Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Cette procédure commence par la préparation d'une matrice de CP1 GFP en faisant d'abord croître une lignée de cellules, puis en transférant la matrice sur une plaque fraîche. En parallèle, préparez une copie fraîche de DMA. Ensuite, nous croisons la matrice ACP1 GFP avec le DMA et sélectionnons les diploïdes, qui sont ensuite sporulés sur un milieu de sporulation.

Cinq jours plus tard, les progénitures myotiques sont germinées sur un milieu LRK, sur lequel seules les cellules haploïdes MAT A peuvent croître. Après deux tours supplémentaires de sélection, nous obtenons des cellules haploïdes portant à la fois ACP1-GFP et un gène invalidé par la canamycine. Enfin, nous pouvons sélectionner des souches individuelles directement à partir de la boîte et observer la morphologie des mitochondries par microscopie confocale.

Bonjour, je suis Chap T du laboratoire Law, du Département de biologie cellulaire et développementale à l'Institut des sciences de la vie de l'Université de la Colombie-Britannique. Bonjour, je suis Jesse Chao, également du laboratoire Loan. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une méthode à haut débit permettant d'incorporer des marqueurs GFP dans divers fonds génétiques mutants chez la levure, en utilisant un système robotique.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la morphologie d'organites tels que D, le réticulum endoplasmique et les mitochondries. Commençons donc. Pour ce protocole, nous utilisons deux souches de levure différentes.

Un ACP1 GFP est une souche présentant une étiquette GFP en position C-terminale d'ACP1, générée par recombinaison homologue médiée par PCR à l'aide du plasmide PKT128. Le fond génétique de la souche est BY7043. Nous utilisons également la souche DMA ou matrice de mutants de délétion, qui correspond à une matrice d'environ 5 000 mutants de délétion de gènes non essentiels.

Tous ces gènes non essentiels ont été invalidés sur G quatre 18. Le fond génétique de la souche utilisée est BY 47 41. Pour commencer, cultivez des cellules de ACP un GFP en versant cinq millilitres d'une culture ACP un GFP de type « overnight » sur une boîte de gélose hiss.

Laisser sécher suffisamment la plaque à la flamme ou dans une hotte de sécurité biologique. Une fois sèche, incuber la plaque à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Après l'incubation, utiliser un robot pour répartir la souche A CP one GFP en 1 536 colonies par plaque.

Parallèlement, préparez une copie fraîche du DMA en transférant par réplica sur quatre plaques YPDG contenant 18 plaques. Incubez ensuite les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit, après la croissance des souches. Combinez une souche A CP un GFP avec le DMA en transférant par réplica et en recouvrant les colonies sur des plaques YPD, puis incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit.

Après l'incubation de la plaque de réplique, les colonies sur les plaques SD hiss G quatre 18 permettant de sélectionner les cellules transformées sont incubées à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Afin d'initier la sporulation et la germination à partir de la première plaque de réplique, les diploïdes sont transférés sur des plaques YPDG quatre 18 pour augmenter l'efficacité de la sporulation lors de l'étape suivante. Après une incubation d'un jour à 30 degrés Celsius, les diploïdes sont transférés par réplique sur un milieu de sporulation enrichi, contenant des concentrations réduites de sources de carbone et d'azote afin d'induire la formation de spores méiotiques.

Ensuite, incuber les boîtes à 25 degrés Celsius pendant un minimum de cinq jours. Après l'incubation, faire germer la pellicule, une descendance mitotique, en repiquant les colonies sur milieu LRK par la méthode du replica. Ce milieu induira la germination des cellules tabulaires à partir des spores ; incuber les boîtes à 30 degrés Celsius pendant deux jours afin de sélectionner les cellules portant à la fois l'allèle GFP et l'allèle muté simple.

Les cellules Matt A sont répliquées par repiquage sur milieu LADG418, qui sélectionne les cellules haploïdes portant la délétion du gène ; incuber ces plaques à 30 degrés Celsius pendant une nuit. Ensuite, effectuer un nouveau repiquage par réplication des progénitures mitotiques de mat A sur milieu L-H-R-K-G418 afin de sélectionner la croissance des mutants simples qui portent également ACP1-GFP, puis incuber une nuit à 30 degrés Celsius.

Les plaques peuvent ensuite être conservées à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à trois mois. Afin de visualiser les mutants souhaités exprimant une protéine de fusion GFP directement à partir de la plaque, commencez par sélectionner les colonies souhaitées sur les plaques. Faites croître les cellules à 30 degrés Celsius dans un milieu YPD ou SD hiss jusqu'à la phase exponentielle précoce.

Enfin, visualisez les mutants à l’aide de la microscopie confocale avec le jeu de filtres GFP. Dans cette image confocale, un mutant et un type sauvage portant le marqueur ACP1-GFP ont été observés par microscopie confocale afin d’étudier la morphologie des mitochondries. Ce mutant particulier présente un phénotype mitochondrial perturbé et constitue donc un bon candidat pour des investigations ultérieures. Nous vous avons ainsi montré comment intégrer efficacement un marqueur multiclonal, l’ACP1-GFP, dans un tableau de mutants de délétion en utilisant un système robotisé.

Lors de cette procédure, il est important de préparer le milieu fraîchement et de laisser suffisamment de temps pour qu'il sèche. Si le milieu est trop humide, une condensation se formera, augmentant ainsi le risque de contamination. En outre, vous devez vérifier attentivement que tous les milieux de sélection sont correctement préparés, car ils sont essentiels à ce protocole.

Cette procédure peut également être utilisée pour d'autres types de marqueurs. Par exemple, pour visualiser er, nous utilisons couramment le marqueur air 11 et GSP. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.