Name: Homarus americanus Stomatogastric dissection du système nerveux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Découvrez la dissection fine du système nerveux stomatogastrique chez Homarus americanus. Cette méthode permet d'isoler les ganglions et nerfs pour étudier les fonctions neuronales dans les circuits rythmiques.

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Nous tenons à remercier notre conseiller, la Dre Eve Marder. Cette recherche a été soutenue par l&#39;Institut national de bourses en santé NS17813 à Eve Marder et NS059255 à AE T.

Avant de commencer ce protocole de l&#39;estomac du homard doit être retiré de l&#39;animal et préparé comme décrit dans l&#39;article compagnon Jove (Bierman &amp; Tobin, 2009). La majorité des étapes décrites ci-dessous doivent être effectuées sous un microscope de dissection. Partie I-Isoler les ganglions commissurales <ol><li> Orienter l&#39;antenne afin que l&#39;extrémité antérieure (par la lèvre) est loin de vous et l&#39;extrémité postérieure (par le pylore) est vers vous. </li><li> Assurez-vous que l&#39;estomac est tombé de sorte qu&#39;elle repose aussi plat que possible sur le plat. <ol><li> Pin dans l&#39;œsophage, de chaque côté de la lèvre. </li><li> Si nécessaire, réorganiser les autres broches placées lors de la dissection brut. </li></ol></li><li> Retirez l&#39;hypoderme. <ol><li> Prenez l&#39;hypoderme près de la gm2/gm3 muscles, il se détacher de ces muscles et tirez doucement dans la direction antérieure. </li><li> Séparée de l&#39;hypoderme de la graisse sous-jacente en coupant les connexions. Utilisation accrue de soins autour de l&#39;artère centrale, qui renferme un élément clé du système stomatogastric nerveux. Laisser l&#39;hypoderme intacte dans un rayon de 0,5 cm du ganglion stomatogastric, qui se trouve entre les muscles gm1b. </li><li> Coupez hypoderme séparés. </li></ol></li><li> Détachez le cerveau à partir des tissus sous-jacents. <ol><li> Identifier les deux grands nerfs commissuraux ce projet bilatéral de la partie antérieure du cerveau vers les ganglions commissuraux dans la partie antérieure de l&#39;estomac. </li><li> Laissant ces nerfs intacts, soulevez doucement le cerveau avec une pince et couper pour séparer le cerveau du reste du tissu. Soyez prudent car vous faites cela, comme le nerf stomatogastric est en dessous du cerveau et doit être conservée intacte. </li></ol></li><li> Séparez les ganglions commissuraux partir entourant le tissu. <ol><li> Suivez l&#39;un des nerfs commissuraux à l&#39;un des ganglions commissuraux. </li><li> Identifier les ions et fils - ces nerfs doivent rester intactes. Le ganglion commissural aura beaucoup de nerfs rayonnant. Couper plupart d&#39;entre eux (à l&#39;exception de l&#39;ion et fils), mais laissez un nerf supplémentaire attaché à maintenir le ganglion commissural en place pendant que vous finissez la dissection. </li><li> Répéter avec le ganglion d&#39;autres commissurales. </li></ol></li><li> Nettoyer l&#39;ion et son fils de dehors en dedans. Laisser le nerf vestibulaire intacte pour ancrer le système nerveux de l&#39;estomac. Le ganglion œsophagien siège étaient les ions s croisent. Vous pouvez effacer dessous en saisissant le nerf ventriculaire inférieur et tirant vers le haut pour couper en-dessous. </li></ol> Partie II-Isoler le ganglion Stomatogastric (STG) et les nerfs restants. <ol start="7"><li> Séparez les STG à partir entourant le tissu. <ol><li> Le STG est assis à l&#39;intérieur d&#39;une artère qui passe entre les muscles gm1b et jusqu&#39;à la gm2a, les muscles b. Cherchez l&#39;extrémité coupée de l&#39;artère près les muscles gm2a b,. </li><li> Tirez l&#39;extrémité coupée de l&#39;artère et en avant, pour exposer le DVN. Continuez de tirer jusqu&#39;à ce que vous atteigniez