cellules avec ou sans un bourgeon. </li><li> Choisissez les cellules avec une boucle d&#39;inoculation 3mm (cellules devrait couvrir le quart de la boucle) et le placer délicatement dans 100 pi de stériles O. DH 2 </li><li> Marquer le haut et le bas de la région d&#39;inoculum sur une plaque YPD. </li><li> Prenez 5uL et placez doucement gouttes dans une ligne dans la région de l&#39;inoculum de la plaque pré-marqués YPD. </li><li> Utilisez une boucle d&#39;inoculation 3mm pour diffuser les gouttes dans une ligne très doucement tout en peine de prendre contact avec l&#39;agar-agar. </li><li> Laisser le liquide à absorber dans la gélose. Passez à la microscope à dissection. </li><li> Focus sur une région de la plaque où la moitié du champ contient des cellules et l&#39;autre moitié est vide. Porter lentement l&#39;aiguille dans l&#39;accent de telle sorte qu&#39;il touche la région vide du champ. Cela permettra d&#39;assurer que l&#39;aiguille ne contiennent pas de cellules à partir d&#39;un usage antérieur. Le contact entre l&#39;aiguille et l&#39;agar-agar est considéré comme un cercle noir foncé qui vient lentement dans le foyer. </li><li> Aller à la matrice à la position A1 et faire une marque en perçant la gélose à nouveau. C&#39;est pour aider à déterminer l&#39;orientation de la plaque si elle est prise hors du microscope avant la fin. </li><li> Passez en mode de recherche. Localisez un zygote. </li><li> Ramassez un zygote avec l&#39;aiguille. </li><li> Placez zygotes individuellement sur la matrice. </li><li> Autoriser les zygotes de croître pendant plusieurs jours. </li><li> Plaque Replica les zygotes sur le milieu sélectif approprié. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Figure 1: L&#39;accouplement de deux souches haploïdes de types sexuels opposés génère une souche diploïde. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Figure 2: (a) une plaque YPD avec des résultats thre d&#39;un accouplement entre une souche sensible à la température (avec une auxotrophie leu2) et une souche de type sauvage (LEU2). Cellules digérées sont réparties dans la région de l&#39;inoculum sur la gauche où la croissance épaisse entre les deux lignes noires est vu. Asci qui ont été disséqués croître régulièrement espacés dans la matrice sur la droite. (B) la plaque (A) a été reproduite sur une SD-leucine abandon assiette. Notez la croissance 2h02 pour le marqueur LEU2 indiquant une ascospores validé a été disséqué. (C) La plaque (A) a été reproduite sur une plaque YPD et incubées à 37 ° C. Notez la croissance 2h02 qui valide en outre qu&#39;un des ascospores a été disséqué.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Dissection La levure est un outil utile pour sélectionner de nouvelles souches avec des marqueurs souhaités. Lors de la détermination du modèle de croissance théorique de quatre ascospores, il est important de regarder le génotype de la cellule végétative. Si un plasmide est présent, il faut savoir s&#39;il est seul exemplaire, faible ou forte que cela aura une incidence qui ascospores (s) de recevoir le plasmide et aura une incidence sur les prévisions et conclusions concernant les souches d&#39;être manipulé. <p c...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Microscope</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Réactif</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Base d'azote pour levures</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptone</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d'adénine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracile</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophane</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Réactif</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-méthionine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-phénylalanine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-thréonine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Réactif</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection de saccharomyces cerevisiae asques

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

La levure est un système modèle très souple qui est utilisé pour étudier de nombreux processus cellulaires différents. La souche de laboratoire commun<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Existe soit dans un état haploïde ou diploïde. La capacité de combiner des allèles de deux haploïdes et la capacité d&#39;introduire des modifications du génome nécessite la production et la dissection des asques. La production de cellules haploïdes Asques commence par l&#39;accouplement de deux souches haploïdes de levure avec les types d&#39;accouplement compatibles pour produire une souche diploïde. Ceci peut être accompli dans un certain nombre de façons, soit sur support solide ou en liquide. Il est avantageux de choisir pour les diploïdes en milieu qui favorise leur croissance de manière sélective par rapport à l&#39;une des deux souches haploïdes. Les diploïdes sont alors autorisés à sporuler sur pauvres en éléments nutritifs milieu pour former asques, un faisceau de quatre cellules filles haploïdes résultant de la reproduction méiotique des diploïdes. Un mélange de cellules végétatives et asques est ensuite traité avec les enzymes pour digérer zymolyase loin le sac membrane entourant les ascospores de l&#39;ASCI. Par micromanipulation avec une micro-aiguille sous un microscope de dissection on peut ramasser individuels asques et séparée et relocaliser les quatre ascopores. Asques disséqués sont cultivés pendant plusieurs jours et testés pour les marqueurs ou allèles d&#39;intérêt en étalant sur des répliques milieux sélectifs appropriés.

