Name: Mesure Caenorhabditis elegans sur des milieux solides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Apprenez à mesurer la durée de vie de Caenorhabditis elegans sur milieu solide avec bactéries tuées aux UV. Cette méthode synchronisée permet d'étudier le vieillissement chez ce modèle biologique.

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Ce travail a été soutenu par une Percées Glenn / Afar en gérontologie et le Prix des subventions du NIH 1R01AG031108-01 à MKGS est soutenu par le NIH bourse de formation P30AG013280. MK est une Ellison Medical Foundation New Scholar liés au vieillissement.

Partie 1: Préparer la croissance des médias nématodes (NGM) plaques Cette section décrit la préparation des plaques NGM solide pour une utilisation dans l'expérience la durée de vie. Une expérience de vie de base durée nécessite deux types de plaques: les plaques NGM standard, qui ne contiennent pas d'additifs, et Amp / FUDR plaques, qui ont à la fois à l'ampicilline (Amp) et fluorodésoxyuridine (FUDR) ajouté à l'assemblée générale nationale. L'ampicilline est utilisée pour prévenir la contamination bactérienne étrangers. FUDR inhibe la division cellulaire, réduit la production d'œufs, et empêche les oeufs d'éclore. L'utilisation de FUDR pour l'analyse de longévité n'affecte pas la durée de vie adulte et élimine la nécessité de transférer les vers tous les quelques jours afin de les séparer de la larve en croissance. Les deux types de plaques sont ensemencés avec E. coli OP50 bactéries, qui est ensuite tué par l'exposition aux UV. <ol><li> Préparer NGM (voir section 5 pour la recette et les notes de stockage) et des boîtes de Pétri étiquette. Vous aurez besoin d'une plaque de Pétri de 60 mm par 10 mL d'NGM. Si vous commencez avec le NGM solide préalablement préparées, passez à l'étape 1.2. Si vous commencez avec le NGM fraîchement autoclavés, passez à l'étape 1.4. </li><li> Fondre complètement NGM solide en micro-ondes sur le haut dans 30 secondes impulsions. Swirl média entre les impulsions pour éviter les bulles de gaz sous pression de s'accumuler. </li><li> NGM Placez liquide dans 55 ° C ou bain d'eau sur le banc pour refroidir. </li><li> Une fois atteint NGM 55 ° C ajouter 33 ul de 150 mM FUDR et 100 pi de 100 mg / ml d'ampicilline par 100 mL NGM (pour Amp / FUDR plaques) et agiter pour mélanger. Pour les plaques NGM sans médicaments supplémentaires procéder directement à l'étape 1.5. </li><li> En utilisant une technique stérile, une pipette 10 ml NGM dans chaque assiette de 60 mm de Pétri. Eviter la formation de bulles si possible. Si des bulles se forment, ils peuvent être sauté à l'aide d'une pipette. </li><li> Laisser les plaques sur le banc avec des couvercles sur NGM pour permettre de solidifier et sécher. Si possible, laissez les plaques sur le banc pour 2 jours avant d'ajouter les bactéries, mais un jour ne fonctionnera que si les plaques sont nécessaires plus tôt. </li><li> Le jour avant que les plaques terminer le séchage, la culture LB semences liquide avec une seule colonie d'une strie frais de E. coli OP50 bactéries sur une gélose LB. Vous devez préparer au moins 1 mL d'une nuit OP50 culture par 60 plaques mm. </li><li> Placer OP50 culture à 37 ° C shaker et permettent aux bactéries de croître durant la nuit (la culture doit atteindre la saturation). </li><li> Pellet OP50 bactéries par centrifugation à 3500 g pendant 10 minutes. </li><li> Retirer 90% des bactéries surnageant et remettre à concentrer la culture 10x. </li><li> Pipeter 100 uL de 10x concentrée OP50 la culture dans le centre des assiettes NGM solidifié. Agiter doucement les plaques pour étaler la culture de bactéries, si nécessaire (idéalement bactéries devraient couvrir la zone centrale de la NGM sans venir près des murs plaque). Essayez d'éviter de toucher la pointe de la pipette sur la surface de l'assemblée générale nationale, comme des défauts dans la surface du média permettent les vers s'enfouissent dans le NGM. </li><li> Laisser les plaques sur le banc durant la nuit pour permettre la culture des bactéries à sécher