le niveau de l&#39;hypoderme restant. Une fois séparés, l&#39;artère peut être coupé au niveau où il touche l&#39;hypoderme restant. </li><li> Coupez le lambeau musculaire qui était situé dans la tribune de la langouste. </li><li> Soulevez l&#39;hypoderme dessus de l&#39;artère, en observant que l&#39;artère fait un tunnel à l&#39;intérieur de la graisse au-dessus du STG. Mettez une lame de vos ciseaux intérieur de l&#39;artère et couper le muscle au-dessus. Vérifiez que vous pouvez voir les dvn que vous avez coupé pour être sûr que vous êtes en sécurité au-dessus du STG. Continuer la coupe antérieure, suite à l&#39;artère. Comme vous le cran au-dessus de la STG, vous serez capable de voir les STN émanant antérieure de la STG et le bas de plongée dans le muscle. Continuer la coupe antérieurement à séparer complètement les muscles au-dessus du STG. </li><li> Effacer tout tissu loin de la STN. </li></ol></li><li> Séparez les agn s du tissu environnant. (Même si vous ne prévoyez pas d&#39;enregistrer à partir de l&#39;AGN, vous aurez besoin d&#39;une portion du nerf intact pour épingler le ganglion pour des enregistrements intracellulaires.) <ol><li> Pour mieux voir le s agn, retirez l&#39;hypoderme restant et une fine couche de muscle sous-jacent. </li><li> Juste postérieure à la STG, d&#39;identifier un tunnel sombre dans la graisse et les muscles de chaque côté de la DVN. </li><li> Collez une lame de ciseaux à l&#39;intérieur du tunnel et couper le tissu au-dessus du nerf. Continuer de coupe latérale, suivant le nerf, de l&#39;isoler. (A quelques millimètres est suffisante pour épingler le ganglion, mais exposent au moins 5 mm de l&#39;AGN si vous envisagez d&#39;enregistrer à partir de lui.) </li><li> Détachez l&#39;AGN du muscle qu&#39;il innerve en coupant les connexions. </li><li> Répétez de l&#39;autre côté pour isoler l&#39;AGN autres. </li><li> Une fois les deux s agn ont été disséqués, couper tous les muscles et les tissus reliant les STG à l&#39;estomac. </li></ol></li><li> Isoler l&#39;art mvn Ils sont une paire bilatérale de petits nerfs qui bifurque de la LVN et traversant latéralement au-dessous de la graisse. <ol><li> Soit utiliser des ciseaux ou deux pinces pour couper à travers la graisse sur un côté de la DVN, près du lieu où elle se ramifie dans le s. Deux lvn Ici, vous êtes loin de la s mvn et ne seront pas de risque de les couper. </li><li> Soulevez la couche de graisse, et d&#39;identifier les sous mvn petits. Ces nerfs courir latéralement en dedans juste derrière au niveau des muscles gm1b. </li><li> Retirer la couche de graisse au-dessus du mvn, laissant le nerf intact pour aujourd&#39;hui afin de ne pas s&#39;emmêler. Vous aurez réduire ses extrémité latérale de dessus l&#39;estomac à la fin de la dissection. </li><li> Répétez le processus de l&#39;autre côté pour isoler les mvn autres. </li></ol></li><li> Isoler le s LVN et les nerfs postérieurs. <ol><li> À partir là où la succursale de la LVN s latéralement hors de la DVN, suivre un LVN en coupant le gras dessus. Selon la préparation, parfois toute la couche grasse au-dessus du nerf peut être retiré. </li><li> Continuer révélant les LVN jusqu&#39;au point où les branches hors PSN. </li></ol></li><li> Isoler le PYN. <ol><li> Localisez le PYN, il est un nerf voyageant arrière sur le pylore. </li><li> Retirer la fine membrane qui couvre cette région. </li><li> Isoler le PYN en coupant une petite section du pylore, attaché à la PYN. </li><li> Soulevez doucement la section du pylore et couper le tissu de chaque côté de l&#39;PYN jusqu&#39;à atteindre la branche qui s&#39;attache à la PDN. </li></ol></li><li> Isoler le PDN. <ol><li> Localisez le PDN, il est un nerf voyageant en arrière du muscle dilatateur du pylore. </li><li> Coupez une petite section du