Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Cette procédure nous permet de déterminer les profils d'expression génique dans les embryons de poisson zèbre avec une résolution élevée. Une sonde ribo antisens est hybridée à l'ARNm cible complémentaire. La sonde Ribo marquée est reconnue par un anticorps conjugué à une enzyme peroxydase ; un composé fluoro quatre conjugué à de l'aramide est ajouté aux embryons, et la peroxydase convertit l'IDE en un composé hautement réactif. Cela conduit à un dépôt stable du fluoro quatre ; l'IDE non lié est ensuite éliminé par lavage, révélant ainsi le profil détaillé de distribution de l'ARNm au niveau sous-cellulaire.

L'expression d'un deuxième gène peut être observée à l'aide d'une sonde marquée de manière distincte et d'une autre fluorochrome, permettant une comparaison détaillée de l'expression. Bonjour, je suis Tim Brent du laboratoire de Scott Holly au Département de biologie moléculaire, cellulaire et du développement de l'Université de Yale. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'hybridation in situ double fluorescente en montage entier à haute résolution sur des embryons de poisson zèbre dans tout laboratoire.

Nous utilisons cette procédure pour étudier la segmentation du poisson zèbre. Commençons donc. Commencez la procédure avec des embryons fixés toute la nuit au froid dans du paraformaldéhyde.

L'utilisation d'un stock fraîchement décongelé de paraformaldéhyde pour cette fixation est essentielle pour une coloration réussie. Éliminer la solution de fixation et laver les embryons à température ambiante deux fois pendant cinq minutes chacune dans du PBS. Ensuite, retirer la choriocelle des embryons.

Les embryons sont placés dans des plaques en verre à cavités. À l'aide de pinces de bijoutier, retirez le Corian à partir de maintenant. Utilisez une pipette Pasteur en verre polie à la flamme pour transférer les embryons.

Sinon, les embryons adhéreront aux embouts ordinaires en polypropylène. Les embryons déchlorés sont transférés à travers une série de lavages dont la concentration en méthanol augmente progressivement. Le dernier lavage s'effectue dans du méthanol à 100 %.

Enfin, les embryons sont placés dans du méthanol frais et conservés à moins 20 degrés pendant toute la nuit. Le jour suivant, transférez les embryons à travers une série de lavages dont la concentration en méthanol diminue progressivement, puis effectuez deux lavages avec du tampon PBST de cinq minutes chacun. Ensuite, fixez les embryons au paraformaldéhyde pendant 20 minutes.

Terminer la fixation courte par deux lavages au PBST de cinq minutes chacun. Nous sommes maintenant prêts à rendre perméables les embryons. Les embryons fixés deviennent perméables par une incubation avec la protéine ACE K. Veiller à placer le tube de microcentrifugeuse sur le côté.

La durée de l'étape de digestion dépend de l'âge de l'embryon. Par exemple, les embryons au stade de somato-agenèse sont incubés de trois à quatre minutes. Rincer brièvement dans du PBST et effectuer un lavage dans du PBST pendant cinq minutes.

Fixer les embryons dans du paraformaldéhyde. Laver enfin les embryons deux fois dans du PBST pendant cinq minutes. Les embryons sont maintenant prêts pour l'hybridation avec les sondes ARN.

À présent que nous avons fixé et rendu perméables les embryons, nous commençons le processus d'hybridation par une incubation de cinq minutes en milieu haut moins à 65 degrés Celsius. N'oubliez pas de préchauffer la solution HIIN avant utilisation. Ensuite, incubez les embryons en milieu haut plus pendant une heure.

Encore une fois, n'oubliez pas de préchauffer la solution high plus. Retirez à présent la majeure partie de la solution hip plus, mais laissez 50 microlitres, en veillant à ce que les embryons soient complètement immergés. Ajoutez un microlitre de chaque sonde et mélangez en tapotant doucement le tube.

Couvrir les tubes avec du papier d'aluminium à partir de maintenant. Étant donné que la fluorescéine est sensible à la lumière, incuber toute la nuit à 65 degrés Celsius ; l'hybridation est alors terminée. Supprimons donc les sondes en excès à partir de maintenant.

Le détergent est éliminé afin d'améliorer la coloration. Toutefois, observez que les embryons deviennent collants en l'absence de détergent. Rincer deux fois avec une solution de 50 % de formamide et de deux XSSC pendant 30 minutes à chaque fois.

Lavez une fois avec une solution XSSC deux fois pendant 15 minutes. Enfin, lavez deux fois avec une solution SSC 0,2 fois pendant 30 minutes à chaque fois. Ensuite, nous visualiserons chaque sonde.

Nous pouvons maintenant commencer la détection des sondes hybridées. Détectez d'abord la sonde fluorescéine car elle est moins stable et plus faible que la sonde dig oxygène. Bloquez d'abord avec 500 microlitres de réactif de blocage à 2 % dans un tampon d'acide maléique pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, ajoutez l'anticorps anti-fluorescéine conjugué à la peroxydase à une dilution de un pour 500 dans la solution de blocage. Incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Veillez à placer le tube de microcentrifugeuse sur le côté.

