Name: Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Découvrez une protéomique pour identifier les protéines interagissant avec le récepteur P2X2 dans le cerveau de rat. Cette méthode par pull-down et spectrométrie de masse améliore la compréhension des voies de signalisation des récepteurs P2X.

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SW et TMV sont soutenus par le NHLBI et NCRR au National Institutes of Health. BSK et HS sont soutenus par le NINDS et NIGMS des Instituts nationaux de la Santé.

Procédures expérimentales La procédure expérimentale (Fig. 2) se compose de quatre parties qui sont décrits d&#39;une manière graduelle ci-dessous. Partie 1: Sous-clonage et l&#39;expression de la partie C-terminale du récepteur P2X2. Nous avons exprimé toute la longueur C-terminale de P2X2 récepteurs dans des bactéries pour identifier les protéines du cerveau à laquelle il se lie. <ol><li> Le C-terminale (résidus 353 à 472) du récepteur P2X2 (Fig 1) a été amplifié par PCR, clonées dans pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) et vérifiées avec le séquençage. </li><li> Le plasmide recombinant a été transformé en E. Coli (BL21) pour l&#39;expression de protéines recombinantes. </li><li> Stocks de glycérol de bactéries (E. coli BL21) contenant le CT-P2X2 TPS plasmides ont été grattées avec une pipette stérile et inoculé dans 5 ml de milieu Luria-Bertani (LB) des médias avec un marqueur sélectif approprié (50 g / ml d&#39;ampicilline) et incubée pendant une nuit dans un agitateur orbital à 37C. </li><li> Les cultures ont été inoculées cultivées pendant une nuit dans 250 ml de milieu LB avec un antibiotique approprié (50 pg / ml d&#39;ampicilline) et incubées dans un agitateur orbital à 250 rpm pendant 2-3 heures à 37 ° C jusqu&#39;à ce que la densité optique à 600 nm atteint ~ 0,6 au 0,7. </li><li> La culture a été induite avec 1 mM d&#39;IPTG et encore incubées à 37 ° C pendant 3 heures pour l&#39;expression protéique. </li><li> La culture a été ensuite centrifugé à 5000 g pendant 15 min à 4 ° C (1ml de la culture a été sauvé pour analyser le niveau d&#39;expression et étiquetés comme «induite»). Le surnageant a été jeté et le culot a été resuspendu dans 20 ml de solution saline Tris-EDTA (STE) tampon (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM pH 8,0). </li><li> La suspension a été centrifugé à 5000 g pendant 15 min dans un tube Falcon de 50 ml. Le surnageant est écarté et le culot semi-sec a été congelée à-70C la nuit. </li><li> Le 70C-culot a été resuspendu dans 40 ml de tampon de lyse glacée (2% (p / v) sarkosyl, 15 mg de lysozyme, NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, 5 mM de DTT et complète comprimé d&#39;inhibiteur de protéase) , et la suspension a été incubé sur glace pendant 30 min. Pendant cette incubation, 3 ml de glutathion-Sépharose 4B perles ont été lavées avec 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 dans le PBS), suivie par PBS. Les perles ont été remises en suspension dans 1 ml de PBS. </li><li> La suspension bactérienne a été congelé-décongelé 3 fois dans de l&#39;azote liquide et soniqué (1s on / off, 30 microns pendant 3 min sur la glace) et encore incubées pendant 30 min à 4% (v / v) de Triton X-100, 10 mM de MgSO 4 et 2 mM d&#39;ATP sur la glace. </li><li> Le lysat a été centrifugé à 20000 g pendant 15 min à 4 ° C et de culot a été mis au rebut (un échantillon de granulés et 1 ml de surnageant a été sauvé par SDS-PAGE de tester les quantités de protéines dans le cytosol et les membranes). Le surnageant a été incubé avec les billes pendant 1 heure (ou une nuit) à 4C. </li><li> Les perles ont été centrifugés à 500 g pendant 5 min et le surnageant a été éliminé (échantillon a été sauvé de la fraction non liée). Les billes ont été lavées avec du PBS-T à cinq reprises (lavages ont été enregistrés pour les contrôles de lavage). </li><li> Les billes sont ensuite remises en suspension dans du PBS pour donner 50% (p / v) lisier et stockées dans un réfrigérateur