muscle dilatateur du pylore, attaché à la PDN. </li><li> Soulevez doucement la section dilatateur pylorique muscle, coupé le tissu de chaque côté de la PDN jusqu&#39;à atteindre la branche qui s&#39;attache à la PYN. </li></ol></li><li> Isoler le lvn ventrale, qui connecte le PYN et PDN de la LVN. <ol><li> Au point où la branche de forme triangulaire et PYN pdn connecter au lvn ventrale, isoler toute petite section de nerf qui bifurque de la LVN ventrale, comme le vpln. Il sera utilisé comme une poignée pour tirer sur les LVN ventrale. </li><li> Soulevez la poignée et couper le tissu de chaque côté de l&#39;lvn ventrale, qui travaillent dans le sens antérieur jusqu&#39;à atteindre le point où les branches hors PSN. </li></ol></li><li> Répétez les étapes 10 - 13 à isoler les nerfs lvn et postérieure de l&#39;autre côté. </li><li> Détachez le système nerveux stomatogastric de l&#39;estomac. <ol><li> Pour bien détacher le lvn de l&#39;estomac, tirez sur le PSN et couper tous les tissus et les nerfs rattachés à la lvn et lvn ventrale, sauf pour les PDN et PYN. Répétez ce processus sur l&#39;autre côté. </li><li> Coupez l&#39;extrémité latérale de chaque mvn. Soulevez l&#39;extrémité latérale et couper toutes les pièces jointes étrangers entre le nerf et le tissu de l&#39;estomac sous-jacent. </li><li> A l&#39;extrémité antérieure, couper toutes les pièces jointes étrangers vers les ganglions commissuraux, et couper le nerf labiale sur chaque côté. </li><li> Visuellement le système de balayage du système nerveux stomatogastric à identifier, puis couper les pièces jointes supplémentaires pour le tissu estomac. </li><li> S&#39;accrocher à l&#39;extrémité antérieure des deux nerfs commissuraux, au-dessus des ganglions commissuraux, et le zeste du système nerveux stomatogastric hors de l&#39;estomac et le déplacer vers le côté du plat. Comme vous faites cela, couper toutes les pièces jointes restent à libérer le système nerveux. </li></ol></li><li> Préparer le plat Sylgard petits. <ol><li> Frotter certains tissus de l&#39;estomac à fond sur la surface de la Sylgard dans le petit plat. Cela diminuera l&#39;hydrophobie de la Sylgard, de sorte que salée va distribuer uniformément dans le plat. </li><li> Rincer et remplir le plat avec une solution saline réfrigérée Sylgard. </li></ol></li><li> Transférer le système nerveux pour le plat préparé par Sylgard saisissant les extrémités antérieures des deux nerfs commissuraux, en soulevant le système nerveux de la grand plat, et il pose dans le petit plat. </li><li> Epingler la STNS dans le petit plat en utilisant une combinaison de broches Minuten et plus mince broches réduit de fil de tungstène. <ol><li> Assurez-vous que la préparation est face dorsale en vérifiant que le nerf ventriculaire inférieure est dirigée vers l&#39;extérieur de la Sylgard. </li><li> Enlever le cerveau et les nerfs commissuraux broches. </li><li> Tirez doucement sur ​​le système nerveux serrés et plat en tirant chacun des s psn en arrière et latéralement, et les épingler le bas. </li><li> Retirer le muscle dilatateur de l&#39;pylore s PDN, et la broche à l&#39;art pdn </li><li> Retirez lesegment de pylorique de l&#39;PYN s, et une épinglette à l&#39;art PYN </li><li> Pin bas de nerfs qui restent isolés tels que les nerfs labiaux, le s mvn et AGN s. </li></ol></li><li> Desheath le STG. <ol><li> Assurer la STG est à plat contre le Sylgard et tendue par les latéraux s agn, la partie antérieure et la STN dvn postérieur. </li><li> Organiser l&#39;éclairage pour permettre la visualisation des axones dans le DVN. </li><li> En utilisant une épingle ou d&#39;aiguille de tungstène fine, faire un petit trou peu profond dans la gaine entourant les DVN, juste derrière le STG. </li><li> Retirez l&#39;aiguille à travers le DVN, dorsale