La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Hello.My nom est Bruce Reed. Je suis professeure adjointe au Département de biologie de l’Université de Waterloo à Waterloo, en Ontario, au Canada. Nous réalisons aujourd’hui cette archive vidéo pour documenter une nouvelle technique que nous avons développée pour préparer vos embryons doux pour l’analyse d’imagerie en direct.

Lors de l’analyse d’imagerie en direct à l’aide d’embryons de drosophile, nous utilisons fréquemment l’acquisition en accéléré, qui peut durer plusieurs heures. Par conséquent, il est important d’avoir une technique dans laquelle les embryons sont protégés de la déshydratation ainsi que de l’hypoxie. De plus, nous souhaitons également développer une technique qui éviterait toute compression de l’embryon.

En ce qui concerne le montage, nous avons mis au point une méthode très simple, bon marché et efficace que nous appelons la préparation de la goutte suspendue. La préparation de la goutte suspendue convient à l’analyse d’imagerie en direct d’embryons à l’aide de la stéréomicroscopie ou de tout microscope composé vertical. Cette vidéo en accéléré montre huit embryons exprimant la GFP préparés à l’aide du protocole de la goutte suspendue et imagés par microscopie à fluorescence time-lapse.

Cette séquence d’imagerie représente plus de quatre heures de temps écoulé. Le début du mouvement montre que ces embryons sont dans un état viable. Nous allons maintenant vous présenter une description détaillée, étape par étape, de la façon d’effectuer le protocole de dépôt suspendu.

Les embryons sont collectés sur du jus de raisin standard, des œufs ou des assiettes. À l’aide d’un collecteur d’œufs automatisé dsof FLA de l’équipement scientifique Fly max, le collecteur automatisé fournit des collections synchronisées d’embryons à un stade de développement prédéterminé. En préparation de la décoration à la main des embryons, un morceau de ruban adhésif double face est attaché à une lame de microscope et le support du ruban est retiré.

Le protocole de chute suspendue nécessite une chambre personnalisée fabriquée à partir d’une feuille de plastique polycarbonate de cinq millimètres d’épaisseur. La feuille est découpée aux dimensions d’une lame de microscope, et une dépression de trois millimètres de profondeur est réalisée à l’aide d’un rotor. L’humidification de la chambre d’imagerie en direct est réalisée à l’aide d’un morceau de tissu qui est coupé pour s’adapter au puits de la chambre et marié à de l’eau distillée.

L’huile Halo Carbon est idéale pour l’imagerie en direct des embryons de drosophile coordonnés, car elle est perméable aux gaz et optiquement claire. Le mélange de l’huile de carbone halo série 700 et série 56 dans un rapport de un à un permet d’obtenir une viscosité adaptée au travail avec des embryons de drosophile. Les embryons peuvent être prélevés dans les plaques de gélose au jus de raisin à l’aide d’une pince de bijoutier ou d’un pinceau très fin.

Les embryons se collent les uns aux autres et la pince pointe. Ils sont facilement rassemblés en touffes, des touffes d’embryons. Adhérence à la pince.

Les pointes sont doucement abaissées sur la surface collante du ruban adhésif sur la diapositive de décoration préalablement préparée. Tout en observant les embryons à l’aide d’un stéréomicroscope, poussez-les doucement ou caressez-les avec le côté de la pince. Vous devez ouvrir le corone sans rompre la membrane interne du vilin.

Cela nécessite une main ferme, de la patience et un peu de pratique. Une fois que le corone externe a été rompu, l’embryon déchloré a tendance à adhérer aux forceps. Veillez à ne pas laisser l’embryon déchloré entrer en contact avec la surface collante du ruban.

Il peut être très difficile de le récupérer de la bande rapidement transférée des embryons déchlorés dans le halo. De l’huile de carbone tombe sur la lamelle. C’est une bonne idée de le garder à proximité en touchant la pointe de la pince à la surface du halo Caron oil Drop.

Le transfert d’huile de l’embryon peut être confirmé à l’œil nu à l’aide d’un fond noir et d’une source d’éclairage à fibre optique réglée à un angle oblique avant de chlorer votre prochain embryon. Il est utile d’essuyer l’huile de vos pinces en raison de leur flottabilité dans l’huile de carbone halo. Les embryons coordonnés flottent à la surface de la gouttelette d’huile.

Nous pouvons contrôler la position et l’orientation des embryons en les poussant au fond de la gouttelette d’huile et en inversant rapidement la lamelle dans le protocole de la goutte suspendue. Nous inversons la lamelle sur le puits humidifié de la chambre d’imagerie en direct. Lorsque la lamelle est inversée, les embryons reposent contre les lamelles inférieures.

Les positions de repos des embryons peuvent être vérifiées au microscope stéréoscopique. Si elle n’est pas satisfaisante, la procédure peut être répétée. Une fois que les embryons se trouvent dans la position souhaitée, la lamelle est fixée à la chambre d’imagerie en direct à l’aide de ruban adhésif.

La chambre est ventilée par des trous découpés dans le ruban. Les embryons sont maintenant prêts à être imagés.