Micromanipulation des cellules de levure est nécessaire pour l&#39;analyse génétique méiotique ou pour sélectionner les zygotes diploïdes. Ces micromanipulations sont effectuées en utilisant le micro-aiguille d&#39;un microscope à dissection. La micro-aiguille est utilisée pour déplacer des cellules et est contrôlé par un micromanipulateur qui sont disponibles avec différents degrés d&#39;automatisation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

La levure est un système modèle très malléable, utilisé pour étudier de nombreux processus cellulaires différents. La souche de laboratoire courante Saccharomyces cerevisiae...

Cette procédure commence par l'accouplement de deux cellules de levure haid génétiquement différentes. Les diploïdes sont sélectionnés par transfert sur boîte de Petri dans un milieu qui permet la croissance uniquement des diploïdes. Les diploïdes sont ensuite déposés en taches sur des boîtes de culture de sation ou forment des asques.Les asques sont disséqués en plaçant les haploïdes à un emplacement défini sur la plaque. Une fois que les haploïdes obtenus ont formé une colonie visible, la plaque est répliquée sur un milieu sélectionné afin d'identifier le génotype des cellules individuelles. Bonjour, je suis Adrian Morris.Et je suis Audrey Mahe. Nous travaillons au laboratoire du Dr Michael Satcher à l'Université Concordia de Montréal. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de dissection de spores de levure, généralement appelées ra.Utilisez cette procédure dans notre laboratoire pour introduire des génotypes nouveaux dans des souches haploïdes D et pour étudier les effets de la combinaison de deux mutations. Commençons donc. Pour construire une souche diploïde, deux souches haploïdes de types d'accouplement opposés sont croisées. Les souches haploïdes sont d'abord étalées sur un milieu approprié, YPD dans notre cas, afin d'obtenir des colonies isolées à l'aide d'une boucle d'inoculation stérile ; prélevez une petite portion d'une colonie provenant de l'une des deux souches haploïdes sur une nouvelle boîte de Pétri contenant du YPD, puis étalez-la à l'aide de la boucle.Une fois en ligne droite à travers la boîte, marquez la direction du trait par une flèche sur le fond de la boîte. Ensuite, prélève une petite portion d'une colonie de l'autre souche haploïde sur la même boîte YPD. Tracez la colonie perpendiculairement à la première souche, croisant le premier trait avec la deuxième marque, dans la direction du second trait.Et notez la zone où la deuxième strie croise la première. Cette zone sera celle où les diploïdes seront produits.Incuber la boîte de Pétri YPD à 30 degrés Celsius pendant toute la nuit. Après l'incubation nocturne, réaliser un transfert par empreinte de la boîte de Pétri YPD sur un milieu sélectif qui permettra spécifiquement la croissance des diploïdes nouvellement formés. Incuber la boîte de Pétri toute la nuit à 30 degrés Celsius.Une fois que les diploïdes ont poussé sur la boîte, prélève une colonie unique si possible, ou une petite portion de la strie diploïde, et étale-la sur le même milieu sélectif afin de générer des colonies isolées. Une fois la souche diploïde obtenue, prélève des colonies individuelles et réalise de petites zones de croissance sur des boîtes de sporulation. Incube à 30 degrés Celsius pendant trois à sept jours pour permettre la sporulation.Pour vérifier la sporulation, observer les cellules de chaque prélèvement au microscope optique. Déposer les cellules sur une lame. Ajouter cinq à dix microlitres d'eau.Placez une lame couvre-objet sur la goutte et recherchez la présence d'asques. Si les asques ne sont pas présents ou difficiles à trouver, remettez la boîte dans l'incubateur. S'il y a une sporulation efficace dans l'un des secteurs, préparez un tube conique stérile de 15 millilitres contenant 100 microlitres de jus de tétra.Prélevez les cellules à partir de cette colonie de sporulation à l’aide d’un anneau d’inoculation stérile de trois millimètres et placez-les dans le jus de tétrade. Tournez doucement l’anneau pour permettre aux cellules de se détacher et de se mélanger à la solution. Laissez les cellules dans le jus de tétrade pendant quatre à dix minutes.Cela permet la digestion de la paroi cellulaire entourant les spores d'ASCO. Pour préparer une plaque destinée à la dissection des asques, marquer le haut et le bas de la région d'inoculum sur une plaque YPD. Lorsque les cellules sont suffisamment digérées, prélever cinq microlitres de cellules digérées et déposer délicatement des gouttes en ligne dans la région d'inoculum de la plaque YPD préalablement marquée, à l’aide d’un anneau d’inoculation stérile de trois millimètres.Étalez très doucement les gouttes une à trois fois en alignant, en effleurant à peine l'augure. Laissez le liquide s'absorber dans l'augure. Vous êtes maintenant prêt à commencer la dissection des asques.Pour commencer la dissection des asques, placer la lame de dissection sous le microscope d'analyse microscopique Singer MSM 200. Focaliser sur une région de la lame où la moitié du champ contient des cellules et l'autre moitié est vide. Amener lentement l'aiguille en focalisation, de sorte qu'elle touche la région vide du champ.Le contact entre l'aiguille et l'agar apparaît sous la forme d'un cercle noir foncé qui entre lentement en focus. Après que l'aiguille a touché l'agar, reculez-la légèrement et vérifiez qu'aucune cellule n'a été déposée dans la zone où l'aiguille a touché l'agar. Cela garantit que l'aiguille ne contient pas de cellules provenant d'une utilisation précédente.Allez à la matrice à la position A1 et faites une marque en perçant la tarière. Là encore, cela permet de déterminer l'orientation de la plaque. Si elle est retirée avant que la dissection ne soit terminée.Passez en mode recherche. Localisez un asque. Les quatre spores d'asque provenant d'un asque doivent encore être attachées les unes aux autres.Deux spores ASCUS peuvent être légèrement plus grandes que les deux autres. Évitez de