de l&#39;axone, pour créer une déchirure horizontale dans la gaine des nerfs. </li><li> Prenez le rabat de la gaine nerveuse postérieure à la STG et tirez vers l&#39;avant pour enlever la gaine de la face dorsale du STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abréviations: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Stomatogastric du système nerveux </td></tr><tr><td> STG </td><td> Ganglionnaires Stomatogastric </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Ganglionnaires commissurales </td></tr><tr><td> STN </td><td> nerveuses stomatogastric </td></tr><tr><td> mvn </td><td> nerveuses du ventricule médial </td></tr><tr><td> ions </td><td> inférieure du nerf oesophagien </td></tr><tr><td> le fils </td><td> supérieure du nerf oesophagien </td></tr><tr><td> AGN </td><td> nerveuses antérieures gastriques </td></tr><tr><td> dvn </td><td> nerveuses du ventricule dorsale </td></tr><tr><td> LVN </td><td> nerveuses du ventricule latéral </td></tr><tr><td> psn </td><td> nerveuses estomac postérieure </td></tr><tr><td> vpln </td><td> nerveuse ventrale latérale postérieure </td></tr><tr><td> PYN </td><td> nerveuses du pylore </td></tr><tr><td> pdn </td><td> nerf dilatateur pylorique </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

L&#39;anatomie de l&#39;estomac homard et STNS a été bien décrit précédemment 5,6, et les variations de cette procédure de dissection ont été utilisés dans de nombreuses études. Nous vous recommandons de vous familiariser avec l&#39;anatomie de l&#39;estomac 5-7 et STNS 5,8 avant dissections début. Familiarité va diminuer le risque de dommages accidentels aux nerfs et les tissus. Pour maintenir la santé de la préparation, il est essentiel de maintenir la préparation à une température fraîche. Ceci est facilement réalisé par l&#39;échange des salines toutes les 30 minutes avec 4 ˚ C salée conservée dans un réfrigérateur. Lorsqu&#39;elle a été immergée dans une solution saline froide, la préparation isolée STNS est viable pendant de nombreuses heures. Enregistrements en gammarus Homarus connexes ont démontré stables activité rythmique de la STG à travers cinq jours in vitro, 9; robustesse similaire a été vu dans H. americanus (obs. pers.). D&#39;entrée de modulation de la STG des ganglions commissuraux est nécessaire pour préserver les schémas moteurs en cours. Par conséquent, pour maintenir une activité normale rythmiques ces ganglions et de l&#39;ion, le fils, et les nerfs STN doivent être conservées intactes. La dissection nous décrivons préserve les nerfs moteurs de plusieurs (contenant les axones des neurones moteurs): le s agn (contenant moulin gastrique (GM) axones), la commande mvn s (contenant gastrique latéral (LG) et inférieur cardiaque (IC) axones), le s PYN (contenant pylorique neurone (PY) axones), le s pdn (contenant Dilatateur pylorique (PD) axones), et le s lvn (contenant pylorique latéral (LP), gastrique Médial (MG), les axones GPL ainsi que ceux de GM, PD et PY). En disséquant supplémentaires (ou différentes) les nerfs, les autres moteurs axones des neurones peut être enregistré. Chaque type individuel de l&#39;axone des neurones moteurs peuvent être enregistrées individuellement par la dissection et l&#39;enregistrement du nerf innervant le muscle auquel ce type de projets neurone. Cette préparation peut être utilisée pour une variété d&#39;études ont porté sur la fonction du système nerveux. L&#39;activité des neurones peut être enregistrée en utilisant soit intracellulaire, les enregistrements d&#39;électrode forte du soma ou axones, ou par l&#39;enregistrement des impulsions électriques extracellulairement des nerfs. Beaucoup de canaux ioniques dans les neurones STG ont été partiellement cloné et ARNm peut être mesuré à partir de 10,11 tirée manuellement soma.