à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. La concentration en protéine a été estimée par dosage de Bradford (selon les instructions du fabricant). </li></ol> Partie 2: Préparation des lysats ensemble du cerveau P2X2 récepteurs sont connus pour être abondamment exprimé dans le cerveau 8. Dans les présentes analyses, nous avons cherché à identifier les protéines interagissant avec les récepteurs P2X2 à partir de lysats de cerveau de rat entier (Fig. 3). <ol><li> Cerveau de rat adulte a été récolté (animaux ont été sacrifiés selon une UCLA IAACUC approuvé le protocole et selon les NIH Guide pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire) et rincés immédiatement PBS glacé (3X). </li><li> Pour lyser les cellules de 10 ml (~ 5 fois le poids humide du cerveau récoltés) de tampon de lyse glacée contenant 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, EDTA 10 mM, EGTA 1 mM, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, PMSF 1 mM, 5 ug / ml de leupeptine, 1% (v / v) NP-40, et un comprimé de cocktail inhibiteur de protéase a été ajouté au cerveau récoltés. </li><li> Tissu cérébral a été homogénéisé sur la glace avec un homogénéiseur Dounce en verre jusqu&#39;à obtenir un mélange homogène de consistance a été atteint. </li><li> Lysat cellulaire a été centrifugé à 2000 g pendant 5 minutes pour éliminer les cellules ininterrompue. Le surnageant a été recueilli et filé à nouveau à 29000 g pendant 60 minutes pour enlever les organites intacts et les agrégats de membrane. </li><li> Immédiatement après la centrifugation, le surnageant a été transféré dans un tube propre. La concentration en protéines du lysat ensemble du cerveau a été mesurée par dosage de Bradford (généralement ~ 15 mg / ml). </li><li> Le lysat a été aliquote et conservé à-70C. </li></ol> Partie 3: Isolement des protéines P2X2 C-queue associés Afin d&#39;identifier les partenaires de liaison de P2X2 CT-TPS à partir de lysats ensemble du cerveau, un menu déroulant dosage a été effectué en utilisant CT-GST immobilisées sur billes de glutathion-sépharose 4B comme appât. Pour les contrôles, la GST seule liés à des billes a été utilisé. <ol><li> Cerveau lysat a été prédédouanés avec des perles de la TPS pour 1 h à 4C. Le culot a été jeté et le surnageant a été utilisé pour d&#39;autres analyses. </li><li> Des quantités égales de la TPS et P2X2 CT-TPS (10 ug) lié au glutathion sépharose 4 billes B ont été incubées pendant la nuit avec 100 g de protéines solubilisées prédédouanés partir d&#39;un lysat cerveau de rat entier, avec une rotation à 4 ° C dans le tampon de lyse. </li><li> Perles ont été centrifugés à 1000 g pendant 5 min et le surnageant a été jeté. </li><li> Les billes ont été lavées une fois avec le tampon de lyse et bouilli dans modifiés Laemli buffer [4% (p / v) de SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoéthanol, 2% (v / v) de glycérol, 0,004% (p / v) de bleu de bromophénol et 0,125 M pH 6,8 TrisCl] pendant 5 min. </li><li> Les échantillons ont été centrifugés à 5000 g pendant 5 min et le surnageant séparés par 10% SDS-PAGE (figure 4). Les gels ont été colorés avec du gel SYPRO Ruby protéines tache (selon les instructions du fabricant) et visualisées sous lumière ultraviolette. P2X2 CT-protéines associées ont été comparés avec ceux récupérés en utilisant la TPS nul comme appât. Quatre répliques ont été réalisées biologiques (soit quatre cerveaux et quatre menus déroulants indépendants). </li></ol> Partie 4: Identification des protéines. Les protéines séparées par électrophorèse sur gel ont été excisée du gel et identifiés par spectrométrie de masse 12. Remarque: l&#39;absence de poussière au long du processus est essentielle pour réduire la contamination de kératine. L&#39;expérimentateur doit porter un masque, filet à cheveux et des gants en tout temps et ne jamais toucher la région de gel d&#39;intérêt sans l&#39;utilisation de gants. <ol><li> Toutes les bandes de protéines visibles récupéré de l&#39;attraction P2X2 bas ont été