Name: Banques de cerveaux: Tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons cérébraux pour la cryostatie et l'importance de l'échantillonnage systématique dans les banques de cerveaux. Cette méthode préserve le matériel biologique pour l'analyse stéréologique non biaisée.

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Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu.

Partie 1: Pré-traitement des tissus <ol><li> Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d&#39;autres organes. Dans l&#39;étude actuelle, l&#39;objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu&#39;à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre). </li><li> Le cerveau doit être bloquée stéréotaxique, retiré du crâne, pesés, et volume déterminé 2. Le tissu doit ensuite être cryoprotégés dans les solutions de saccharose gradué avec une concentration finale de saccharose à 30% dans un tampon phosphate. Les blocs de tissus devrait ensuite être congelé dans l&#39;isopentane à -65 ° C et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que vous êtes prêt à trancher. </li></ol> Partie 2: Échantillonnage systématique <ol><li> L&#39;échantillonnage systématique s&#39;appuie sur un bon plan avant la coupe. L&#39;ensemble de la région d&#39;intérêt dans les deux degrés rostrale-caudale et dorsale-ventrale doit être bien défini. Un atlas stéréotaxique de l&#39;espèce dans l&#39;utilisation est utile de définir la région d&#39;intérêt et de déterminer la longueur de la région d&#39;intérêt. Une fois la longueur de la région d&#39;intérêt est déterminé, il est nécessaire d&#39;établir l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage. Par exemple, à partir de l&#39;atlas stéréotaxique vous constatez que l&#39;ensemble rostro-caudale étendue de la région d&#39;intérêt est d&#39;environ 3 mm de longueur lors de sectionnement dans le plan coronal. Vous décidez alors de mettre le cryostat à la section 50 microns au, à ce rythme vous aurez 60 sections couvrant l&#39;étendue rostrale-caudale de la région d&#39;intérêt. Pour une étude typique stéréologiques impartiale 6-10 sections systématiquement échantillonnés sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dans cet exemple 10 sections équidistantes à travers le résultat mesure rostro-caudale dans un intervalle d&#39;échantillonnage de 1 / 6 sections. </li></ol> Partie 3: Création de la banque de cerveaux <ol><li> Une fois la fréquence d&#39;échantillonnage section a été déterminée, la prochaine étape est de déterminer ce qui taches seront effectuées immédiatement. Par exemple, si vous êtes coloration au crésyl violet vous allez capturer sixième sections sur une diapositive. Ce sera la série 1. Si vous savez qu&#39;il ya peut-être plusieurs anticorps potentiels que vous souhaitez courir, mais soit souhaitez voir les données que votre principale fournit une teinture ou n&#39;ont tout simplement pas le temps d&#39;effectuer l&#39;immunohistochimie, placer le solde de 5 séries de sections dans l&#39;ordre où elles ont été tranchés en préserver les puits contenant l&#39;antigène (1 polyvinylpyrrolidone%, l&#39;éthylène glycol de 50% dans o.1M PBS, pH 7,4). Le tableau ci-dessous donne un schéma d&#39;échantillonnage composé d&#39;une lame et une plaque (standard plaque à 48 puits) de sections dans le cadre d&#39;une banque de cerveaux (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. La fréquence d&#39;échantillonnage la section est ici de 1 / 6. La première section est placée sur une lame pour la coloration de violet de crésyl et les 5 prochaines sections sont placées dans des antigènes préserver. 7 Numéro de section est ensuite capturé sur la diapositive et les sections 9-12 sont placés dans des antigènes préserver. Ce cycle est répété jusqu&#39;à ce que la région d&#39;intérêt ou de bloc de tissu est sectionné de façon exhaustive. </li><li> La prochaine étape est de manière exhaustive la section du bloc de tissu. Placer une petite quantité d&#39;intégrer support sur le mandrin et laisser geler. Placez le mandrin dans la tête de microtome et raser assez du milieu congelé pour avoir une surface plane. Retirez le mandrin de la tête et le lieu microtome à plat dans le cryostat. Verser intégrant support sur le mandrin et fermement placer le bloc du cerveau avec le côté coupé stéréotaxique positionnés à plat sur le mandrin. Lentement et complètement intégrer le cerveau en milieu de montage. Placez le mandrin avec le cerveau dans la tête de microtome et la section en utilisant les paramètres pré-déterminé pour la fréquence d&#39;échantillonnage article. </li><li> Une fois le bloc de tissu a été sectionné et exhaustive sections sont placées dans des puits, recouvrir la plaque avec le couvercle, le couvercle envelopper avec du parafilm, et placer dans un congélateur à -20 ° C. Connexion au nombre total de sections prises pour chaque série, l&#39;intervalle de la section d&#39;échantillonnage et le nombre de séries pour chaque animal. Ce journal sera vital de garder la trace de l&#39;élimination ultérieure des sections de la banque de cerveaux pour l&#39;immunohistochimie avenir. </li></ol> Partie 4: Résultats du représentant: L&#39;échantillonnage systématique de cette manière a été une pratique courante dans notre laboratoire pour les 3 dernières années. Nous avons eu beaucoup de succès immunohistochimie effectuer sur le matériel qui a été stocké dans antigène préserver trois ans après qu&#39;il a été tranché sans détérioration du signal (figure 1). Par ailleurs, dans le cadre de notre banque de cerveaux que nous avons enregistré près de 20 000 sections systématique des non-humainscerveau de primate (figure 2) dans le cadre de nos plans de recherche à long terme. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figure 1. Ceci est une section du pôle occipital du primate non humain immunocolorées pour NeuN montrant deux couches VI et interstitielle neurones de la substance blanche. Cette section particulière a été stocké dans antigène conserver à -20 ° C pendant une période de 2 ans. Barre d&#39;échelle = 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figure2" /> Figure 2. Notre banque de cerveaux vervet se compose désormais de près de 20 000 sections systématiques de plus de 30 singes.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;échantillonnage systématique est une méthode peu coûteuse destinée à optimiser le matériel de recherche. Cette stratégie d&#39;échantillonnage est conçu pour se conformer aux règles du stéréologie impartiale qui nécessite un échantillonnage systématique de toute la région. Il est essentiel que l&#39;ordre des sections pour chaque série est maintenue. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé avec succès cette méthode pour les services bancaires à la fois de hamster et non-humains des coupes de cerveau de primate....