<table><tbody><tr><td>Fil fin en tungstène (diamètre de 0,001 po)</td><td>Outil</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Couper en morceaux de 1 à 2 mm pour les utiliser comme fines broches.</td></tr><tr><td>Pinces #5</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Broches Minuten</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort Moria (lames de 7 mm)</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Ce sont des modèles haut de gamme. Des ciseaux à ressort plus économiques sont disponibles chez le même fabricant.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (100 × 15 mm)</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Remplir de 2 à 4 mm de Sylgard 182.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Autre</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Support pour broches</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Facultatif. Le décapage peut être effectué uniquement avec des ciseaux et des pinces fines.</td></tr><tr><td>Pinces super fines #5SF</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles en tungstène</td><td>Outil</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Facultatif. Le décapage peut être effectué avec des ciseaux ou avec des broches découpées dans un fil fin en tungstène.</td></tr><tr><td>Loupe binoculaire de dissection</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastric dissection du système nerveux

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Dans le but de comprendre comment les systèmes nerveux produisent une activité et de répondre à l&#39;environnement, les neuroscientifiques se tourner vers des systèmes modèles qui présentent l&#39;activité d&#39;intérêt et sont accessibles et se prêtent à des méthodes expérimentales. Le système nerveux stomatogastric (STNS) du homard d&#39;Amérique (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;; Savons aussi été le homard de l&#39;Atlantique ou du Maine) a été établi comme un système modèle pour étudier le rythme générant des réseaux et des réseaux de la neuromodulation. Le STNS se compose de 3 ganglions antérieurs (2 ganglions commissuraux et un ganglion de l&#39;oesophage), contenant des neurones modulateurs ce projet au niveau central pour le ganglion stomatogastric (STG). Le STG contient environ 30 neurones qui comprennent deux réseaux motif central de production, les réseaux pylorique et gastrique qui sous-tendent les comportements alimentaires dans les crustacés<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Bien qu&#39;il soit possible d&#39;étudier ce système<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, Le STNS continue à produire ses activités rythmiques lorsqu&#39;ils sont isolés<i&gt; In vitro</i&gt;. L&#39;isolement physique de l&#39;STNS dans un plat permet d&#39;accéder facilement à l&#39;soma dans les ganglions des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires et les nerfs de la STNS pour les enregistrements extracellulaires. Isoler le STNS est un processus en deux parties. La première partie, la dissection de l&#39;estomac de l&#39;animal, est décrite dans un article accompagnant la vidéo<sup&gt; 4</sup&gt;. Dans cet article, vidéo, techniques de dissection fine sont utilisées pour isoler l&#39;STNS de l&#39;estomac. Cette procédure aboutit à une préparation du système nerveux qui est disponible pour les enregistrements électrophysiologiques.

Nous décrivons la dissection fine du système nerveux stomatogastric de l&#39;estomac du homard américain (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus americanus Stomatogastric dissection du système nerveux

Afin de comprendre comment les systèmes nerveux produisent de l'activité et répondent à l'environnement, les neuroscientifiques se tournent vers des systèmes modèles qui présentent le ...

