Name: Banques de cerveaux: Tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons cérébraux pour la cryostatie et l'importance de l'échantillonnage systématique dans les banques de cerveaux. Cette méthode préserve le matériel biologique pour l'analyse stéréologique non biaisée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs tiennent à remercier pour son Ikiel Ptito appui technique continu.

Partie 1: Pré-traitement des tissus <ol><li> Les tissus doivent être bien perfusés avec du paraformaldéhyde, glutaraldéhyde, ou du formol. Ceci peut être réalisé grâce à la perfusion transcardial norme généralement utilisée pour la récolte d&#39;autres organes. Dans l&#39;étude actuelle, l&#39;objet a été profondément sédatés avec le chlorhydrate de kétamine (10 mg / kg, im), euthanasiés avec une overdose de pentobarbital sodique (25 mg / kg, iv) et perfusé transcardiaque avec PBS 0,1 M jusqu&#39;à ce que complètement exsangue. Il est suivi par une solution de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 5 min (~ 1 litre). </li><li> Le cerveau doit être bloquée stéréotaxique, retiré du crâne, pesés, et volume déterminé 2. Le tissu doit ensuite être cryoprotégés dans les solutions de saccharose gradué avec une concentration finale de saccharose à 30% dans un tampon phosphate. Les blocs de tissus devrait ensuite être congelé dans l&#39;isopentane à -65 ° C et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que vous êtes prêt à trancher. </li></ol> Partie 2: Échantillonnage systématique <ol><li> L&#39;échantillonnage systématique s&#39;appuie sur un bon plan avant la coupe. L&#39;ensemble de la région d&#39;intérêt dans les deux degrés rostrale-caudale et dorsale-ventrale doit être bien défini. Un atlas stéréotaxique de l&#39;espèce dans l&#39;utilisation est utile de définir la région d&#39;intérêt et de déterminer la longueur de la région d&#39;intérêt. Une fois la longueur de la région d&#39;intérêt est déterminé, il est nécessaire d&#39;établir l&#39;intervalle d&#39;échantillonnage. Par exemple, à partir de l&#39;atlas stéréotaxique vous constatez que l&#39;ensemble rostro-caudale étendue de la région d&#39;intérêt est d&#39;environ 3 mm de longueur lors de sectionnement dans le plan coronal. Vous décidez alors de mettre le cryostat à la section 50 microns au, à ce rythme vous aurez 60 sections couvrant l&#39;étendue rostrale-caudale de la région d&#39;intérêt. Pour une étude typique stéréologiques impartiale 6-10 sections systématiquement échantillonnés sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dans cet exemple 10 sections équidistantes à travers le résultat mesure rostro-caudale dans un intervalle d&#39;échantillonnage de 1 / 6 sections. </li></ol> Partie 3: Création de la banque de cerveaux <ol><li> Une fois la fréquence d&#39;échantillonnage section a été déterminée, la prochaine étape est de déterminer ce qui taches seront effectuées immédiatement. Par exemple, si vous êtes coloration au crésyl violet vous allez capturer sixième sections sur une diapositive. Ce sera la série 1. Si vous savez qu&#39;il ya peut-être plusieurs anticorps potentiels que vous souhaitez courir, mais soit souhaitez voir les données que votre principale fournit une teinture ou n&#39;ont tout simplement pas le temps d&#39;effectuer l&#39;immunohistochimie, placer le solde de 5 séries de sections dans l&#39;ordre où elles ont été tranchés en préserver les puits contenant l&#39;antigène (1 polyvinylpyrrolidone%, l&#39;éthylène glycol de 50% dans o.1M PBS, pH 7,4). Le tableau ci-dessous donne un schéma d&#39;échantillonnage composé d&#39;une lame et une plaque (standard plaque à 48 puits) de sections dans le cadre d&#39;une banque de cerveaux (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. La fréquence d&#39;échantillonnage la section est ici de 1 / 6. La première section est placée sur une lame pour la coloration de violet de crésyl et les 5 prochaines sections sont placées dans des antigènes préserver. 