excisées avec une lame de rasoir propre et coupée en dés (Fig. 4). Régions correspondantes du gel de la TPS-nulle déroulant voies ont également été excisées de la même manière sans égard aux taches bande (bandes spécifiques pour l&#39;appât TPS-nulle ont également été excisée et identifiés) pour s&#39;assurer que la présence de protéines en dessous du niveau de la sensibilité coloration n&#39;a pas été manquée. </li><li> Les morceaux de gel ont été incubées avec 200 pl de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium dans 50% (v / v) d&#39;acétonitrile (ACN) et les tubes vortex pendant 15 min à température ambiante. Répétez cette étape de lavage. </li><li> Les morceaux de gel ont été déshydratés par addition de 200 ul d&#39;acétonitrile (morceaux de gel devrait diminuer et deviennent opaques en couleur). </li><li> Acétonitrile a été enlevé et les morceaux de gel séché dans un speedvac pour ~ 10 min. </li><li> Les morceaux de gel sont ensuite incubées avec 30 pl de l&#39;fraîchement préparés Tris 10 mM DTT/10 mm (2-carboxy-éthyl) chlorhydrate de phosphine (PTCE) d&#39;un volume suffisant pour immerger les pièces. Cela a été laissé pendant 30 min à bain d&#39;eau 56C. </li><li> Suivant la solution la TNT a été remplacé par 100 ul de bicarbonate d&#39;ammonium 500 mM en solution d&#39;acétonitrile 50% et les tranches de gel lavée avec du bicarbonate ammounium. </li><li> La solution de lavage a été aspirée et 200 ul d&#39;acétonitrile ajouté à déshydrater les gels. </li><li> L&#39;acétonitrile a ensuite été enlevé et 100 ul fraîchement préparés solution 100 mM iodoacétamide a été ajouté à alkylat sulfhydryls libre. Cette étape a procédé pendant 25 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Solution iodoacétamide a été enlevé et les morceaux de gel sont lavées avec 200 ul de 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium dans acétonitrile à 50% (pH 8,0) pendant 2 min tout en vortex. Cette étape de lavage a été répété. </li><li> Après avoir retiré la solution de lavage, les morceaux de gel ont été incubées avec 200 ul d&#39;acétonitrile, qui est ensuite éliminé par speedvac pour ~ 10min. </li><li> À cette étape, les morceaux de gel sont prêtes pour la digestion de trypsine. Morceaux de gel ont été incubés dans 30 ul solution de trypsine (20 ng / uL concentration de travail) et placé sur la glace pendant 10 min pour les gels d&#39;être bien gonflés. Trypsine en excès est éliminé et réhydratés particules de gel recouvert de 30 ul avec 50 mM de bicarbonate d&#39;ammonium pour les maintenir immergés tout au long de digestion qui a été autorisé à procéder pendant 12 à 16 heures à 37C. </li><li> Cinq ul de 5% (v / v) d&#39;acide formique est ajouté pour désactiver la digestion par la trypsine et d&#39;arrestation. </li><li> Les tubes ont été vortexés pour ~ 15 min et centrifugé brièvement pour amener le liquide au fond du tube qui a ensuite été transféré à un endroit propre et étiqueté flacon de 0,5 ml. </li><li> Suivant 30 ul de 0,1% (v / v) d&#39;acide formique dans l&#39;acétonitrile à 50% a été ajouté à des morceaux de gel de sorte qu&#39;ils étaient juste couverte suivie par deux vortex pendant 10-15 min, séparées par une brève centrifugation. Cette étape a été répétée une fois, en remplacement de l&#39;acide formique-acétonitrile entre les étapes. </li><li> Le liquide final a été enlevé et toutes les solution d&#39;extraction combinés dans un seul flacon. Ce volume a été réduit à environ 30 uL dans le speedvac. L&#39;échantillon était maintenant prêt pour la phase de nano-chromatographie liquide inverse et l&#39;identification des protéines par spectrométrie de masse. Dans cet exemple précis, cette étape est réalisée sur un spectromètre Orbi-piège de masse en tandem à partir ThermoFIsher (choisi pour sa précision de la masse élevée, cycle rapide pour la détection de protéines et généralement robustes fonctionnalités d&#39;exploitation), bien que d&#39;autres modèles et d&#39;instruments de fabricants pourraient facilement