Name: Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez une méthode à haut débit pour étudier la morphologie des organites chez Saccharomyces cerevisiae en incorporant des marqueurs GFP. Cette approche permet de visualiser efficacement les mitochondries et d'autres structures cellulaires par microscopie confocale.

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Ce travail a été soutenu par la biotechnologie et des sciences biologiques du Conseil de recherches (subvention 31/C15982), les Instituts canadiens de recherche en santé, la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique, la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé (subvention pour CJR Loewen), et lutter pour la vue.

Matériel et méthodes: <ol><li> Les souches de levures: <ul><li> ACP1-GFP (GFP:: Sa): C-terminale de la GFP-tagging ACP1 a été générée par une PCR médiée par recombinaison homologue en utilisant pKT128 plasmide (contient GFP et His5). Les transformants positifs ont été confirmés par microscopie confocale et PCR sur colonie. Le fond souche a été BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratoire (Tong et Boone, 2006). </li><li> Suppression Mutant Array (DMA) (xxx:: KanR): c&#39;est un tableau d&#39;environ 5000 mutants de délétion de non-essentielles gènes. Tous ces gènes non essentiels ont été mis KO sur le G418. Le fond souche de la matrice est BY4741 (MATa his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Notre DMA était originaire de Boone laboratoire. </li></ul></li><li> Incorporer ACP1-GFP dans le DMA: Le protocole suivant pour faire une large GFP est adapté de l&#39;analyse synthétique génétiques (SGA) de la technologie (Tong et Boone, 2006) avec des modifications. Toutes les étapes épinglant répliques sont fait en utilisant un ROTOR Chanteur haute densité rangeant système robotisé. Alternativement, manuel épinglant ou un robot à base de liquide rangeant à haute densité peuvent être utilisés. Acronymes: YPD, extrait-peptone-levure et dextrose; SD, l&#39;abandon de synthèse; LRK, Lue / Arg / Lys abandon des médias; LHRK, Lue / Son / Arg / Lys abandon des médias Préparation <ol><li> Cultivez une pelouse de ACP1-GFP cellules en versant un 5 ml de nuit ACP1-GFP de la culture sur une plaque YPD. Laisser sécher la plaque suffisamment par une flamme ou dans une hotte biologique de fumées. </li><li> Incuber la plaque à 30 ˚ C la nuit. </li><li> Utiliser un robot, un tableau ACP1-GFP souche dans 1536 colonies par plaque. Dans le même temps, préparer une nouvelle copie du DMA en réplique épinglant au YPD + plaques G418. </li><li> Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit. L&#39;accouplement et la sélection des diploïdes </li><li> Maté la souche ACP1-GFP avec le DMA en épinglant répliques et plus de pose des colonies sur des plaques YPD. </li><li> Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit. </li><li> Réplique plaque des colonies sur SD - Son + plaques G418 pour sélectionner les cellules diploïdes (MATa / MATalpha). </li><li> Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit. Sporulationg et la germination </li><li> Réplique plaque des colonies sur des supports de sporulation diploïdes améliorés, qui contient des niveaux réduits de sources de carbone et d&#39;azote pour induire la formation de spores méiotiques. </li><li> Incuber les plaques à 25 ˚ C pendant un minimum de 5 jours. </li><li> Germer les descendances MATa méiotique par réplique-placage des colonies sur LRK médias et incuber les plaques à 30 ˚ C pendant deux jours. </li><li> Ce support va induire la germination des cellules haploïdes à partir de spores. Depuis un châssis ouvrant LUE2 lecture (ORF) est intégré au niveau du promoteur MATa spécifiques STE2, tous les haploïdes germé sera Mata. Sélection de deux allèles </li><li> Il est maintenant nécessaire de sélectionner à la fois l&#39;allèle GFP et l&#39;allèle mutant simple. Pour ce faire, les cellules MATa sont des répliques-plaqué sur LRK média