<table><tbody><tr><td>Glycol éthylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d'inclusion Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

banques de cerveaux: tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Stéréologie impartiale est une méthode précise et efficace pour l&#39;estimation du nombre de neurones totale (ou autre type cellulaire) dans une zone donnée d&#39;intérêt<sup&gt; 1</sup&gt;. Pour atteindre cet objectif de 60 à 10 sections systématiques devraient être sondé couvrant toute la structure. Typiquement, cela implique un traitement cinquième sections qui laisse une quantité importante de matières non traitées. Afin de maximiser le matériel, nous proposons une méthode peu coûteuse pour la préservation des tissus fixés dans le cadre d&#39;un plan de stockage à long terme de recherche. Comme le tissu est découpé et traité pour la teinture ou désiré d&#39;anticorps, les articles de remplacement devrait être systématiquement placés dans des antigènes conserver à -20 ° C pour le traitement futur. En utilisant des plaques 24 puits, les articles peuvent être placés dans l&#39;ordre pour une récupération future. En utilisant cette méthode, les tissus peuvent être stockées et traitées pour l&#39;immunohistochimie au cours de l&#39;année.

Banques de cerveaux et l&#39;échantillonnage systématique de matériel biologique fournit la base pour stéréologie impartiale et maximise le potentiel des données obtenues de chaque spécimen.

Banques de cerveaux: Tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche

La stéréologie non biaisée est une méthode permettant d'estimer avec précision et efficacité le nombre total de neurones (ou d'un autre type cellulaire) dans une zone d'intérêt donnée1. Pour...

Pour commencer cette procédure, le bloc cérébral doit être préparé pour le microtome cryostat et la fréquence d'échantillonnage des sections doit être déterminée. Ensuite, la préservation de l'antigène et les lames doivent être préparées. Le bloc cérébral doit être placé sur le mandrin à l'intérieur du cryostat.Une fois que le cerveau est solidement inclus dans la section du mandrin à une épaisseur prédéfinie, des sections systématiques doivent être réalisées de sorte qu'une série soit placée sur une lame, et que les séries suivantes soient placées dans des puits préremplis de conservateur d'antigène. Une fois le bloc épuisé, placez la plaque dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius dans le cadre de votre banque de cerveaux. Bonjour, je suis le Dr Mark Burke du Laboratoire de neurosciences visuelles de l'École d'optométrie de l'Université de Montréal.Bonjour, je suis le Dr Shahin Zur, également du Laboratoire des neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Mo Petto, directeur du Laboratoire des neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Mon�treal. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure p

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Biology

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Nous décrivons un modèle de rat de trouble de stress post-traumatique (SSPT) qui révèle les altérations persistantes dans la fonction neuroendocrine et le retard à long terme, l'intervention crainte exagérée, caractéristiques des patients SSPT. Le modèle animal et les méthodes décrites ici sont utiles pour corréler des biomarqueurs dans les noyaux du cerveau, qui sont mécaniste, mais ne peut pas être mesurée chez les patients avec des biomarqueurs en globules blancs périphériques, ce qui peut.

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La vidéo montre une procédure étape par étape pour disséquer symétriquement un cerveau humain post-mortem fixe, en préparant des blocs de tissus plus petits pour une analyse plus approfondie.

Coupe bihémisphérique symétrique du cerveau humain post-mortem

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

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