être couplé avec l&#39;approche décrite à ce point. </li><li> Les détails et les critères pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse sont maintenant brièvement présentées. Tous les peptides ont été séparés par phase inverse nano-LC (Eksigent) et des peptides ont été chargés sur une phase inverse C18 colonne à un débit de 3 l / min. Une phase mobile était de 0,1% d&#39;acide formique et ACN 2% dans de l&#39;eau; phase mobile B était de 0,1% d&#39;acide formique et 20% d&#39;eau dans l&#39;ACN. Les peptides ont été élues de la colonne à un débit de 220 nl / min en utilisant un gradient linéaire de 5% de B à B 50% plus de 90 min, puis à B 95% en 5 min, et enfin maintenir constante B de 95% pendant 5 min . Les spectres ont été acquis en dépendant des données avec le mode d&#39;Orbi-piège utilisé pour les analyses MS et LTQ pour MS / MS scans. Les peptides ont été identifiés par une recherche des spectres avec la base des rats IPI v.3.53 en utilisant l&#39;algorithme SEQUEST intégrée dans le logiciel Bioworks. Chaque peptide a rencontré les critères suivants: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), et DeltaCN&gt; 0,1. Tous les spectres utilisés pour l&#39;identification des protéines étaient contrôlées manuellement et aucune protéines acceptées lorsque moins de deux peptides ont été identifiés. Seuls les protéines présentes après chacune des quatre menus déroulants et P2X2 absent pendant menus déroulants TPS-nulle ont été considérés pour d&#39;autres analyses. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Représentation schématique d&#39;une sous-unité du récepteur P2X2. A. La caricature illustre la topologie d&#39;un sous-unité du récepteur P2X2. Le domaine cytosolique constitué de N et C terminales. Le C-terminale de récepteurs P2X2 (rouge) a été utilisé comme appât pour tirer vers le bas dosage. Séquence d&#39;acides aminés B. du récepteur P2X2 C-terminale utilisée dans cette étude. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figure 2. Diagramme et la ligne de temps du protocole utilisé pour l&#39;expression, la purification, déroulez et l&#39;identification des protéines. Nous montrons le contour du protocole avec la ligne du temps. Lysat cerveau adulte de rat a été fraîchement préparés immédiatement avant l&#39;utilisation pour la tirer vers le bas dosages. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figure 3. Représentation schématique de l&#39;analyse protéomique des binaires P2X2 C-terminale du réseau dans le cerveau du rat. Le C-terminale de récepteurs P2X2 fusionné avec la protéine liée à la TPS perles TPS a été utilisée pour tirer vers le bas dosages. Cerveau lysat a été préparé et les protéines ont été incubées avec les protéines recombinantes immobilisées. Fraction libre est lavée avec le tampon de lyse. Les protéines ont été identifiées par spectrométrie de masse. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figure 4. Identification des partenaires de liaison de l&#39;extrémité C-terminale P2X2 récepteurs. Sypro gel coloré montrant un spectre de protéines putatives qui interagissent avec le C-terminale des récepteurs fusionné avec TPS (boîte bleue). Contrôles voies pour la TPS seulement (boîte jaune) et le glutathion billes de sépharose seuls sont également représentées. Les flèches indiquent des exemples de bandes uniques qui ont été excisées pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.

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</ol>

Les canaux ioniques sont une classe importante de protéines membranaires intégrales. Ils contiennent des pores remplis d&#39;eau que de manière sélective permettre la circulation des ions bas leurs gradients électrochimiques travers la membrane plasmique. Canaux ioniques porte entre ouverte et les états fermé. L&#39;étape de déclenchement est déclenché par les émetteurs (par exemple l&#39;ATP) en cas de canaux ioniques ligand P2X gated, ou il peut être régulé par des interactions avec d&#39;autres protéines. La dernière...

