Mesure Caenorhabditis elegans sur des milieux solides

Pour mesurer la durée de vie chez C. Elgan, une population synchronisée par l’âge est générée en utilisant un langage d’œufs chronométré de manière reproductive. Les vers hermaphrodites adultes actifs sont transférés sur des plaques de culture nématodes ensemencées avec E. coli tué par les UV, laissés pondre des œufs pendant six à huit heures, puis retirés au cours des deux jours suivants ; les vers éclosent de ces œufs et atteignent le stade larvaire L 4. Les vers L quatre sont transférés dans de nouvelles plaques NGM contenant de l’ampicilline pour prévenir la contamination bactérienne vivante et la FUDR pour empêcher la reproduction, puis laissée se développer en adultes.

À partir de ce moment, les vers adultes sont observés tous les deux à trois jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts. À chaque moment, des vers morts sont retirés de la plaque et le nombre de vers vivants et morts est enregistré. Je suis George Seton du laboratoire de Matt Capline au département de pathologie de l’Université de Washington.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer comment mesurer notre espérance de vie et voir notre élégance face à l’hépatite. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la génétique du vieillissement. Alors, commençons.

Une expérience de durée de vie de base nécessite deux types de plaques : les plaques NGM standard, qui ne contiennent aucun additif, et les plaques AMP FUDR, qui contiennent à la fois de l’ampicilline et de fluoro-uridine désoxy ajoutées au NGM. Les deux types de plaques sont posées avec la bactérie E. coli OP 50, qui est ensuite tuée par exposition aux UV. Commencez par préparer 10 millilitres de solution NGM.

Par boîte de Petri de 60 millimètres, on fait complètement fondre le gel nucléaire solide en le micro-ondes à haute intensité en 32e impulsions. Faites tournoyer les médias entre les impulsions pour empêcher la formation de bulles de gaz sous pression, placez le NGM liquide dans un bain-marie à 55 degrés Celsius ou sur le banc pour laisser refroidir le mieu. Une fois que le substrat a refroidi à 55 degrés Celsius, moment où vous devriez pouvoir tenir confortablement le récipient en verre à mains nues, il est prêt à recevoir des médicaments.

Et pour verser les assiettes contenant des médicaments, ajoutez 33 microlitres de 150 millimolaires FUDR et 100 microlitres de 100 milligrammes par millilitre. L’ampicilline par 100 millilitres NGM et un tourbillon pour mélanger de l’ampicilline sont utilisées pour prévenir la contamination bactérienne étrangère et la FUDR pour empêcher l’éclosion des œufs. Ainsi, les vers n’auront pas besoin d’être transférés tous les quelques jours pour les séparer des larves en croissance.

Versez maintenant le milieu et laissez sécher les plaques sur le banc pendant deux jours, la veille de la fin de séchage de la culture LB liquide de graines avec une seule colonie à partir d’une traînée fraîche d’E. coli. OP 50 bactéries sur la tarière LB. Préparez au moins 0,5 millilitre de culture par plaque de 60 millimètres.

Placez la culture OP 50 dans un shaker à 37 degrés Celsius et laissez les bactéries se développer pendant la nuit. Le lendemain, pelletez la bactérie OP 50 avec 3 500 g de force centrifuge pendant 10 minutes. Faites une décantée suffisante de surnageant pour resuspendre la bactérie à une concentration de 10 fois.

Inoculez maintenant chaque plaque avec 100 microlitres de la culture concentrée. Évitez de toucher la pointe de la pipette à la surface du NMN, car des défauts à la surface du milieu permettront aux vers de creuser les plaques tourbillonnantes jusqu’à ce que les bactéries couvrent la zone centrale du NMN sans s’approcher des parois des plaques et laissent les plaques sécher sur le banc pendant 24 heures. Une fois sèches, exposez la surface des plaques à une dose UV suffisamment forte pour stopper la croissance bactérienne, nous utilisons un lien UV straddle 2 du gène strata 2, 400.

Commencez par charger les plaques dans le liaison à cheval, sans leur couvercle. Maintenant, appuyez sur l’énergie. Saisissez 9 9 9 9 sur le clavier et appuyez sur start.

Les plaques seront exposées aux UV pendant environ cinq minutes. Les plaques contenant des bactéries tuées par les UV peuvent être stockées à l’envers à quatre degrés Celsius pendant jusqu’à un mois. Cette section décrit comment générer une population de vers avec une date d’éclosion commune.

Commencez par transférer environ 20 vers adultes jeunes vers une plaque NGM fraîche sans médicaments. Laissez l’assiette à 25 degrés Celsius pendant environ une semaine pour permettre aux vers de se propager et de consommer toute la nourriture bactérienne en une semaine. Les vers nouvellement éclos, au stade de dot arrêtée de croissance, doivent apparaître transférés de 20 à 30 larves de dot sur une plaque NGM fraîche sans médicaments, puis les incuber à 25 degrés Celsius en présence de nourriture.

