La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue
13 mars 2009
Une méthode simple, peu coûteux et efficace de préparer les embryons de drosophile pour live-imagerie analyse est présentée. Notre protocole prévoit l'échange d'humidité et de gaz et ne compresse pas l'embryon de drosophile. Cette méthode est adaptée pour la GFP imagerie basée sur des embryons de drosophile direct en utilisant un stéréomicroscope ou microscope composé debout.
Bonjour. Je m'appelle Bruce Reed. Je suis professeur adjoint au Département de biologie de l'Université de Waterloo à Waterloo, en Ontario, au Canada. Nous réalisons aujourd'hui cette archive vidéo afin de documenter une nouvelle technique que nous avons mise au point pour préparer vos embryons de drosophile pour une analyse en imagerie vivante.
Lors de l'analyse d'images en direct utilisant des embryons de drosophile, nous utilisons fréquemment une acquisition en laps de temps, qui peut durer plusieurs heures. Il est donc essentiel de disposer d'une technique permettant de protéger les embryons contre la déshydratation ainsi que contre l'hypoxie. De plus, nous souhaitons également développer une technique qui éviterait toute compression de l'embryon.
Lors du montage, nous avons mis au point une méthode très simple, peu coûteuse et efficace que nous appelons la préparation en goutte suspendue. Cette préparation en goutte suspendue convient à l'analyse en imagerie vitale d'embryons à l'aide d'une microscopie stéréo ou de tout microscope composé droit. Ce film en prise de vue instantanée montre huit embryons exprimant GFP, préparés selon le protocole de la goutte suspendue et observés par microscopie de fluorescence en prise de vue instantanée.
Cette séquence d'images représente plus de quatre heures de temps écoulé. L'apparition des mouvements indique que ces embryons sont dans un état viable. Nous allons maintenant vous guider à travers une description détaillée étape par étape de la réalisation du protocole de la goutte suspendue.
Les embryons sont collectés sur des plaques standard au jus de raisin ou aux œufs. À l'aide d'un collecteur d'œufs automatisé dsof FLA provenant de l'équipement scientifique Fly max, le collecteur automatisé permet d'obtenir des collectes synchronisées d'embryons à un stade de développement prédéterminé. En prévision de la préparation manuelle des embryons, un morceau de ruban adhésif double face est fixé sur une lame de microscope et le support du ruban est retiré.
Le protocole de la goutte pendante nécessite une chambre personnalisée fabriquée à partir d'une feuille de plastique en polycarbonate de cinq millimètres d'épaisseur. La feuille est découpée aux dimensions d'une lame de microscope, et une dépression de trois millimètres de profondeur est réalisée à l'aide d'un rotor. L'humidification de la chambre d'imagerie en direct est assurée par un morceau de papier absorbant découpé de manière à s'ajuster au fond de la chambre et imbibé d'eau distillée.
L'huile Halo Carbon est idéale pour l'imagerie en direct d'embryons de drosophile car elle est perméable aux gaz et optiquement claire. Le mélange de l'huile Halo Carbon série 700 et série 56 dans un rapport de un pour un donne une viscosité adaptée au travail avec des embryons de Drosophila. Les embryons peuvent être collectés à partir des boîtes de gélose au jus de raisin à l'aide de pinces de bijoutier ou d'un pinceau très fin.
Les embryons adhèrent les uns aux autres et aux extrémités de la pince. Ils s'assemblent facilement en grappes, des grappes d'embryons. En adhérence à la pince.
Les pointes sont abaissées délicatement sur la surface adhésive du ruban fixé sur la lame décorée préparée précédemment. En observant les embryons au microscope stéréoscopique, poussez-les doucement ou caressez-les avec le côté de la pince. Vous devez ouvrir la corone sans rompre la membrane interne de vilin.