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile</td><td>Réactif</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Réactif</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Réactif</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d'ammonium</td><td>Réactif</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d'ammonium (APS)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine triphosphate (ATP)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de Bradford</td><td>Réactif</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Comassie bleu R-250</td><td>Réactif</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothréitol (DTT)</td><td>Réactif</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA)</td><td>Réactif</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylèneglycol-tétraacétique (EGTA)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Réactif</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Perles de Glutathion Sépharose 4B</td><td>Réactif</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Luria-Bertani (LB)</td><td>Réactif</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (NaF)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Réactif</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Phénylméthanesulfonylfluorure (PMSF)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Comprimé inhibiteur de protéase</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Standard protéique</td><td>Réactif</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Réactif</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Flacon à vis</td><td>Outil</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Solution colorante SYPRO&amp;#174; Ruby pour gel de protéines</td><td>Réactif</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Réactif</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td>Réactif</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse tandem LTQ-Orbitrap</td><td>Outil</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie liquide nano</td><td>Outil</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-Mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

protéomique pour identifier les protéines interagissant avec p2x2 canaux cationiques ligand-dépendants

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Canaux ioniques ligand-dépendants sous-tendent la communication synaptique dans le système nerveux 1. Chez les mammifères, il existe trois familles de canaux ligand-dépendants: la boucle Cys, le glutamate-dépendants et les canaux récepteurs P2X 2. Dans chaque cas de liaison de l&#39;émetteur conduit à l&#39;ouverture d&#39;un pore à travers lequel les ions couler leurs gradients électrochimiques. Beaucoup de canaux ligand-dépendants sont aussi perméables aux ions calcium 3, 4, qui ont des rôles de signalisation en aval 5 (régulation des gènes par exemple) qui peut dépasser la durée d&#39;ouverture des canaux. Ainsi canaux ligand-dépendants peuvent signal sur des échelles de temps allant de larges quelques millisecondes à quelques jours. Compte tenu de ces rôles importants, il est nécessaire de comprendre comment ligand-mêmes canaux ioniques sont régulés par des protéines, et comment ces protéines peuvent syntoniser la signalisation. Des études récentes suggèrent que beaucoup, sinon toutes, les chaînes peuvent faire partie des complexes de protéines de signalisation 6. Dans cet article, nous expliquons comment identifier les protéines qui se lient à des aspects C-terminale du domaine P2X2 récepteur cytosolique. Récepteurs P2X sont des canaux cationiques ATP-dépendants et se compose de sept sous-unités (P2X1-P2X7). Récepteurs P2X sont largement exprimés dans le cerveau, où ils servent de médiateurs excitateurs transmission synaptique et la facilitation présynaptique de libération des neurotransmetteurs 7. Récepteurs P2X sont trouvés dans les cellules excitables et non excitables et arbitrer un rôle clé dans la signalisation neuronale, l&#39;inflammation et la fonction cardiovasculaire 8. P2X2 récepteurs sont abondants dans le système nerveux 9 et font l&#39;objet de cette étude. Chaque sous-unité P2X est censé posséder deux segments transmembranaires (TM1 et TM2) séparés par une région extracellulaire et intracellulaire 7 N et C terminales (figure 1a) 7. Sous-unités P2X 10 (P2X1-P2X7) montrent une homologie de séquence de 30-50% au niveau des acides aminés 11. Récepteurs P2X contenir que trois sous-unités, qui est la plus simple parmi les récepteurs ionotropiques stoechiométrie. Le P2X2 C-terminale composée de 120 acides aminés (Fig 1b) et contient plusieurs sites d&#39;accueil pour des protéines de consensus, soutenant l&#39;hypothèse que des récepteurs P2X2 peut-être partie des complexes de signalisation. Cependant, bien que plusieurs fonctions ont été attribuées à l&#39;extrémité C-terminale des récepteurs P2X2 9 aucune étude n&#39;a décrit les partenaires moléculaires qui se couplent à la face intracellulaire de cette protéine par l&#39;intermédiaire de la longueur totale C-terminale. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d&#39;une approche protéomique pour identifier les protéines qui interagissent avec la pleine longueur C-terminale de P2X2 récepteurs.

Nous décrivons un protocole simple pour identifier les protéines du cerveau qui se lient à l&#39;extrémité C-terminale pleine longueur de l&#39;ATP-dépendants P2X2 récepteurs. L&#39;extension et l&#39;application systématique de cette approche à tous les récepteurs P2X devrait conduire à une meilleure compréhension de la signalisation des récepteurs P2X.