sur la NGM solides (prend environ 24 heures). </li><li> Une fois sec, exposer la surface des plaques à une dose d'UV suffisante pour arrêter la croissance de la bactérie. Si vous utilisez un Stratalinker UV Stratagene 2400: <ul><li> Plaques place dans le Stratalinker et enlever les couvercles </li><li> Fermez la porte et tournez sur la Stratalinker </li><li> Appuyez sur «l'énergie» </li><li> Entrez '9999 'aide du clavier </li><li> Appuyez sur 'Démarrer' </li><li> Les plaques seront exposées aux UV pendant environ 5 minutes </li></ul></li><li> Plaques avec des bactéries tuées UV peuvent être stockés à l'envers à 4 ° C pour un maximum de 1 mois. </li></ol> Partie 2: Effectuer un oeuf chronométré prévoyant d'acquérir un âge synchronisé population d'animaux Dans cette section, nous générons une population de vers de terre avec une trappe à jour commun. Ceci est accompli en permettant aux adultes reproducteurs actifs pour pondre leurs œufs sur un plateau pour une période de temps définie et permettant ces oeufs à se développer. <ol><li> (Facultatif) Le transfert d'environ 20 vers adultes jeunes à une plaque de NGM frais sans FUDR. Laisser les plaques à 25 ° C afin de permettre à des vers pour se propager et à manger dans toute la nourriture bactérienne. Après la nourriture bactérienne a été consommé vers nouvellement éclos entrera dans le stade de croissance arrêtée Dauer. Vous allez commencer à voir la larve dauer autour d'ici une semaine, selon le nombre de vers de vous transférer à la plaque de départ. Dauer larve peut être utilisé pour les prochaines étapes pour un maximum de 1 mois. </li><li> (Facultatif) larve dauer transfert 20 à 30 à une plaque NGM frais sans FUDR. En présence de nourriture dauer larves deviendront des adultes reproducteurs actifs dans les 2 jours et restent reproducteurs actifs pendant quelques jours puis à 25 ° C. </li><li> Transfert de 10 à 15 adultes reproducteurs actifs à une plaque de NGM frais sans FUDR. Cette plaque est appelée la ponte chronométrés (TEL) la plaque. </li><li> Laisser la plaque TEL à 25 ° C pendant 6 heures afin de permettre à til temps de vers de terre pour pondre leurs œufs. </li><li> Retirer de la plaque vers adultes TEL. Plaque peut être inspecté visuellement pour les oeufs avant de retirer les adultes. Si les vers n'ont pas mis un nombre suffisant d'oeufs de la plaque TEL peut être laissé à 25 ° C jusqu'à un total de 24 heures avant d'enlever les vers adultes. </li><li> Placer la plaque TEL à 20 ° C jusqu'à ce que les oeufs ont éclos et les vers ont développé jusqu'au stade L4 larvaire (ce qui prend généralement deux jours pour les sauvages de type C. elegans, mais peut prendre plus de temps pour les souches de phénotypes de développement lent). </li></ol> Partie 3: Les animaux score pour la durée de vie Dans cette section, nous suivons l'âge synchronisée de la population de vers de la partie 2 jusqu'à ce qu'ils meurent. Worms sont maintenus sur Amp / FUDR plaques pour empêcher la production d'œufs et de la contamination bactérienne et sont considérés comme morts quand ils échouent à répondre aux stimuli externes. <ol><li> Transfert L4 larve à ensemencé Amp / FUDR plaques. Pour chaque souche ou la condition d'être testé, il est typique de mettre en place les plaques 2-3 avec 25-30 vers par assiette. Images du C. étapes de la vie elegans sont fournis à titre de référence (figure 1) 1. </li><li> Placez Amp / FUDR plaques à 20 ° C pendant 24 heures. </li><li> Après 24 heures, évaluer visuellement les vers, les médias, et les bactéries. Transfert vers de nouvelles Amp / FUDR plaques si l'un des suivants est observé: <ul><li> Worms ont mangé la plupart de la nourriture bactérienne. Tôt dans la vie des vers de l'expérience durée devront être transférés 1 à 2 fois par semaine pour empêcher les bactéries d'être épuisées. </li><li> Un nombre important de larves sont présentes. C'est habituellement un signe que les vers ont été transférés aux plaques Amp / FUDR que les jeunes adultes au lieu d'L4S et ont pu poser quelques oeufs avant la FUDR a pris effet. Le FUDR sera