sélectionner les asques lorsqu'une spore ASCA est détachée et non reliée aux autres spores ASCA. Pour prélever un asque, approchez lentement l'aiguille de la plaque.Lorsque l'ombre de l'aiguille microscopique est visible, alignez-la avec l'asque à prélever. Déplacez l'aiguille jusqu'à ce qu'un cercle au contour noir soit visible. Touchez la tétrade avec ce cercle, puis retirez rapidement l'aiguille.Vérifiez que les quatre spores provenant d'un asque adhèrent à l'aiguille et qu'aucune cellule supplémentaire n'ayant pas fait partie de cet asque n'ait été prélevée par l'aiguille micrométrique. Une fois que l'asque a été prélevé par l'aiguille micrométrique, éloignez l'aiguille de la boîte et rendez-vous sur la matrice. Pour le premier asque, rendez-vous à la position a un.Placer l'asque en touchant la plaque avec l'aiguille micrométrique et en s'éloignant jusqu'à ce que les quatre spores soient détachées de l'aiguille. Donner de légers tapotements sur le bras de l'aiguille ou sur la plateforme supportant la plaque YPD est souvent utile à cette étape.Continuez à localiser, prélever et placer les asques successivement dans des positions consécutives sur la matrice jusqu'à ce que le nombre souhaité d'asques soit obtenu. Notez soigneusement chaque position où un ASCUS est déplacé. Lorsque le nombre souhaité d'asques a été prélevé, retournez à chaque ask us et séparez les quatre cellules en les écartant délicatement à l’aide de l’aiguille, en tapotant doucement la plateforme, ou en combinant les deux méthodes.Prélevez les cellules en en laissant une sur place. Transférez celle qui reste. Demandez à E de prendre une nouvelle position dans la matrice et répétez jusqu'à chaque demande.L'APO de chaque asque est séparée en rangées de quatre. Une dissection d'asques est réalisée. Placer la boîte de YPD dans un incubateur à 30 degrés Celsius pendant plusieurs jours afin d'observer le schéma de croissance.Une fois que les asques disséqués ont poussé, réalisez un transfert par empreinte sur un milieu sélectif. Si nécessaire, il s'agit d'une plaque qui a été transférée par empreinte, et à la fois la plaque d'origine de dissection et la plaque sélective ont été incubées toute une nuit. Les résultats observés sur la plaque sélective doivent être analysés, et la cellule haploïde appropriée identifiée et sélectionnée.Dans les cas où les diploïdes ne peuvent pas être identifiés sur des plaques sélectives, il faut sélectionner manuellement les haploïdes appariés, appelés zygotes, qui sont facilement reconnaissables à un stade précoce après l'accouplement. La procédure de préparation des cellules haploïdes et d'accouplement est identique à celle déjà décrite, à l'exception du fait que la région où le diploïde devrait se trouver est examinée après des durées d'incubation plus courtes à 30 degrés Celsius. Nous constatons qu'entre quatre et six heures constitue un bon point de départ, mais la durée exacte doit finalement être déterminée empiriquement.Observer les zygotes au microscope optique ; les zygotes apparaîtront comme des cellules en forme de haltère, avec ou sans bourgeon. Prélever les cellules à l’aide d’un anneau d’inoculation de trois millimètres et les déposer délicatement dans 100 microlitres d’eau stérile. Après avoir transféré les cellules sur une boîte YPD préalablement marquée, utiliser un anneau d’inoculation de trois millimètres pour étaler les gouttes en une ligne très doucement, en effleurant à peine la surface de l’agar. Laisser le liquide s’absorber dans l’agar.Passez au microscope de dissection. Focalisez-vous sur une région de la boîte où la moitié du champ contient des cellules et l'autre moitié est vide. Approchez lentement l'aiguille du plan de mise au point de manière à ce qu'elle touche la région vide du champ.Comme indiqué précédemment. Vérifiez que l'aiguille ne contient pas de cellules provenant d'une utilisation antérieure. Allez à la matrice à la position A1 et faites une marque en perçant la tarière.Encore une fois, pour aider à déterminer l'orientation de la lame. Passez en mode recherche et localisez un zygote. Prélevez le zygote avec l'aiguille.Placer les zygotes individuellement sur la matrice. Laisser les zygotes croître pendant plusieurs jours. Transférer les cellules diploïdes sur des boîtes de sporulation et procéder comme dans la troisième partie.L'accouplement de deux souches haploïdes de types d'accouplement opposés génère une souche diploïde. Cette plaque YPD montre les résultats d'un croisement entre une souche sensible à la température présentant une atrophie lu deux ox et une souche de type sauvage. Les souches digérées sont étalées dans la région d'inoculation à gauche, où une croissance dense entre les deux lignes noires est observée.Les asques qui ont été dissociées se développent de manière régulièrement espacée dans la matrice à droite. Lorsque cette plaque YPD a été répliquée sur une plaque SD sans leucine, on observe une croissance deux sur deux pour le marqueur LU deux, indiquant qu'une spore ASCO valide a été dissociée. La plaque YPD d'origine a également été répliquée sur une autre plaque YPD et incubée à une température plus élevée de 37 degrés Celsius, où la croissance deux sur deux confirme davantage que la spore ASCO a été dissociée.Nous venons de vous montrer comment produire deux cellules haid et sélectionner les diploïdes. Deux méthodes différentes sont utilisées : l'une repose sur des marqueurs trophiques, l'autre sur la morphologie cellulaire. Lors de l'application de cette procédure, il est extrêmement important de se souvenir de sélectionner les cellules haid nouvellement construites à partir d'une dissection tétra, dans laquelle les marqueurs atrophiques sont exprimés comme prévu.Il est également important de ne pas faire une sur-digestion ou une sous-digestion. Les tétra-asques n'ont pas réussi à rester ensemble dans les tétrades ayant subi une sur-digestion, et sont difficiles à dissocier dans les tétrades ayant subi une sous-digestion. Voilà tout.Bonne chance avec vos expériences.