Protéomique pour identifier les protéines interagissant avec P2X2 canaux cationiques ligand-dépendants

Les canaux ioniques ligands-dépendants sous-tendent la communication synaptique dans le système nerveux1. Chez les mammifères, on dénombre trois familles de canaux ligands-dépendants : les canaux à boucle Cys...

Cette procédure commence par la surexpression de l'extrémité C recombinante du récepteur Puric P deux X ou P deux X deux, conçue comme une protéine de fusion GST après lyse bactérienne. La protéine purifiée est incubée avec des billes de glutathion-sépharose 4B, et sa concentration est déterminée par la méthode de Bradford. Ensuite, des protéines issues d'un lysat cérébral de rat purifié sont incubées avec l'extrémité C des récepteurs P deux X deux liée au glutathion sur des billes de sépharose ; les complexes protéiques liés à l'extrémité C des récepteurs P deux X deux sont alors isolés par électrophorèse SDS-PAGE, excision de la bande protéique, puis identifiés par spectrométrie de masse.Bonjour, je suis Harpring du laboratoire du département de Physiologie JIT K à l'Université de Californie à Los Angeles. Bonjour, je suis Sarah Walburn du laboratoire de Tom Vka du département d'Anesthésiologie à l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure permettant d'isoler et de purifier les CTS des récepteurs P deux X deux.Nous utilisons ces protéines pour identifier l'origine à partir du cerveau rouge et, dans notre laboratoire, nous utilisons ces protéines pour étudier les conséquences fonctionnelles sur les récepteurs P2X2. Commençons donc. Le domaine cytosolique du récepteur P2X2 est constitué des extrémités N et C terminales.L'extrémité C du récepteur P2X2 sera utilisée comme appât pour le test de précipitation biochimique, comme illustré par la séquence de l'extrémité C du récepteur P2X2 utilisée dans cette étude d'interaction. Pour exprimer la totalité de l'extrémité C des récepteurs P2X2, recourir aux techniques conventionnelles de biologie moléculaire afin d'insérer la séquence codante correspondant à l'extrémité C du récepteur, les résidus 353 à 472, dans un plasmide pGE-X4-NT1.Le plasmide recombinant est ensuite transformé dans la souche d'E. coli BBL 21 pour expression. Les bactéries contenant le plasmide recombinant sont cultivées dans du LB à 37 degrés Celsius. Lorsque la densité optique de la culture à 600 nanomètres est comprise entre 0,6 et 0,8.Induire la culture avec un millimolaire de IPTG et incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Une fois l'incubation de trois heures terminée, prélever un aliquot de un millilitre à partir de la culture et conserver pour une analyse ultérieure. Centrifuger le reste de la culture à 5 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, après la centrifugation, jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 20 millilitres de tampon salin tris EDTA, puis transférer le culot resuspendu dans un tube Falcon de 50 millilitres.La suspension doit maintenant être centrifugée à 5 000 G pendant 15 minutes pour recueillir le culot semi-sec, qui est congelé à moins 70 degrés Celsius pendant toute la nuit. Le jour suivant, resuspendre le culot congelé dans 40 millilitres de tampon de lyse glacé et placer sur de la glace pendant 30 minutes, le culot resuspendu restant sur la glace. Préparer trois millilitres de billes de glutathion-sépharose 4B.Commencez par laver les billes avec 20 millilitres de PBS et 20 millilitres de TPBS. Ensuite, lavez les billes avec du PBS pur et resuspendez-les dans un millilitre de PBS. La suspension bactérienne dans le tampon de lyse est maintenant soumise à un cycle de congélation-décongélation dans l'azote liquide.L'échantillon congelé a été incubé sur de la glace pour décongeler, puis plongé à nouveau dans de l'azote liquide. Cette étape a été répétée trois fois. Ensuite, soniquez la suspension de cycles de congélation-décongélation sur de la glice.Après la sonication, incuber la suspension bactérienne avec une solution contenant 4 % de Triton X-110, un millimolaire de sulfate de magnésium et deux millimolaires d'ATP pendant 30 minutes sur de la glace. Ensuite, centrifuger le lysat à 20 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et conserver le surnageant. Avant de jeter le culot, prélever un petit échantillon du culot avec du surnageant afin d'analyser