G418 +, qui sélectionne les cellules haploïdes qui portent la délétion du gène (xxx:: kanR). </li><li> Incuber les plaques à 30 ˚ C la nuit. </li><li> Enfin, les descendances MATa méiotique sont des répliques-plaqué sur LHRK média G418 + pour sélectionner à la croissance des mutants simples (xxx:: kanR) a également héberger ACP1-GFP (GFP:: Sa). Ces plaques peuvent être conservés à 4 ˚ C pour un maximum de 3 mois. </li></ol> Le protocole suivant pour faire une large GFP est adapté de l&#39;analyse synthétique génétiques (SGA) de la technologie (Tong et Boone, 2006) avec des modifications. Toutes les étapes épinglant répliques sont fait en utilisant un ROTOR Chanteur haute densité rangeant système robotisé. Alternativement, manuel épinglant ou un robot à base de liquide rangeant à haute densité peuvent être utilisés. Acronymes: YPD, extrait-peptone-levure et dextrose; SD, l&#39;abandon de synthèse; LRK, Lue / Arg / Lys abandon des médias; LHRK, Lue / Son / Arg / Lys abandon des médias Préparation </li><li> Microscopie: <ol><li> Choisissez le mutant désiré (s) exprimant ACP1-GFP directement à partir de la plaque. </li><li> Cultiver des cellules à 30 ° C dans YPD ou SD - Son médias pour la phase log tôt. </li><li> Visualisez par microscopie confocale en utilisant les filterset GFP. Un exemple de résultat attendu est de montrer dans la figure 1. </li></ol></li></ol> SGA médias: Les milieux de croissance (YPD) et les médias en sélectionnant (SD) utilisé dans ce protocole est couramment utilisé en biologie moléculaire de la levure. S&#39;il vous plaît se référer aux méthodes dans la levure (Amberg et al., 2005) pour une description détaillée. LRK LHRK médias (pour 400 ml au total) <table border="0"><tbody><tr><td> Ajouter dans l&#39;ordre </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Base de levure azoté avec du sulfate d&#39;ammonium </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> D&#39;acides aminésmélangez </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> Dextrose à 20% </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Refroidir à 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mélangez, versez 50 ml par plaque </td></tr></tbody></table> LRK LHRK + G418 médias (pour 400 ml au total) <table border="0"><tbody><tr><td> Ajouter dans l&#39;ordre </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Base de levure azotés, sans sulfate d&#39;ammonium </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Mélange d&#39;acides aminés </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Glutamate monosodique </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> Dextrose à 20% </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Refroidir à 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mélangez, versez 50 ml par plaque </td></tr></tbody></table> Enrichi sporulation médias (pour 400 ml au total) <table border="0"><tbody><tr><td> Ajouter dans l&#39;ordre </td><td> Montant </td></tr><tr><td> L&#39;acétate de potassium </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> L&#39;extrait de levure </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Mélange d&#39;acides aminés sporulation </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Refroidir à 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml de G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mélangez, versez 50 ml par plaque </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Cette méthode peut aider à intégrer efficacement un marqueur mitochondrial, ACP1-GFP dans différents milieux mutant. Elle s&#39;appuie sur l&#39;utilisation d&#39;un système robotique, et peut facilement adoptées pour une utilisation avec n&#39;importe quel système robotisé. Cette procédure peut également être utilisé pour intégrer d&#39;autres types de marqueurs. Par exemple, pour visualiser les ER, nous avons l&#39;habitude utiliser le marqueur Erg11-GFP. Dans nos images représentant, un mutant et une de type sauvage ...