Ensuite, démarrez la détection à l'aide du système d'amplification du signal tyrom ou TSA. TYROM IDE est conjugué à un fluorochrome quatre. La peroxydase de raifort présente sur l'anticorps convertit le TY IDE en un intermédiaire hautement réactif. L'intermédiaire TY IDE réactif forme une liaison covalente avec les résidus situés en proximité immédiate de l'anticorps, entraînant un dépôt localisé du fluorochrome quatre.

Commencez par quatre lavages de 20 minutes chacun avec un tampon acide maléique 1 x à température ambiante, suivis de deux lavages dans du PBS. Le fluorescéine TY IDE avait été précédemment dissous dans du DMSO pour le stockage. Effectuez une courte centrifugation de ce substrat TSA.

Ensuite, diluez le substrat TSA au 1/50 dans le tampon de dilution d'amplification. Ajoutez la solution aux embryons et incubez pendant 45 minutes. Placez le tube de microcentrifugeuse sur le côté.

Au cours de cette étape d'incubation, transférez les embryons à travers une série de lavages de 10 minutes à concentration croissante de méthanol. Le dernier lavage dure 10 minutes dans du méthanol à 100 %, puis incubez pendant 30 minutes dans une solution contenant 1 % de peroxyde d'hydrogène afin d'inactiver la peroxydase présente sur l'anticorps. Sinon, celle-ci pourrait interférer avec la détection de l'oxygène dig.

Transférez les embryons à l’aide d’une sonde à travers une série de lavages dont la concentration en méthanol diminue progressivement, puis effectuez deux lavages avec du tampon PBS de 10 minutes chacun. Cette procédure garantit l’élimination complète du méthanol. Le marquage par anticorps de la dig xigène et de la sonde commence par une étape de blocage, comme pour l’anticorps précédent.

Ensuite, ajoutez l'anticorps anti-digoxigénine à une dilution de un pour 1000. Placez le tube de microcentrifugeuse sur le côté et incubez toute la nuit au froid jusqu'au lendemain. Lavez à température ambiante avec un tampon d'acide maléique.

Ensuite, à l’aide de PBS quickpin, le substrat tyrom SCI cinq. Diluez-le au 1/50 et ajoutez-le aux embryons. Incubez pendant 45 minutes en plaçant le tube sur le côté.

Enfin, effectuez trois lavages dans du PBST. Une étape finale de coloration avec l'iodure de propidium marque les noyaux. Commencez par deux lavages de cinq minutes chacun dans du deux XSSC.

Ensuite, traitez avec les ARN pendant 30 minutes à 37 degrés. Lavez six fois dans du 2 XSSC à température ambiante, puis ajoutez la solution d'iodure de propidium et laissez colorer pendant huit minutes. Lavez six fois dans du 2 XSSC.

Fixer les embryons dans du paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Enfin, deux lavages de cinq minutes dans du PBST. Le montage des embryons pour l'observation commence par deux incubations de 10 minutes dans du glycérol à 25 % et à 50 %.

Ensuite, placez les échantillons dans du glycérol à 75 % et incubez-les toute la nuit à quatre degrés Celsius. Cette étape de clarification nocturne facilite la dissection des embryons. Enfin, disséquez et retirez le vitellus des embryons.

Afin de réduire la fluorescence de fond, montez à plat les embryons sur une lame de microscope et examinez-les au microscope. Ces images montrent une section confocale unique à l'extrémité postérieure d'un embryon de poisson zèbre au stade 10 So mite. La coloration rouge montre l'ARNm de delta C détecté à l'aide d'une sonde marquée à l'oxygène dig et d'un réactif TSA sci-fi.

La coloration verte représente son ARNm détecté à l'aide d'une sonde marquée avec la fluorescéine. Et les noyaux colorés avec le réactif TSA fluorescéine sont teintés en bleu par l'iodure de propidium dans un embryon doublement coloré.

Les régions d'expression distinctes ou chevauchantes peuvent être déterminées sans ambiguïté. Cette procédure révèle la localisation subcellulaire de l'ARNm, comme on peut le voir sur ces vues rapprochées de sa coloration. La transcription active du gène est révélée par des points de coloration dans le noyau.

D'autres cellules présentent une localisation cytoplasmique de l'ARNm. Dans l'embryon doublement coloré, on peut observer des cellules qui transcrivent les deux gènes ou l'un ou l'autre des gènes.

Séparément, nous venons de vous montrer comment réaliser une hybridation in situ double fluorescente, à haute résolution, sur des embryons de poisson zèbre en montage entier. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler que nous testons d'abord nos sondes à l'aide de sondes de coloration classiques médiées par la phosphatase alcaline : les sondes donnant un signal net et intense fonctionneront bien en fluorescence in situ.

Nous avons également utilisé avec succès la localisation immunohistochimique de la bêta-caténine en remplacement de la coloration par l'iodure de propidium. Lorsque nous réalisons cette variante, nous effectuons les réactions d'hybridation à 55 degrés Celsius au lieu de 65. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.