les protéines du cytosol et des membranes.Incubez le surnageant avec les billes pendant une heure ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après l'incubation, centrifugez les billes à 500 G pendant cinq minutes. Jetez la majeure partie du surnageant, mais conservez un petit échantillon afin de représenter la fraction des protéines non liées. Lavez les billes en culot cinq fois avec 25 millilitres de TPBS, en conservant un peu de chaque lavage pour les témoins de lavage.Enfin, resuspendre les billes dans du PBS pour obtenir une suspension à 50 % poids/volume et conserver à quatre degrés Celsius. La concentration en protéines peut être estimée à l’aide du dosage de Bradford selon les instructions du fabricant et devrait être de 500 microgrammes par millilitre. Pour identifier les partenaires d’interaction de P deux X deux CT GST à partir de lysats totaux de cerveau, un dosage d’affinité est réalisé en utilisant CT GST immobilisé sur les billes revêtues de glutathion comme appât, servant de témoin.Utilisez la GST seule liée à des billes comme appât, désignée ci-après sous le nom de lysat de cerveau de rat GST Knoll. Le test de liaison de la protéine de fusion GST a été préparé selon un protocole standard et un tampon de lyse, et la concentration en protéines a été estimée à 15 milligrammes par millilitre par le test de Bradford. Avant de commencer le test.Pré-éliminer les lysats cérébraux décongelés en les incubant avec 30 microlitres de billes GST pendant une heure à quatre degrés Celsius après que le lysat ait été incubé avec les billes GST. Centrifuger les billes à 1000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le surnageant et garder un petit volume de celui-ci comme témoin.Calculez maintenant le volume de lyzat qui doit contenir 100 microgrammes de la protéine solubilisée pré-clarifiée et mélangez ce volume de lyzat avec 10 microgrammes de billes liées à la GST et 10 microgrammes de billes liées à la GST P deux X deux CT. Complétez le volume à 200 microlitres à l’aide du tampon de lyse. Incubez le lyzat avec les billes toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger les billes à 1000 G pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Laver les billes trois fois avec un millilitre de tampon de lyse. Puis ajouter 50 microlitres de tampon lely modifié aux billes et faire bouillir les billes dans ce tampon pendant cinq minutes.Faire centrifuger les échantillons bouillis à 5 000 ×g pendant cinq minutes et déposer l'échantillon douteux sur un gel SDS-PAGE à 10 %. Comparer les protéines associées à P2X2CT à celles récupérées à l'aide de l'appât GST Nola. La dernière étape cruciale de l'analyse consiste à extraire les protéines séparées du gel pour leur identification par spectrométrie de masse à partir de ce point.L'absence de poussière tout au long du processus est essentielle pour réduire la contamination par la kératine. Commencez par découper les bandes du gel à l’aide d’un rasoir propre. Ensuite, divisez les bandes en trois sections plus petites et placez chaque bande dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté, correspondant aux régions du gel dans le GST.Une bande témoin sans prélèvement doit également être découpée de la même manière, indépendamment de la coloration. Afin de s'assurer que les protéines présentes en dessous du seuil de détection de la coloration ne soient pas omises, mélanger les morceaux de gel avec 200 microlitres de bicarbonate d'ammonium à 50 millimolaire et d'acétonitrile à 50 % volume par volume, puis agiter les tubes par vortex pendant 15 minutes à température ambiante.Après vortexage, éliminer la solution de lavage et répéter l'opération. Éliminer la dernière solution de lavage et déshydrater les morceaux de gel en ajoutant 200 microlitres d'acétonitrile. Les morceaux de gel doivent rétrécir et devenir opaques.En moins de deux minutes, retirez l'acétonitrile et séchez les morceaux de gel. À l'aide d'un évaporateur sous vide pendant 10 minutes, les morceaux de gel desséchés sont ensuite incubés dans une solution fraîchement préparée de DTT 10 millimolaire et de TEP 10 millimolaire. Le volume de la solution, généralement d'environ 30 microlitres, doit être suffisant pour immerger complètement les morceaux de gel.Laisser les morceaux de gel se réduire dans la solution pendant 30 minutes dans un bloc chauffant à 56 degrés Celsius. Ensuite, retirer la solution de TEP de DTT et la remplacer par une solution de lavage composée de 100 microlitres de bicarbonate d'ammonium 500 millimolaire dans 50 % d'acétonitrile ; agiter au vortex pendant 10 minutes, puis aspirer le bicarbonate d'ammonium après agitation et le remplacer par 200 microlitres d'acétonitrile afin de déshydrater les morceaux de gel. Les morceaux de gel doivent rétrécir et devenir opaques en deux minutes.