<table><tbody><tr><td>Milieu SGA</td><td></td><td></td><td>Les milieux de croissance (YPD) et les milieux synthétiques de privation (SD), y compris LRK et LHRK, ainsi que le milieu de sporulation enrichi utilisés dans ce protocole sont couramment employés en biologie moléculaire des levures. Veuillez consulter Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) pour des descriptions détaillées.</td></tr></tbody></table>

une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

À haut débit des méthodes pour examiner la localisation des protéines ou de la morphologie organite est un outil efficace pour étudier les interactions entre protéines et peuvent contribuer à atteindre une compréhension globale des mécanismes moléculaires. Chez Saccharomyces cerevisiae, avec le développement de la matrice non essentiels du gène de suppression, on peut globalement étudier la morphologie des organites différents comme le réticulum endoplasmique (RE) et de la GFP en utilisant les mitochondries (ou une variante)-marqueurs dans les antécédents de gènes différents. Cependant, les marqueurs de la GFP incorporant dans chaque mutant unique est individuellement un processus laborieux. Ici, nous décrivons une procédure qui est couramment utilisée dans notre laboratoire. En utilisant un système robotisé pour manipuler des tableaux de la levure de haute densité et des techniques de sélection des médicaments, nous pouvons raccourcir considérablement le temps requis et d&#39;améliorer la reproductibilité. En bref, nous traversons un marqueur GFP-taggés mitochondrial (APC1-GFP) à un tableau à haute densité de 4672 mutants de délétion du gène non essentiel par la robotique réplique épinglage. Grâce à la sélection diploïdes, la sporulation, la germination et la sélection marqueur duel, nous retrouvons les deux allèles. En conséquence, chaque mutant haploïde unique contient APC1-GFP incorporé à son locus génomiques. Maintenant, nous pouvons étudier la morphologie des mitochondries dans toutes les antécédents non essentiels mutant. Grâce à cette approche haut débit, nous pouvons facilement étudier et délimiter les voies et les gènes impliqués dans l&#39;héritage et la formation d&#39;organites dans un cadre à l&#39;échelle du génome.

GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Les méthodes à haut débit permettant d'examiner la localisation des protéines ou la morphologie des organites constituent un outil efficace pour étudier les interactions protéiques et peuvent aider...

Cette procédure commence par la préparation d'une matrice de CP1 GFP en faisant d'abord croître une lignée de cellules, puis en transférant la matrice sur une plaque fraîche. En parallèle, préparez une copie fraîche de DMA. Ensuite, nous croisons la matrice ACP1 GFP avec le DMA et sélectionnons les diploïdes, qui sont ensuite sporulés sur un milieu de sporulation.Cinq jours plus tard, les progénitures myotiques sont germinées sur un milieu LRK, sur lequel seules les cellules haploïdes MAT A peuvent croître. Après deux tours supplémentaires de sélection, nous obtenons des cellules haploïdes portant à la fois ACP1-GFP et un gène invalidé par la canamycine. Enfin, nous pouvons sélectionner des souches individuelles directement à partir de la boîte et observer la morphologie des mitochondries par microscopie confocale.Bonjour, je suis Chap T du laboratoire Law, du Département de biologie cellulaire et développementale à l'Institut des sciences de la vie de l'Université de la Colombie-Britannique. Bonjour, je suis Jesse Chao, également du laboratoire Loan. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une méthode à haut débit permettant d'incorporer des marqueurs GFP dans divers fonds génétique

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Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule...

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Une approche robuste pour surveiller la prestation des organites à la lumière acide de la vacuole de la levure pour la dégradation et le recyclage est décrite. La méthode repose sur le marquage spécifique des organites cibles avec un codées génétiquement double-émission de fluorescence pH-biocapteur, et la visualisation des cellules individuelles en utilisant la microscopie à fluorescence.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Ce protocole décrit l'analyse des compartiments intracellulaires étiquetés fluorescents dans la levure en herbe utilisant la microscopie confocale 4D multicolore (time-lapse 3D). Les paramètres d'imagerie sont choisis pour capturer des signaux adéquats tout en limitant les dégâts photo. Les plugins Custom ImageJ permettent de suivre et d'analyser quantitativement les structures étiquetées.

Microscopie 4D de levure

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

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Imagerie en direct à haut débit des microcolonies pour mesurer l’hétérogénéité de la croissance et de l’expression des gènes

Malgré les progrès récents, de nombreuses protéines mitochondriales de levure restent encore avec leurs fonctions complètement inconnues. Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour déterminer la localisation de la soumissionochondriale des protéines, ce qui a été fondamental pour l’élucidation de leurs fonctions moléculaires.

Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

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