Cela nécessite une main ferme, de la patience et un peu d'entraînement. Une fois que la corone externe a été rompue, l'embryon désinfecté a tendance à adhérer à la pince. Veillez à ne pas laisser l'embryon désinfecté entrer en contact avec la surface collante du ruban.
Il peut être très difficile de le récupérer rapidement à partir du ruban ; transférez sans tarder les embryons déchlorés dans l'halo. Faites tomber de l'huile de carbone sur la lame. Il est conseillé de garder ceci à proximité. En touchant la pointe de la pince à la surface de la goutte d'huile de carbone.
L'embryon est délogé des pinces dans l'huile ; le transfert de l'embryon peut être confirmé à l'œil nu en utilisant un fond noir et une source d'illumination en fibre optique réglée selon un angle oblique, avant de chloriner l'embryon suivant. Il est utile d'essuyer l'huile de vos pinces en raison de leur flottabilité dans l'huile de halo carbone. Les embryons coordonnés flottent à la surface de la goutte d'huile.
Nous pouvons contrôler la position et l'orientation des embryons en les poussant vers le bas de la goutte d'huile, puis en inversant rapidement la lame dans le protocole de goutte pendante. Nous retournons la lame au-dessus du puits humidifié de la chambre d'imagerie vivante. Lorsque la lame est inversée, les embryons reposent contre la face inférieure de la lame.
Les positions au repos des embryons peuvent être vérifiées au microscope stéréo. Si elles ne sont pas satisfaisantes, la procédure peut être répétée. Une fois que les embryons sont en position souhaitée, la lame couvre-objet est fixée à la chambre d'imagerie vivante à l'aide de ruban adhésif.
La chambre est ventilée en découpant des trous dans le ruban. Les embryons sont maintenant prêts à être observés.
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Aperçu
Cet article présente une méthode simple et efficace pour préparer des embryons de Drosophila en vue d'une analyse par imagerie vivante. Le protocole assure une humidité adéquate et des échanges gazeux tout en empêchant la compression des embryons, ce qui le rend adapté à l'imagerie basée sur la GFP.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Techniques d'imagerie
Contexte
- L'analyse par imagerie vivante d'embryons de Drosophila est couramment réalisée à l'aide d'acquisitions en laps de temps.
- Les embryons sont sensibles à la déshydratation et à l'hypoxie pendant les séances d'imagerie prolongées.
- Une technique permettant d'éviter la compression des embryons est essentielle pour une imagerie précise.
- L'imagerie basée sur la GFP nécessite des conditions spécifiques pour des résultats optimaux.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant de protéger les embryons de Drosophila contre la déshydratation.
- Garantir un échange gazeux adéquat pendant l’imagerie.
- Éviter la compression des embryons lors de l’imagerie en temps réel.
Méthodes utilisées
- Préparation d'embryons de Drosophila pour l'imagerie vivante.
- Mise en œuvre d'un contrôle de l'humidité pendant les séances d'imagerie.
- Utilisation d'un stéréomicroscope ou d'un microscope composé droit pour l'imagerie.
- Application de techniques d'imagerie basées sur la GFP.
Résultats principaux
- La méthode maintient efficacement l'humidité et les échanges gazeux pour les embryons.
- Les embryons restent non comprimés, ce qui permet une meilleure qualité d'imagerie.
- L'imagerie basée sur la GFP donne des résultats clairs sur des périodes prolongées.
- La technique est simple et rentable pour les chercheurs.
Conclusions
- Cette méthode améliore la qualité de l'imagerie en direct des embryons de Drosophile.
- Elle offre une approche fiable aux chercheurs du domaine.
