Name: La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Apprenez la préparation des embryons de Drosophila pour l'imagerie en direct par le protocole de goutte suspendue. Cette méthode simple préserve l'humidité et l'échange gazeux tout en évitant la compression des embryons.

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Nous remercions le soutien à la BHR à travers une subvention à la découverte ainsi que d&#39;un outils de recherche et Grant Instrument de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG). Nous reconnaissons également H. Oda et le stock de Bloomington drosophile Centre de fournir des stocks génétiques qui ont été utilisés dans des séquences d&#39;imagerie par exemple la vivre.

Préparation <ol><li> Recueillir des embryons sur le standard des plaques d&#39;agar jus de raisin 4. Il est commode d&#39;utiliser un système automatisé de drosophile Egg Collector (flymax scientifique Equipment Ltd.) Utiliser synchrones en scène des collections embryon réduire le nombre de dechorionations qui doivent être effectuées afin d&#39;obtenir un nombre suffisant d&#39;embryons au stade désiré de développement. </li><li> Préparer une diapositive dechorionation en attachant un morceau de scotch double-face à une lame de microscope, retirer la pellicule protectrice de la bande. </li><li> Préparer la chambre de l&#39;imagerie en direct par couper un morceau de tissu pour tenir dans le puits de la chambre. Placez le tissu dans le puits et le mouillé avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Mélanger l&#39;huile d&#39;halocarbures (Halocarbon Products Corp) de la série 700 et série 56 de viscosité à un ratio de 1:1. Le mélange peut être stocké et utilisé indéfiniment. </li><li> Placez plusieurs petites gouttes d&#39;huile d&#39;halocarbures sur la surface d&#39;une lamelle (22 x 40 mm, n ° 2). Le volume n&#39;est pas critique mais doit être de l&#39;ordre de ul 20-40. </li></ol> Procédure <ol><li> Avec l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, recueillir des embryons à partir du raisin Jus-agar en utilisant soit une paire de pinces de bijoutier (n ° 5) ou d&#39;un pinceau très fin. Les embryons ont tendance à coller les unes aux autres et à des conseils de la pince », ils sont facilement collectées en touffes. </li><li> Avec l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, abaissez doucement la touffes d&#39;embryons qui ont adhéré à la pointe de la pince sur la surface de la bande sur la diapositive dechorionation. </li><li> En utilisant à nouveau le stéréomicroscope, doucement pousser ou un AVC que les embryons avec le côté de la pince, afin de casser la chorion externe cireuse sans rupture de la membrane interne vitelline (l&#39;embryon va éclater, si la membrane vitelline est rompue). </li><li> Une fois le chorion externe a été rompue, taquiner l&#39;embryon à partir du chorion, l&#39;embryon dechorionated tend à adhérer à la surface de la pince. Prenez soin d&#39;éviter de toucher l&#39;embryon dechorionated à la surface de la bande. </li><li> Dès que l&#39;embryon n&#39;est dechorionated, rapidement, il transfert à la baisse précédemment préparé de l&#39;huile d&#39;halocarbures sur la lamelle. Toucher la pointe de la pince transportant l&#39;embryon dechorionated à la surface de la goutte d&#39;huile sur les halocarbures - ce déloge l&#39;embryon de la pince dans l&#39;huile. </li><li> Confirmer le transfert de l&#39;embryon à la goutte d&#39;huile. Cela peut être fait à l&#39;œil nu à condition que vous travaillez sur un fond noir et d&#39;utiliser une source d&#39;illumination par fibre optique fixé à un angle oblique. </li><li> Avant de tenter de dechorionate autre embryon, nettoyer toute l&#39;huile de la pince. Pince enduit d&#39;huile ont moins d&#39;achat sur la surface du chorion, ce qui rend plus difficile dechorionation. </li><li> Embryons sont porteurs Dechorionated dans l&#39;huile d&#39;halocarbures. En utilisant une pince ou d&#39;un pinceau et tout en regardant à travers une loupe binoculaire, poussez l&#39;embryon au fond de la goutte d&#39;huile et l&#39;organiser dans la position désirée. </li><li> Vite inverser la lamelle sur le bien de la chambre de l&#39;imagerie en direct. Confirmez que les embryons sont au repos contre la lamelle dans l&#39;orientation désirée. En raison de leur flottabilité dans l&#39;huile, les embryons seront désormais flotter contre la surface inférieure de la lamelle. Fixer la lamelle de la chambre de l&#39;imagerie en direct avec du ruban adhésif. Aérer la chambre par des trous dans la bande dans la zone où la bande enjambe le fossé entre la fin de la lamelle et la fin du puits de la chambre de l&#39;imagerie en direct. </li><li> Un microscope à fluorescence verticale ou un stéréomicroscope à fluorescence peut maintenant être utilisé à l&#39;image de l&#39;embryon. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Nous décrivons une nouvelle méthode de préparation des embryons de drosophile pour l&#39;analyse de l&#39;imagerie en direct, que nous appelons le protocole goutte suspendue. Malheureusement, il n&#39;est pas possible d&#39;utiliser le protocole goutte suspendue si l&#39;on travaille avec un microscope inversé. Dans ce cas, la technique sandwich (comme décrit ci-dessus dans le résumé) doivent être utilisées et la compression des embryons reste un sujet de préoccupation. Dans les expériences ...