généralement d'éviter les larves de devenir des adultes pleinement, mais parfois un peu de devenir des adultes et de se confondre avec les animaux de laboratoire. </li><li> Des bactéries vivantes / de croissance sont observés. Généralement, la combinaison de l'AMP et UV-tuant s'assurera qu'aucun des bactéries vivantes contaminent l'expérience, mais parfois il se produit. </li><li> La croissance des champignons est observée sur les médias. Si dépisté assez tôt, la croissance des champignons peuvent généralement être coupés à l'aide d'une pipette ou une spatule. Une fois qu'il pousse à être plus grand que quelques millimètres de diamètre, il est généralement plus facile de transférer les vers de terre pour une nouvelle plaque. </li><li> Utilisation du champ de dissection, de déterminer si chaque ver est vivant ou mort. </li><li> Tapoter doucement la plaque. Le ver est vivante si elle se déplace en réponse à la mise sur écoute. </li><li> Si le ver ne répond pas à exploiter la plaque, un zoom sur la tête de la région. </li><li> Tapoter doucement la tête de la vis sans fin avec le transfert de ramasser platine. Score le ver comme mort si elle ne répond pas en déplaçant sa tête. </li><li> Vers morts peut être retiré de la plaque. </li></ul></li><li> Notez la date et le nombre de vers qui sont vivants et morts. </li><li> Retour des plaques à 20 ° C. </li><li> Répétez les étapes 3.3 à 3.6 tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce que tous les vers sont morts. </li></ol> Partie 4: résultats représentatifs. Les données brutes produites par une expérience de durée de vie des nématodes est une liste de dates avec chiffres correspondants de vers qui sont vivants et morts pour chaque souche testée. Le nombre de vers qui meurent chaque jour est généralement inversé pour calculer la proportion de vers vivants chaque jour (figure 2A), qui est tracée graphiquement comme une courbe de survie (figure 2B, le jour de la ponte chronométré est considéré comme jour 0 ). La durée de vie de chaque individu dans le ver de l'étude peut être calculée à partir du nombre de vers qui meurent chaque jour et utilisées pour calculer la durée de vie moyenne et la médiane pour la comparaison entre les souches. Le comptage du nombre de vers vivants chaque jour n'est pas utilisé directement dans l'analyse de la durée de vie. Worms maintenu sur un support solide sera l'occasion «fuir», ou ramper soit sur le mur de la plaque ou vers le bas sous le support. Le nombre de vers vivants chaque jour peut être utilisée pour déterminer combien les vers fui pendant toute la durée de l'expérience. Worms qui fuient sont généralement retirés de l'analyse. Comme point de repère, la durée de vie typique médiane de N2, le C. elegans souche de type sauvage, maintenue sur le rayonnement UV-tué les bactéries à 20 ° C est d'environ 25 jours, mesurée à partir d'oeufs. Partie 5: Solutions <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Croissance nématode médias (NGM), 100 ml: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combiner: </td></tr><tr><td> 0,3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,25 g </td><td> Peptone </td></tr><tr><td> 2 g </td><td> Agar </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave pendant 40 minutes et laisser refroidir à 55 ° C, puis ajouter: </td></tr><tr><td> 100 uL </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 100 uL </td><td> 5 mg / ml de cholestérol </td></tr><tr><td> 100 uL </td><td> 1 M de CaCl2 </td></tr><tr><td> 1,625 ml </td><td> 1,5 M pH 6,0 KPi </td></tr><tr><td colspan="2"> NGM liquide peut être utilisé immédiatement pour verser des plaques ou des permis de solidifier et stockées à long terme à la température ambiante </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> Bactotryptone </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Extrait de levure </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> Tris 1 M pH 8,0 </td></tr><tr><td> 1 L </td><td> l'eau déminéralisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et conserver à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4, 