Les larves de la dot deviennent adultes actives en reproduction en deux jours et restent actives pendant quelques jours par la suite. Transférez maintenant 10 à 15 des adultes reproductivement actifs sur une plaque NGM fraîche sans médicaments. Cette plaque est appelée plaque de ponte chronométrée ou plaque TEL.

Laissez la plaque TEL à 25 degrés Celsius pour que les vers puissent pondre des œufs. Les animaux qui éclosent de ces œufs seront des animaux expérimentaux et auront leur espérance de vie évaluée après six heures. Inspectez la plaque TEL pour détecter des œufs.

S’il n’y a pas encore assez d’œufs, laissez la plaque TEL à 25 degrés Celsius pendant un total de 24 heures. Vérifier périodiquement s’il y a des œufs. Lorsque suffisamment d’œufs ont été pondus, retirez les adultes de la plaque TEL.

Une expérience typique sur la durée de vie nécessitera entre 30 et 90 œufs par groupe expérimental, mais plusieurs centaines d’œufs peuvent être générés sur une seule plaque TEL. Environ 150 œufs seront pondus par 10 à 15 adultes actifs en reproduction en six à huit heures. En comparant les groupes expérimentaux, une signification statistique peut être obtenue pour de grandes différences d’espérance de vie avec aussi peu que 30 animaux.

Plus d’animaux devraient être utilisés pour distinguer des différences plus modestes. Placez maintenant la plaque TEL sans adultes à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les œufs éclosent et que les vers aient atteint le stade larvaire L quatre. Cela prend généralement deux jours pour obtenir une élégance de type C sauvage, mais peut prendre plus de temps pour les souches à phénotypes de développement lent.

Cette section décrit comment suivre la vie d’une population synchronisée selon les âges. D’abord, transférez la larve L 4 de la plaque TEL vers des plaques AMP FUDR assises. Pour chaque souche ou condition testée, il est courant de poser deux à trois plaques avec 25 à 30 vers par plaque.

Incubez les plaques AMP FUDR à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Puis évaluer visuellement les vers, le milieu et les bactéries transfèrent les vers vers des plaques AMP FUDR fraîches. Si les vers ont mangé la majeure partie de la nourriture bactérienne, cela se produit généralement une ou deux fois par semaine.

Au début de l’expérience, si un nombre significatif de larves est présente, cela indique généralement que les vers ont été transférés sur les plaques AMP FUDR à l’âge adulte et non sous forme de L quatre. Les jeunes adultes peuvent pondre des œufs avant que la FUDR ne fasse effet, et parfois les larves échappent aux effets de la FUDR et deviennent adultes. Ces larves vont perturber l’expérience dans cette situation, transférer les vers adultes sur des plaques fraîches et jeter les anciennes plaques contenant les larves.

Les vers doivent également être transférés sur des plaques fraîches si des bactéries vivantes en croissance sont observées. En général, la combinaison de l’AMP et de la destruction UV garantit qu’aucune bactérie vivante ne contamine l’expérience, mais cela se produit occasionnellement. Transférez aussi les vers.

Si une croissance fongique est observée sur le milieu. Si le champignon est détecté assez tôt, il peut être éliminé à l’aide d’une pointe de pipette ou d’une spatule. Une fois qu’il atteint un diamètre supérieur à quelques millimètres, il est généralement plus facile de transférer les vers vers sur une nouvelle plaque.

Évaluez tous les vers pour leur durée de vie tous les deux à trois jours. Utiliser une lunette de dissection. Déterminez si chaque ver est vivant ou mort.

Tapotez doucement l’assiette. Le ver est vivant s’il se déplace en réponse au tapotement. Si le ver ne répond pas au tapotement de la plaque, zoomez sur la région de la tête, tapotez doucement la tête du ver avec un médiator de transfert platine.

Considérez le ver comme mort. S’il ne réagit pas en bougeant sa tête, retirez le ver mort de la plaque. Après avoir vérifié tous les vers, notez la date et le nombre de vers vivants et morts.

Les vers maintenus sur un milieu solide s’échappent parfois de la surface de la plaque en creusant ou en grimpant le long du mur. Les vers qui fuient sont complètement omis de l’étude. Une fois terminé, remettez les assiettes dans l’incubateur à 20 degrés Celsius.

Attendre encore deux à trois jours puis vérifier à nouveau les plaques. Continuez ce régime jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Le nombre de vers qui meurent chaque jour est généralement inversé pour calculer la proportion de vers vivants chaque jour, ces données étant graphiquement tracées sous forme de courbe de survie en tenant compte du jour de la ponte chronométrée.

Jour zéro. La durée de vie médiane typique pour N deux. La souche sauvage d’elgan de mer maintenue sur des bactéries tueuses UV à 20 degrés Celsius dure environ 25 jours à partir de l’œuf.

Nous venons de vous montrer comment mesurer l’espérance de vie et voir l’élégance. Vous pouvez modifier cette procédure de base pour tester diverses conditions environnementales, notamment la restriction alimentaire et l’interférence de l’ARN, ce qui est abordé dans le texte de soutien. Voilà.

Merci de m’avoir regardé et bonne chance pour votre expérience.