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Nous présentons un protocole pour la préparation de lamelles d’échantillons biologiques congelés par micro-usinage par faisceau d’ions cryo-focalisé pour des études structurelles à haute résolution de macromolécules in situ avec cryo-tomographie électronique. Le protocole présenté fournit des lignes directrices pour la préparation de lamelles de haute qualité avec une reproductibilité élevée pour la caractérisation structurelle des macromolécules à l’intérieur des Saccharomyces cerevisiae.

Préparation et micro-usinage Cryo-FIB de Saccharomyces cerevisiae pour la cryo-tomographie électronique

Cette étude décrit comment disséquer le sac endolymphatique de l’oreille interne de la souris à différents âges. Le résultat d’une dissection similaire est montré dans un modèle murin Slc26a4-null d’élargissement du sac endolymphatique. Une souris transgénique avec un rapporteur fluorescent exprimé dans le sac endolymphatique est présentée comme un modèle permettant de visualiser facilement le sac endolymphatique, et un outil éducatif.

Dissection du sac endolymphatique de souris

Ce protocole est une méthode efficace et rapide de culture des levures et de la moisissure Aspergillus fumigatus à partir de grands ensembles d’échantillons de sol en aussi peu que 7 jours. Les méthodes peuvent être facilement modifiées pour s’adapter à une gamme de milieux d’incubation et de températures au besoin pour les expériences.

Isolement des levures et des moisissures cultivables des sols pour étudier la structure de la population fongique

Découvrez la micromanipulation de cellules de levure Saccharomyces cerevisiae pour l'analyse génétique méiotique. Cette méthode permet de sélectionner des zygotes diploïdes et d'étudier la fonction des gènes avec précision.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

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