300 ml: </td></tr><tr><td> 73,95 g </td><td> MgSO 4 </td></tr><tr><td> 300 ml </td><td> l'eau déminéralisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et conserver à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 5 mg / ml de cholestérol, 200 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> le cholestérol </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> 100% d'éthanol </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtre stériliser et stocker à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M de CaCl 2, 500 ml: </td></tr><tr><td> 27,75 g </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 500 ml </td><td> l'eau déminéralisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtre stériliser et stocker à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1,5 M pH 6,0 KPi, 1L: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combiner: </td></tr><tr><td> 31,4 g </td><td> KPi dibasique </td></tr><tr><td> 179,6 g </td><td> KPi monobasique </td></tr><tr><td> 850 ml </td><td> l'eau déminéralisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Chauffer tout en mélangeant afin de permettre KPi de dissoudre dans la solution. Ajuster le pH à 6,0 avec NaOH 10 N. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l'eau déminéralisée à 1 L. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave et conserver à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Tris 1 M, pH 8,0: </td></tr><tr><td> 60,57 g </td><td> Tris </td></tr><tr><td> 400 ml </td><td> l'eau déminéralisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajuster le pH à 8,0 avec HCl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajouter de l'eau déminéralisée à 500 mL. </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtre stériliser et stocker à température ambiante. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150 mM fluorodésoxyuridine (FUDR), 10 ml: </td></tr><tr><td> 0,3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> l'eau stérile déionisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 mg / ml d'ampicilline (Amp), 10 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> Ampicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> l'eau stérile déionisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 mg / ml de carbénicilline (Carb), 10 ml: </td></tr><tr><td> 500 mg </td><td> Carbénicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> l'eau stérile déionisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M isopropylique β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml: </td></tr><tr><td> 2,38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> l'eau stérile déionisée </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à -20 ° C. </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="Figure 1"> Images Figure 1. Fond clair de C. étapes de la vie elegans, y compris les œufs, les quatre stades larvaires (L1 - L4), et l'adulte. Tous les panneaux montrent les hermaphrodites, sauf le coin inférieur droit, qui montre un mâle adulte (Image tirée du bois (1988)). <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="Figure 2"> Les résultats représentatifs Figure 2. À partir d'un C. expérimentation elegans durée de vie comparant sauvages N2 souche de type à une souche contenant une mutation dans le gène daf-2. (A) Un tableau présentant les données recueillies, y compris nombre de jours depuis les vers étaient des œufs, du nombre de vers morts observées chaque jour, et le pourcentage de l'échantillon initial restant en vie à chaque jour (tel que calculé à partir des chiffres quotidiens de vers morts) . (B) courbes de survie correspondant à la durée de vie des données fournies dans (A). <imgsrc files alt='"Figure'></imgsrc> Figure 3. Comparaison Représentant de lipofuscine entre les adultes jeunes et vieux C. elegans. Images en champ clair apparaissent sur les images gauche et canal de fluorescence DAPI sur la droite. Panneaux du haut montrent un ver de 4 jours et les panneaux du bas montrent un ver 11 jours anciens (tel que mesuré à partir d'œufs).