À côté de l'alkylate, remplacer le nitrile acétique par 100 microlitres de solution fraîchement préparée d'acétamide I OTO à 100 millimolaire pour tout sulfhydryle libre. Incuber ce mélange pendant 25 minutes à température ambiante à l'abri de la lumière. Après l'incubation, éliminer la solution d'acétamide IDO et laver les morceaux de gel avec 200 microlitres de bicarbonate d'ammonium à 50 millimolaire et 50 % d'acétonitrile par vortexage pendant cinq minutes.Cette étape de lavage est répétée une fois. Éliminer la dernière solution de lavage et incuber les morceaux de gel dans 200 microlitres d'acétonitrile pendant 10 minutes. Retirer l'acétonitrile, puis sécher les échantillons au speed vac.À cette étape, les morceaux de gel sont prêts pour la digestion par la trypsine. Ajoutez 30 microlitres de solution de trypsine à une concentration de travail d'environ 20 nanogrammes par microlitre et incubez sur de la glace pendant 10 minutes.Les morceaux de gel doivent gonfler correctement. Éliminer l'excès de solution de trypsine et immerger les particules de gel réhydratées dans 30 microlitres de bicarbonate d'ammonium 50 millimolaire. Laisser la digestion se poursuivre pendant 12 à 16 heures à 37 degrés Celsius, puis arrêter la digestion et désactiver la trypsine par une incubation prolongée avec cinq microlitres d'acide formique à 5 %.Ensuite, vortexer les tubes pendant 15 minutes, puis centrifuger brièvement les tubes afin de ramener le liquide au fond du tube et transférer cette solution contenant les peptides digérés dans un tube demi-millilitrique propre et étiqueté. Puis, recouvrir les morceaux de gel d’environ 30 microlitres de solution d’extraction contenant 0,1 % d’acide formique dans 50 % d’acétonitrile et vortexer de 10 à 15 minutes. Ajouter cette solution d’extraction au nouveau tube demi-millilitrique.Répétez cette étape. Transférez la solution d'extraction dans le nouveau tube de demi-millilitre ; le tube de demi-millilitre contenant la solution de digestion nocturne et les deux solutions d'extraction est réduit à environ 30 microlitres dans le congélateur-séchoir. Cette solution de peptides est désormais prête à être analysée par LC-MS-MS.Séparez les protéines par chromatographie liquide nanométrique en phase inverse, en utilisant une colonne en phase inverse C18, acquérez les spectres en mode dépendant des données avec l'orbitrap pour les analyses MS et le LTQ pour les analyses MS/MS. Identifiez les protéines en recherchant les données dans la base de données IPI de rat à l'aide de l'algorithme Sequest intégré au logiciel Bioworks, puis examinez manuellement les spectres uniquement pour les protéines présentes dans chacun des quatre réplicats d'échantillons et absentes lors de la purification par GST. Les protéines non retenues lors de la précipitation ne doivent pas être prises en compte pour les analyses ultérieures.Voici le gel coloré à la Cipro montrant un spectre de protéines putatives interagissant avec l'extrémité C-terminale des récepteurs P deux X deux. Fusionné avec GST, indiqué par la case bleue, des voies témoins pour GST seul, indiquées par la case jaune, et le glutathion. Les sphéroïdes de glutathion seuls sont également présentés.Les flèches indiquent des exemples de bandes uniques qui ont été découpées pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse. Nous venons de vous montrer comment exprimer et purifier les CTO des récepteurs P deux X deux. Nous vous avons également montré comment réaliser la précipitation par affinité à l'acide et identifier les protéines interagissant avec la cible.Il est important de garder à l'esprit, lors de cette procédure, que vous devez porter des gants et une charlotte afin de réduire la contamination par la kératine dans vos échantillons. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.

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