La procédure d'isolement du système nerveux gastrique ST du homard peut être divisée en deux parties : la dissection macroscopique et la dissection fine. Cette vidéo couvre la dissection fine du système nerveux gastrique somatique à partir de l'estomac, incluant le ganglion stéatogastrique appelé STG et les ganglions commissuraux appelés COGs. Essentiellement, les nerfs et les ganglions doivent être séparés des tissus environnants, en commençant par l'isolement des CGs, suivi de l'isolement du StG. Le résultat de cette procédure est le système nerveux gastrique systématique épinglé dans une boîte, prêt à être utilisé pour diverses études centrées sur la fonction du système nerveux.Bonjour, je suis Annalise Tobin du laboratoire de la Dre Eve Martyr, du département de biologie de l'Université Brandeis. Bonjour, je suis Hillary Burman, également du laboratoire Martyr. Aujourd'hui, nous allons vous présenter un protocole permettant d'isoler le système nerveux gastrique somatique de l'estomac du homard Homarus americanus afin d'observer comment l'estomac a été retiré.Veuillez consulter notre protocole vidéo associé sur JoVE. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la fonction des neurones dans de petits circuits neurologiques produisant des comportements rythmiques. Commençons donc.Pour commencer, une préparation de l'estomac de homard est nécessaire afin de comprendre comment cela est réalisé. Consultez la vidéo accompagnante dans laquelle Beerman et Tobin orientent d'abord la préparation de manière à ce que l'extrémité interne, située près de la lèvre, soit dirigée vers l'arrière et l'extrémité postérieure vers vous. Cette étape du protocole débute par une fixation plus précise de la préparation.Épingler l'œsophage de chaque côté de la lèvre, et si nécessaire, réarranger les autres épingles placées lors de la dissection macroscopique afin que l'estomac repose à plat. Ensuite, retirer l'hypoderme en le saisissant d'abord près des muscles gm, deux GM trois, le détacher de ces muscles et le tirer doucement en direction antérieure. Séparer l'hypoderme de la graisse sous-jacente en coupant les connexions à l’aide d’une pince fine, en faisant attention autour de l'artère centrale, qui entoure une partie du système nerveux gastrique somatique, tout en laissant l'hypoderme intact.À une distance d'environ 0,5 centimètre du ganglion gastrique somatique, situé entre les muscles GM un B, l'hypoderme séparé peut désormais être sectionné. L'étape suivante consiste à détacher le cerveau du tissu sous-jacent. Commencez par identifier les deux grands nerfs commissuraux qui partent bilatéralement de la partie antérieure du cerveau vers les ganglions commissuraux situés dans la portion antérieure de l'estomac.En laissant ces nerfs intacts, soulevez délicatement le cerveau avec une pince et sectionnez-le pour le séparer du reste du tissu. Soyez prudent lors de cette manipulation, car le nerf gastrique somatique se trouve sous le cerveau et doit rester intact. Pour dissocier les ganglions commissuraux du tissu environnant, localisez-les d'abord en suivant l'un des nerfs commissuraux jusqu'au ganglion.Repérez maintenant le nerf ion (ION) et le nerf sous-oculaire (SON). Ces nerfs doivent rester intacts. Chaque ganglion commissural présentera de nombreux nerfs qui en rayonnent.Sectionnez la plupart d'entre elles, sauf l'ION et la SON. Laissez un nerf supplémentaire attaché pour maintenir le ganglion commissural en place pendant que vous terminez la dissection. Localisez ensuite l'autre ganglion commissural et sectionnez les nerfs de la même manière.Ensuite, nettoyez l'ION et le SON de la partie latérale vers la partie médiale. Laissez le nerf labial intact afin d'ancrer la préparation à l'estomac. Le ganglion œsophagien se situe au niveau de l'intersection avec l'iOS.Vous pouvez dégager en dessous en saisissant le nerf ventriculaire inférieur et en pointant vers le haut pour couper en dessous. L'étape suivante consiste à séparer le STG des tissus environnants. Le STG se situe à l'intérieur d'une artère qui traverse entre les muscles GM un B et descend jusqu'aux muscles GM deux a B.Rechercher l'extrémité coupée de l'artère près du gm. Deux muscles AB tirent l'artère vers le haut et vers l'intérieur pour exposer le DVN. Continuer à tirer vers le haut jusqu'au hypoderme restant.Une fois séparée, l'artère peut être taillée au niveau où elle touche l'hypoderme restant. Ensuite, découpez le lambeau musculaire qui se situait dans le rostre du homard. Puis, soulevez l'hypoderme situé au-dessus de l'artère.L'artère forme un tunnel à l'intérieur du tissu adipeux, au-dessus du STG. Insérez une lame de vos ciseaux à l'intérieur de l'artère et sectionez le muscle situé au-dessus.Vérifiez que vous pouvez voir le DVN pendant que vous incisez afin de vous assurer que vous êtes en sécurité. Au-dessus du STG, poursuivez l'incision en direction antérieure en suivant