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</ol>

Le contrôle génétique de la longévité a été largement étudié en C. elegans, largement dû à la facilité et la rapidité avec laquelle la durée de vie peut être déterminée. Le protocole abordées dans cet article décrit un cadre de base pour obtenir des données reproductibles durée de vie en C. elegans et peut également être appliquée à des espèces relatednematode. 2 En faisant quelques simples modifications de ces procédures peuvent être adaptés pour mesurer la durée de vie sous une variété de ...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Réactif</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbénicilline</td><td>Réactif</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodésoxyuridine (FUDR)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Réactif</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure caenorhabditis elegans</emdurée de vie> sur des milieux solides

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Le vieillissement est un processus dégénératif caractérisé par une détérioration progressive des composants cellulaires et des organites résultant de la mortalité. Le nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; A émergé comme un modèle principal utilisé pour étudier la biologie du vieillissement. Parce que pratiquement tous les sous-systèmes biologiques subit un déclin fonctionnel avec l&#39;âge, la durée de vie est le critère principal d&#39;intérêt lorsque l&#39;on considère le taux total de vieillissement. Dans les nématodes, la durée de vie est généralement défini comme le nombre de jours d&#39;un animal reste sensible aux stimuli extérieurs. Les nématodes peuvent être propagés soit dans des milieux liquides ou sur des supports solides en plaques, et les techniques ont été développées pour mesurer la durée de vie dans les deux conditions. Nous présentons ici un protocole généralisé pour mesurer la durée de vie des nématodes maintenue sur milieu solide croissance des nématodes et nourris avec un régime d&#39;UV-tué les bactéries. Ces procédures peuvent être facilement adaptés à la durée de vie de dosage dans différentes conditions communes, y compris un régime alimentaire composé de bactéries vivantes, des restrictions alimentaires, et l&#39;interférence ARN.

Dans cet article nous présentons un protocole général pour la mesure de la durée de vie des nématodes maintenu sur un support solide avec UV-tué alimentaire bactérienne.

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

Le vieillissement est un processus dégénératif caractérisé par une détérioration progressive des composants et des organites cellulaires entraînant la mortalité. Le nématode...

Afin de mesurer la durée de vie chez C. elegans, une population âgée synchronisée est générée par ponte contrôlée dans le temps. Des vers hermaphrodites adultes actifs sont transférés sur des boîtes de milieu de croissance pour nématodes ensemencées avec des E. coli inactivés par UV, laissés pour pondre des œufs pendant six à huit heures, puis retirés. Au cours des deux jours suivants, les vers éclosent de ces œufs et se développent jusqu'au stade larvaire L4. Les vers au stade L4 sont transférés sur de nouvelles boîtes de milieu NGM contenant de l'ampicilline afin d'éviter toute contamination bactérienne vivante, ainsi que du FUDR pour empêcher la reproduction, et sont laissés se développer en adultes.À partir de ce moment, les vers adultes sont observés tous les deux ou trois jours jusqu'à ce que tous les vers soient morts. À chaque point temporel, les vers morts sont retirés de la boîte et le nombre de vers vivants et morts est enregistré. Je suis George Seton du laboratoire de Matt Capline du Département d'anatomie pathologique de l'Université de Washington.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment mesurer la durée de vie et observer notre élégance en matière d'hépatite. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la génétique du vieillissement. Commençons donc.Une expérience de base sur la durée de vie nécessite deux types de boîtes, les boîtes NGM standard, qui ne contiennent aucun additif, et les boîtes AMP FUDR, auxquelles on a ajouté de l'ampicilline et de la fluorodésoxyuridine au NGM. Les deux types de boîtes sont ensemencés avec des bactéries e coli OP 50, qui sont ensuite inactivées par exposition aux rayons UV. Commencez par préparer 10 millilitres de solution NGM.Pour chaque boîte de Pétri de 60 millimètres, faire fondre complètement le milieu NGM solide au four à micro-ondes à puissance maximale en impulsions de 32 secondes. Agiter doucement le milieu entre chaque impulsion afin d'éviter l'accumulation de bulles de gaz sous pression, puis placer le milieu liquide dans un bain-marie à 55 degrés Celsius ou sur la paillasse pour permettre son refroidissement. Une fois que le milieu a refroidi à 55 degrés Celsius, température à laquelle vous devez pouvoir tenir le récipient en verre à main nue sans gêne, il est prêt à recevoir les médicaments.Et pour couler les boîtes destinées aux boîtes contenant des médicaments, ajouter 33 microlitres de FUDR à 150 millimolaire et 100 microlitres d'ampicilline à 100 milligrammes par millilitre par 100 millilitres de NGM, puis agiter doucement pour homogénéiser. L'ampicilline est utilisée pour prévenir la contamination bactérienne étrangère et le FUDR pour empêcher les œufs de éclore, de sorte que les vers n'auront pas besoin d'être transférés tous les quelques jours afin de les séparer des larves en croissance.Versez maintenant le milieu et laissez les boîtes sécher sur la paillasse pendant deux jours. La veille de la fin du séchage des boîtes, préparez une culture liquide en milieu LB à partir d'une colonie isolée provenant d'un isolement récent d'Escherichia coli OP50 sur gélose LB. Préparez au moins 0,5 millilitre de culture par boîte de 60 millimètres.Placer la culture OP 50 dans un agitateur à 37 degrés Celsius et laisser les bactéries croître toute la nuit. Le jour suivant, former un culot des bactéries OP 50 par centrifugation à 3 500 g pendant 10 minutes. Jeter suffisamment de surnageant pour resuspendre les bactéries à une concentration 10 x.Ensuite, inoculez chaque plaque avec 100 microlitres de la culture concentrée. Évitez de toucher la surface de l'NGM avec la pointe de la pipette, car les imperfections de la surface du milieu permettraient aux vers de s'enfouir. Tournez les plaques en vortex jusqu'à ce que les bactéries recouvrent la zone centrale de l'NGM sans s'approcher des parois de la plaque, puis laissez les plaques sécher sur la paillasse pendant 24 heures. Une fois sèches, exposez la surface des plaques à une dose de rayons UV suffisamment élevée pour arrêter la croissance bactérienne ; nous utilisons un appareil Strata Gene UV Straddle Linker 2, 400.Commencez par charger les plaques dans le lien latéral sans leurs couvercles. Appuyez maintenant sur énergie. Saisissez 9 9 9 9 sur le clavier numérique et appuyez sur démarrer.Les plaques seront exposées aux UV pendant environ cinq minutes. Les plaques contenant des bactéries tuées par les UV peuvent être conservées à l’envers à quatre degrés Celsius pendant jusqu’à un mois. Cette section décrit comment générer une population de vers ayant une date d’éclosion commune.Commencez par transférer environ 20 vers adultes jeunes sur une plaque NGM fraîche sans médicament. Laissez la plaque à 25 degrés Celsius pendant environ une semaine afin de permettre aux vers de se multiplier et de consommer toute la nourriture bactérienne en une semaine. Des vers nouvellement éclos, bloqués en croissance au stade dauer, devraient apparaître ; transférez alors 20 à 30 larves dauer sur une plaque NGM fraîche sans médicament et incubez-les à 25 degrés Celsius en présence de nourriture.Les larves dauer deviendront des adultes reproductifs en deux jours et resteront reproductivement actifs pendant quelques jours supplémentaires. Transférez maintenant 10 à 15 adultes reproductifs sur une plaque NGM fraîche sans drogue. Cette plaque est appelée plaque de ponte synchronisée ou plaque TEL.Laisser la boîte TEL à 25 degrés Celsius afin que les vers puissent pondre des œufs. Les animaux éclos de ces œufs seront les animaux expérimentaux et leur durée de vie sera évaluée après six heures. Examiner la boîte TEL à la recherche d'œufs.S'il n'y a pas encore suffisamment d'œufs, laisser la boîte TEL à 25 degrés Celsius pendant un maximum de 24 heures au total. Vérifier périodiquement la présence d'œufs. Lorsqu'un nombre suffisant d'œufs a été pondu, retirer les adultes de la boîte TEL.Une expérience typique d’espérance de vie nécessite de 30 à 90 œufs par groupe expérimental, mais plusieurs centaines d’œufs peuvent être