- Le protocole peut être facilement adopté dans divers contextes de laboratoire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'imagerie en direct d'organismes modèles est essentielle pour la validation de cibles et le criblage phénotypique en phase de découverte précoce. Le protocole de goutte pendante permet de surmonter les limitations majeures liées à la déshydratation, à l'hypoxie et à la compression mécanique, qui compromettent la viabilité des embryons et la qualité des données pendant l'imagerie en laps de temps prolongé. En permettant une imagerie non comprimée et physiologiquement pertinente d'embryons de Drosophila, cette méthode facilite l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux interventions génétiques et pharmacologiques, dans un format évolutif et rentable.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la régulation génétique dans des processus dynamiques tels que la morphogenèse tissulaire et l'adhésion cellulaire, sans artefacts mécaniques dus à la compression.
- Valeur opérationnelle : Préserve la viabilité de l'embryon pendant plus de quatre heures, permettant une observation longitudinale de la fonction des gènes et de la dynamique des voies biologiques.
- Valeur prédictive : Réduit les faux positifs issus de phénotypes induits par le stress, améliorant ainsi la fiabilité des tests de validation de cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit une plateforme standardisée et reproductible pour l'imagerie en direct basée sur la GFP, qui minimise la variabilité environnementale.
- Valeur opérationnelle : Utilise des matériaux peu coûteux et facilement accessibles (huile d'halocarbure, chambre en polycarbonate, ruban adhésif), adaptés à une utilisation en haut débit.
- Préparation du test : Exploite la flottabilité des embryons dans l'huile pour maintenir une stabilité positionnelle, réduisant ainsi la dérive et améliorant la cohérence du signal lors de l'acquisition en lapse de temps.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet l'imagerie de processus développementaux conservés, pertinents pour les modèles de maladies humaines, facilitant l'extrapolation entre espèces.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'observer les comportements cellulaires (par exemple, la mort cellulaire, l'adhésion) dans des conditions physiologiques, améliorant ainsi la fiabilité prédictive des modèles précliniques ultérieurs.
- Système pertinent pour les maladies : Des embryons de Drosophila exprimant des capteurs GFP associés à des maladies peuvent être utilisés pour surveiller la modulation de voies biologiques in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le protocole de la goutte pendante s'inscrit dans la continuité de la découverte, de la validation de cibles à l'identification de composés d'intérêt, en particulier pour les tests nécessitant une imagerie dynamique et non comprimée de capteurs génétiquement codés.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en permettant la visualisation directe des effets de l'extinction ou de la surexpression génique sur la morphogenèse embryonnaire.
- Criblage : Fournit des signaux fluorescents quantitatifs et résolus dans le temps, essentiels pour comparer les effets de composés ou de conditions génétiques.
- Analyse : Génère des données temporelles stables et de haute qualité, adaptées à l'analyse morphométrique et à la quantification phénotypique.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes génétiques chez Drosophila à des voies conservées, orientant le choix des cibles pour les modèles vertébrés.
- Réutilisation en milieu professionnel : La simplicité et le faible coût du protocole permettent son adoption généralisée au sein des équipes, en tant que méthode normalisée de préparation à l'imagerie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance prédictive en éliminant les artefacts de compression et en maintenant les conditions physiologiques pendant l'imagerie.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à un contrôle standardisé de l'humidité, des échanges gazeux et de la manipulation des embryons.
- Valeur stratégique : Réduit le bruit biologique dans les campagnes de criblage, augmentant la sensibilité du test et diminuant les taux de faux positifs.
- Impact sur le portefeuille : Permet des décisions plus fiables d'aller/ne pas aller lors de la validation ciblée en fournissant des données phénotypiques de plus haute fidélité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons de Drosophila et les techniques de déchorionation.
- Dépend de l'accès aux huiles d'halocarbone et aux outils de base de microfabrication pour la préparation de la chambre.
- Exige une standardisation de l'âge des embryons, du génotype et de la cohérence du montage entre les utilisateurs.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation de la flottabilité dans l'huile et de la géométrie de la chambre.
- Limite pratique : convient mieux aux embryons qui restent flottants dans l'huile d'halocarbone ; n'est pas applicable aux types cellulaires plus denses ou adhésifs.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
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Title
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Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