l'artère. En incisant au-dessus du STG, vous pourrez observer le STN qui émerge en direction antérieure à partir du STG et plonge vers le bas dans le muscle.Continuer à couper en direction antérieure pour séparer complètement le muscle situé au-dessus du STG. Éliminer tous les tissus présents autour du STN. Nous pouvons maintenant procéder à l'isolement de plusieurs autres nerfs.Les prochains nerfs à disséquer du tissu environnant sont les NGA. Même si vous ne prévoyez pas d'enregistrer les potentiels du NGA, vous aurez besoin d'une portion de celui-ci pour fixer le ganglion. Pour mieux visualiser les NGA, retirez l'hypoderme résiduel ainsi qu'une fine couche du muscle sous-jacent, juste postérieure au GTS.Recherchez un tunnel sombre dans la graisse et le muscle de chaque côté du nerf DVN, insérez une lame des ciseaux dans le tunnel et sectionnez le tissu situé au-dessus du nerf. Poursuivez la coupe latéralement en suivant le nerf pour l'isoler. Quelques millimètres suffisent pour fixer le ganglion, mais exposez au moins cinq millimètres du GN A si vous prévoyez d'enregistrer à partir de celui-ci.Détacher un GN de la muscle qu'il innerve en coupant les connexions. Répéter ensuite ce processus de l'autre côté pour isoler l'autre GN A. Une fois que les deux GN A ont été disséqués, sectionner tous les muscles et tissus reliant le STG à l'estomac. Ensuite, isoler les vns M.Il s'agit d'une paire bilatérale de petits nerfs qui partent du LVN et traversent latéralement sous la graisse. Utilisez soit des ciseaux, soit deux pinces pour couper la graisse d'un côté du DVN près de l'endroit où il se divise en deux LVN. Vous vous trouvez alors éloigné du VNS moteur et vous n'encourez pas le risque de les sectionner.Soulevez la couche de graisse et examinez en dessous à la recherche d'un petit nerf. Le VNS moteur traverse latéralement juste en arrière du niveau des muscles GM un B. Retirez la couche de graisse située au-dessus du VNM en laissant le nerf intact pour l'instant, afin qu'il ne s'emmêle pas.Vous couperez son extrémité latérale ainsi que toutes les attaches au M VNS à la fin de la dissection du système nerveux. Répétez le processus de l'autre côté pour isoler l'autre MVN. Ensuite, procédez à l'isolement des LVNs situés dans les nerfs postérieurs.Commencer par les nerfs vestibulaires latéraux qui partent latéralement du nerf vestibulaire descendant. Suivre un nerf vestibulaire latéral en sectionnant la graisse située au-dessus. Selon la préparation, parfois toute la couche grasse située au-dessus du nerf peut être retirée.Continuez à dégager le nerf vestibulaire latéral jusqu'au point où le nerf sus-pétreux se ramifie. Localisez maintenant le nerf pétreux profond. C'est un nerf qui chemine en arrière au-dessus du porus.Retirez la membrane fine recouvrant cette région. Isolez le NYP en découpant une petite section du porus attachée au récipient du NYP. Ensuite, soulevez délicatement la section pric et découpez les tissus de chaque côté du NYP jusqu'à atteindre la branche qui s'attache au NDP.Procédez à l'isolement du nerf PDNA qui se dirige postérieurement vers le muscle dilatateur pric. Commencez par couper une petite section du muscle dilatateur pric attachée au PDN. Ensuite, soulevez délicatement la section du muscle dilatateur pric.Retirez le tissu de chaque côté du PDN jusqu'à atteindre la branche qui s'attache au PYN. Localisez maintenant le LVN ventral qui relie le PYN et le PDN au LVN au niveau du point de branchement triangulaire où le PYN et le PDN se rattachent au LVN ventral. Isolez n'importe quel petit segment de nerf qui part du LVN ventral, comme le VPLN. Ce segment servira de poignée pour tirer sur le LVN ventral en soulevant la poignée.Retirez le tissu de chaque côté du nerf vague ventral (LVN) en progressant vers l'avant jusqu'à atteindre le point où le nerf splanchique postérieur (PSN) se ramifie. Vous avez maintenant disséqué avec succès les nerfs postérieurs d'un côté de l'estomac. Isolez maintenant le LVN et les nerfs postérieurs de l'autre côté.Détacher complètement le nerf vague gauche (LVN) de l'estomac. Tirez sur le nerf splanchnique pariétal (PSN) et sectionnez tous les tissus et nerfs attachés au LVN et au LVN ventral, à l'exception du nerf dorsal du péricarde (PDN) et du nerf pariétal du yolk (PYN). Répétez ce processus de l'autre côté.Ensuite, sectionnez l'extrémité