Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Cette procédure commence par la préparation d’un réseau d’un CP un GFP en cultivant d’abord une ligne de cellules, puis en épinglant le réseau sur une plaque fraîche. En même temps, préparez une nouvelle copie de DMA. Ensuite, nous accoupleons la matrice GFP ACP one au DMA et sélectionnons les diploïdes, qui sont ensuite spoulés sur un milieu de sporulation.

Cinq jours plus tard, la descendance de Myotic germe sur un milieu LRK, sur lequel seul MAT A haplos poussera. Grâce à deux cycles de sélection supplémentaires, nous récupérons des cellules haplologiques porteuses à la fois de l’ACP, d’une GFP et d’un gène knock-out sur la mycine. Enfin, nous pouvons prélever des souches individuelles directement sur la plaque et observer la morphologie des mitochondries par microscopie confocale.

Bonjour, je suis Chap T du laboratoire de droit du Département de biologie cellulaire et du développement de l’Institut des sciences de la vie de l’Université de la Colombie-Britannique. Bonjour, je m’appelle Jesse Chao, je travaille également au Loan Lab. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une méthode à haut débit pour incorporer des marqueurs GFP dans divers contextes mutants chez la levure à l’aide d’un système robotisé.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la morphologie d’organites tels que D, le réticulum endoplasmique et les mitochondries. Alors commençons. Pour ce protocole, nous utilisons deux souches de levures différentes.

Une GFP CP one est une souche avec un marquage GFP terminal C de l’ACP, qui est générée par une recombinaison homologue médiée par PCR à l’aide du plasmide PKT 1 28. Le fond de souche est BY 7 0 4 3. Nous utilisons également la souche DMA ou le réseau de mutants de délétion, qui est un réseau d’environ 5 000 mutants de délétion de gènes non essentiels.

Tous ces gènes non essentiels ont été éliminés au G 4 18. Le fond de déformation du réseau est BY 47 41. Pour commencer, cultivez Alan de cellules ACP One GFP en versant cinq millilitres de culture ACP one GFP pendant la nuit sur une plaque sifflante.

Laissez la plaque sécher suffisamment à la flamme ou dans une hotte biologique. Une fois sèche, incubez la plaque à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, à l’aide d’un robot, la souche A CP one GFP est disposée en 1 536 colonies par plaque.

En même temps, préparez une nouvelle copie du DMA en répliquant l’épinglage à YPDG de quatre 18 plaques. Ensuite, incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit après la croissance des souches. Fabrication de la souche A CP one GFP avec le DMA en répliquant l’épinglage et la superposition des colonies sur des plaques YPD, incubez les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’incubation de la réplique de la plaque, les colonies sous SD siffle G quatre 18 plaques afin de sélectionner les cellules déployées, incubent les plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit. Afin de commencer la sporulation et la germination, la première réplique de la plaque, les diploïdes sur YPDG quatre 18 plaques pour augmenter l’efficacité de la sporulation à l’étape suivante. Après avoir incubé à 30 degrés Celsius pour une réplique d’une plaque d’une journée, les diploïdes sur un milieu de sporulation amélioré, qui contient des niveaux réduits de sources de carbone et d’azote pour induire la formation de spores myotiques.

Ensuite, incubez les plaques à 25 degrés Celsius pendant au moins cinq jours. Après l’incubation, germer le tapis, une progéniture myotique en plaçant les colonies sur le milieu LRK. Ce milieu induira la germination des cellules tabloïds à partir des spores, incubera les plaques à 30 degrés Celsius pendant deux jours afin de sélectionner des cellules portant à la fois l’allèle GFP et l’allèle mutant unique.

Les cellules Matt A sont répliquées sous la couche G quatre 18 milieux, qui sélectionne pour les cellules haplo porteuses de la délétion du gène, incubent ces plaques à 30 degrés Celsius pendant la nuit. La prochaine réplique de la plaque, le tapis, une descendance miotique sur L-H-R-K-G quatre 18 milieux pour sélectionner la croissance de mutants uniques. C’est également là que l’ACP incube une GFP pendant la nuit à 30 degrés Celsius.

Les plaques peuvent ensuite être stockées à quatre degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à trois mois. Afin de visualiser les mutants souhaités exprimant une CP une GFP directement à partir de la plaque, commencez par choisir les colonies souhaitées à partir des plaques. Cultivez les cellules à 30 degrés Celsius et le sifflement YPD ou SD jusqu’à la phase logarithmique.

Enfin, visualisez un mutant à l’aide de la microscopie confocale avec le filtre GFP défini dans cette image confocale, un mutant et un type sauvage avec l’ACP un marqueur GFP ont été visualisés par microscopie confocale pour étudier la morphologie des mitochondries. Ce mutant particulier présente un phénotype mitochondrial perturbé et est donc un bon candidat pour une étude plus approfondie. Nous devons vous avoir montré comment incorporer efficacement un marqueur multiclonal, un CP et un GFP dans le réseau de mutants de délétion en utilisant un système robotique.

Lors de cette procédure, il est important de préparer le support fraîchement et de laisser l’endroit avoir suffisamment de temps pour sécher. S’il y a trop de condensation humide, la condensation s’accumulera, ce qui augmentera le risque de contamination. De plus, vous devez vérifier que tous les supports de sélection sont correctement effectués, car ils sont essentiels à ce protocole.

Cette procédure peut également être utilisée pour d’autres types de marqueurs. Par exemple, pour visualiser, nous utilisons régulièrement le marqueur air 11 et GSP. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.