produits sur une seule plaque TEL. Environ 150 œufs sont pondus par 10 à 15 adultes reproducteurs actifs en six à huit heures. Lors de la comparaison de groupes expérimentaux, une signification statistique peut être obtenue pour de grandes différences d’espérance de vie avec seulement 30 animaux.Un plus grand nombre d'animaux devrait être utilisé pour distinguer des différences plus subtiles. Placez maintenant la boîte TEL sans adultes à 20 degrés Celsius jusqu'à ce que les œufs éclosent et que les vers aient atteint le stade larvaire L4. Cela prend généralement deux jours pour le type sauvage C. elegans, mais peut prendre plus de temps pour les souches présentant des phénotypes de développement lent.Cette section décrit comment suivre le cycle vital d'une population synchronisée par âge. Transférez d'abord les larves L4 de la boîte TEL vers des boîtes AMP FUDR disposées à plat. Pour chaque souche ou condition testée, il est habituel de préparer deux à trois boîtes avec 25 à 30 vers par boîte.Incuber les boîtes de gélose AMP FUDR à 20 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, examiner visuellement les vers, le milieu et les bactéries, puis transférer les vers sur des boîtes de gélose AMP FUDR fraîches. Si les vers ont consommé la majeure partie de la nourriture bactérienne, cela se produit généralement une à deux fois par semaine.Au début de l'expérience, si un nombre important de larves est présent, cela indique généralement que les vers ont été transférés sur les plaques AMP FUDR au stade adulte jeune plutôt qu'au stade L4. Les adultes jeunes peuvent pondre des œufs avant que le FUDR n'agisse, et occasionnellement, certaines larves échappent aux effets du FUDR et se développent en adultes. Ces larves faussent l'expérience dans cette situation ; transférez les vers adultes sur des plaques fraîches et jetez les anciennes plaques contenant les larves.Les vers doivent également être transférés sur des boîtes fraîches s'il y a présence de bactéries vivantes en croissance. Généralement, la combinaison de l'AMP et de l'irradiation UV garantit qu'aucune bactérie vivante ne contamine l'expérience, mais cela peut parfois se produire. Transférez également les vers.Si une croissance fongique est observée sur le milieu. Si elle est détectée suffisamment tôt, la moisissure peut être retirée à l’aide d’une pipette ou d’une spatule. Une fois qu’elle atteint une taille supérieure à quelques millimètres de diamètre, il est généralement plus facile de transférer les vers vers une nouvelle boîte.Évaluez la durée de vie de tous les vers tous les deux ou trois jours. À l’aide d’un microscope stéréoscopique, déterminez si chaque ver est vivant ou mort.Tapotez doucement la boîte. Le ver est vivant s'il bouge en réponse aux tapotements. Si le ver ne réagit pas au tapotement de la boîte, zoomez sur la région de la tête et tapez doucement sur la tête du ver avec un curet en platine.Noter le ver comme mort. S'il ne réagit pas en bougeant la tête, retirer le ver mort de la boîte. Après avoir vérifié tous les vers, enregistrer la date ainsi que le nombre de vers vivants et morts.Les vers maintenus sur milieu solide échappent parfois de la surface de la boîte en creusant ou en grimpant le long de la paroi. Les vers en fuite sont totalement exclus de l'étude. Une fois terminé, remettez les boîtes dans l'incubateur à 20 degrés Celsius.Attendez encore deux à trois jours, puis vérifiez à nouveau les boîtes. Poursuivez ce protocole jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Le nombre de vers décédés chaque jour est généralement inversé pour calculer la proportion de vers vivants chaque jour ; ces données sont ensuite représentées graphiquement sous forme de courbe de survie, en tenant compte du jour de la ponte programmée.Jour zéro. La durée de vie médiane typique pour N deux. La souche sauvage de Sea elgan maintenue sur des bactéries inactivées par UV à 20 degrés Celsius est d'environ 25 jours, mesurée à partir de l'œuf.Nous venons de vous montrer comment mesurer la durée de vie et observer l'élégance. Vous pouvez modifier cette procédure de base pour tester une variété de conditions environnementales, notamment la restriction alimentaire et l'interférence ARN, qui est abordée dans le texte complémentaire. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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