latérale de chaque nerf vestibulaire médian (MNV). Soulevez l'extrémité latérale et sectionnez tous les attachements au MNV à l'extrémité antérieure. Sectionnez tous les attachements aux ganglions commissuraux et le nerf labial de chaque côté.Examinez visuellement le système nerveux gastrique somatique afin d'identifier puis de sectionner tous les attachements supplémentaires au tissu gastrique. Une fois toutes les connexions coupées, saisissez l'extrémité antérieure des deux nerfs commissuraux situés au-dessus des ganglions commissuraux et détachez le système nerveux gastrique somatique de l'estomac en le soulevant, puis déplacez-le sur le côté de la boîte. Pendant cette manipulation, sectionnez tous les attachements supplémentaires afin de libérer complètement le système nerveux.La dissection est maintenant terminée. Commencez par préparer la boîte de Söderberg dans laquelle on épinglera le système nerveux. Frottez soigneusement une partie du tissu gastrique sur la surface de la boîte de Söderberg dans le petit récipient.Cela réduira l'hydrophobicité du sojar afin que la solution saline se répartisse uniformément dans la boîte. Rincez et remplissez la boîte à sojar avec de la solution saline refroidie. Transférez le système nerveux dans la boîte à sojar préparée en saisissant les extrémités antérieures des deux nerfs commissuraux.Retirer le système nerveux du grand plat et le placer dans le petit plat. Pour fixer le système nerveux, utiliser une combinaison d'épingles de précision et d'épingles plus fines. Découpées dans du fil de tungstène, ces dernières doivent d'abord être préparées ; assurez-vous que la préparation est côté dorsal vers le haut en vérifiant que le nerf ventriculaire inférieur est orienté à l'opposé du garde-sill (syl guard).Retirez maintenant le cerveau et fixez les nerfs commissuraux. Tirez doucement sur le système nerveux afin de le tendre et de l'aplatir en tirant chacun des nerfs SNP vers l'arrière et latéralement, puis fixez-les. Ensuite, retirez le muscle dilatateur du PN et fixez ces nerfs.Ensuite, retirez le segment pylorique des GYNs et épinglez les GYNs. Enfin, épinglez tous les nerfs isolés restants, tels que les nerfs labiaux, les m vns et les AGNs. L'étape suivante consiste à déshabiller le S st.G. Tout d'abord, s'assurer que le S st G est bien à plat contre la garde S et maintenu fermement par les AGN latéraux. Le STN antérieur et le DVN postérieur permettent d'ajuster l'éclairage afin de visualiser les axones à l'intérieur du DVN. Ensuite, à l'aide d'une petite broche ou d'une fine aiguille en tungstène.Creusez un petit trou peu profond dans la gaine entourant le nerf vestibulaire dorsal (DVN), juste en arrière du ganglion vestibulaire spinal (STG). Tirez l'aiguille à travers le DVN coloré, au-dessus des axones, afin de créer une déchirure horizontale dans la gaine nerveuse. Saisissez ensuite un lambeau de la gaine nerveuse situé en arrière du STG et tirez-le vers l'avant, puis coupez pour retirer la gaine de la face dorsale du STG.Une fois la gaine retirée, le prélèvement est prêt pour l'expérimentation, à condition de le maintenir au frais entre environ quatre et 15 degrés Celsius. On a observé que ce prélèvement reste expérimentalement stable jusqu'à cinq jours. Le système nerveux gastrique gastrique intact de Sato doit être fixé en forme de T contre la boîte de garde Syl.Comme illustré, les nerfs doivent être exempts de dommages et accessibles pour des enregistrements extracellulaires. Les corps cellulaires du STG intact doivent être visibles et accessibles pour des enregistrements intracellulaires. Nous venons de vous montrer comment isoler le système nerveux gastrique somatique du homard Homa Americana.Lors de cette dissection, il est important de bien connaître l'anatomie afin d'éviter d'endommager les tissus et les nerfs. De plus, il est essentiel de maintenir la préparation à une température fraîche comprise entre quatre et 15 degrés Celsius. Cette condition peut être facilement respectée pendant la dissection en renouvelant la solution saline toutes les demi-heures par de la saline fraîche conservée au réfrigérateur à quatre degrés Celsius lorsque la préparation doit rester au frais.Il reste viable pendant plusieurs heures, voire plusieurs jours. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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