L&#39;équipement standard et les matériaux nécessaires à la préparation des embryons pour vivre d&#39;imagerie utilisant le protocole goutte suspendue comprennent les éléments suivants: des lames de microscope, lamelles (22 x 40 mm, n ° 2), ruban adhésif double face, des pinces de bijoutier (style Dumont n ° 5 ), huile d&#39;halocarbures série 56 et série 700 (Halocarbon Products Corp), un couteau ou une lame de rasoir seule pointe, papier de soie, des ciseaux, de l&#39;eau distillée, ruban à usage général, et une pipette apte à délivrer ul 20-40. Le protocole d&#39;imagerie vivons exige également une chambre de sur-mesure imagerie en temps réel. Il est préparé par une réduction de 5 mm en polycarbonate pense feuille de plastique pour les dimensions d&#39;une lame de microscope standard (75 x 25 mm) et en utilisant un rotor pour créer une dépression profonde 3mm dans la glissière (20 X 55 mm). L&#39;accès à un stéréomicroscope (loupe binoculaire) et une source d&#39;illumination par fibre optique est également requise.

la préparation des drosophile les embryons destinés à live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Protéine fluorescente verte (GFP) basé timelapse vivons-imagerie est une technique puissante pour étudier la régulation génétique de processus dynamiques tels que la morphogenèse des tissus, adhérence cellule-cellule, ou la mort cellulaire. Embryons de drosophile exprimant la GFP sont facilement imagée en utilisant la microscopie soit stéréoscopique ou confocale. Un but de tout protocole vivons-imagerie est de minimiser les effets néfastes tels que la déshydratation et l&#39;hypoxie. Protocoles antérieurs pour préparer des embryons de drosophile pour live-analyse de l&#39;imagerie ont impliqué plaçant embryons dechorionated dans l&#39;huile d&#39;halocarbures et de les intercaler entre un halocarbure perméables au gaz de membrane et une lamelle<sup&gt; 1-3</sup&gt;. L&#39;introduction de la compression à travers embryons de montage de cette manière représente une complication indésirable pour toute analyse biomécanique basée sur la morphogenèse. Notre méthode, que nous appelons le protocole goutte suspendue, résultats dans une excellente viabilité des embryons lors de l&#39;imagerie en direct et ne nécessite pas que les embryons soient compressées. Brièvement, le protocole goutte suspendue implique le placement d&#39;embryons dans une goutte d&#39;huile sur les halocarbures qui est suspendu à partir d&#39;une lamelle, qui est, à son tour, en position fixe sur une chambre humide. En plus d&#39;offrir l&#39;échange de gaz et prévenir la déshydratation, cet arrangement profite de la flottabilité de l&#39;embryon dans l&#39;huile d&#39;halocarbures pour les empêcher de dériver hors de position lors de l&#39;acquisition timelapse. Cette vidéo décrit en détail la façon de recueillir et de préparer des embryons de drosophile pour l&#39;imagerie en direct en utilisant le protocole goutte suspendue. Ce protocole est adapté pour les embryons d&#39;imagerie utilisant dechorionated stéréomicroscopie ou microscope composé debout fluorescence.

Une méthode simple, peu coûteux et efficace de préparer les embryons de drosophile pour live-imagerie analyse est présentée. Notre protocole prévoit l&#39;échange d&#39;humidité et de gaz et ne compresse pas l&#39;embryon de drosophile. Cette méthode est adaptée pour la GFP imagerie basée sur des embryons de drosophile direct en utilisant un stéréomicroscope ou microscope composé debout.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

L'imagerie directe en temps réel basée sur la protéine fluorescente verte (GFP) est une technique puissante pour étudier la régulation génétique de processus dynamiques tels que...

Bonjour. Je m'appelle Bruce Reed. Je suis professeur adjoint au Département de biologie de l'Université de Waterloo à Waterloo, en Ontario, au Canada. Nous réalisons aujourd'hui cette archive vidéo afin de documenter une nouvelle technique que nous avons mise au point pour préparer vos embryons de drosophile pour une analyse en imagerie vivante.Lors de l'analyse d'images en direct utilisant des embryons de drosophile, nous utilisons fréquemment une acquisition en laps de temps, qui peut durer plusieurs heures. Il est donc essentiel de disposer d'une technique permettant de protéger les embryons contre la déshydratation ainsi que contre l'hypoxie. De plus, nous souhaitons également développer une technique qui éviterait toute compression de l'embryon.Lors du montage, nous avons mis au point une méthode très simple, peu coûteuse et efficace que nous appelons la préparation en goutte suspendue. Cette préparation en goutte suspendue convient à l'analyse en imagerie vitale d'embryons à l'aide d'une microscopie stéréo ou de tout microscope composé droit. Ce film en prise de vue instantanée montre huit embryons exprimant GFP, préparés selon le protocole de la goutte suspendue et observés

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Apprenez la préparation des embryons de Drosophila pour l'imagerie en direct par le protocole de goutte suspendue. Cette méthode simple préserve l'humidité et l'échange gazeux tout en évitant la compression des embryons.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

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