7 Numéro de section est ensuite capturé sur la diapositive et les sections 9-12 sont placés dans des antigènes préserver. Ce cycle est répété jusqu&#39;à ce que la région d&#39;intérêt ou de bloc de tissu est sectionné de façon exhaustive. </li><li> La prochaine étape est de manière exhaustive la section du bloc de tissu. Placer une petite quantité d&#39;intégrer support sur le mandrin et laisser geler. Placez le mandrin dans la tête de microtome et raser assez du milieu congelé pour avoir une surface plane. Retirez le mandrin de la tête et le lieu microtome à plat dans le cryostat. Verser intégrant support sur le mandrin et fermement placer le bloc du cerveau avec le côté coupé stéréotaxique positionnés à plat sur le mandrin. Lentement et complètement intégrer le cerveau en milieu de montage. Placez le mandrin avec le cerveau dans la tête de microtome et la section en utilisant les paramètres pré-déterminé pour la fréquence d&#39;échantillonnage article. </li><li> Une fois le bloc de tissu a été sectionné et exhaustive sections sont placées dans des puits, recouvrir la plaque avec le couvercle, le couvercle envelopper avec du parafilm, et placer dans un congélateur à -20 ° C. Connexion au nombre total de sections prises pour chaque série, l&#39;intervalle de la section d&#39;échantillonnage et le nombre de séries pour chaque animal. Ce journal sera vital de garder la trace de l&#39;élimination ultérieure des sections de la banque de cerveaux pour l&#39;immunohistochimie avenir. </li></ol> Partie 4: Résultats du représentant: L&#39;échantillonnage systématique de cette manière a été une pratique courante dans notre laboratoire pour les 3 dernières années. Nous avons eu beaucoup de succès immunohistochimie effectuer sur le matériel qui a été stocké dans antigène préserver trois ans après qu&#39;il a été tranché sans détérioration du signal (figure 1). Par ailleurs, dans le cadre de notre banque de cerveaux que nous avons enregistré près de 20 000 sections systématique des non-humainscerveau de primate (figure 2) dans le cadre de nos plans de recherche à long terme. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figure 1. Ceci est une section du pôle occipital du primate non humain immunocolorées pour NeuN montrant deux couches VI et interstitielle neurones de la substance blanche. Cette section particulière a été stocké dans antigène conserver à -20 ° C pendant une période de 2 ans. Barre d&#39;échelle = 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figure2" /> Figure 2. Notre banque de cerveaux vervet se compose désormais de près de 20 000 sections systématiques de plus de 30 singes.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;échantillonnage systématique est une méthode peu coûteuse destinée à optimiser le matériel de recherche. Cette stratégie d&#39;échantillonnage est conçu pour se conformer aux règles du stéréologie impartiale qui nécessite un échantillonnage systématique de toute la région. Il est essentiel que l&#39;ordre des sections pour chaque série est maintenue. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé avec succès cette méthode pour les services bancaires à la fois de hamster et non-humains des coupes de cerveau de primate....

<table><tbody><tr><td>Glycol éthylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Milieu d'inclusion Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

banques de cerveaux: tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Stéréologie impartiale est une méthode précise et efficace pour l&#39;estimation du nombre de neurones totale (ou autre type cellulaire) dans une zone donnée d&#39;intérêt<sup&gt; 1</sup&gt;. Pour atteindre cet objectif de 60 à 10 sections systématiques devraient être sondé couvrant toute la structure. Typiquement, cela implique un traitement cinquième sections qui laisse une quantité importante de matières non traitées. Afin de maximiser le matériel, nous proposons une méthode peu coûteuse pour la préservation des tissus fixés dans le cadre d&#39;un plan de stockage à long terme de recherche. Comme le tissu est découpé et traité pour la teinture ou désiré d&#39;anticorps, les articles de remplacement devrait être systématiquement placés dans des antigènes conserver à -20 ° C pour le traitement futur. En utilisant des plaques 24 puits, les articles peuvent être placés dans l&#39;ordre pour une récupération future. En utilisant cette méthode, les tissus peuvent être stockées et traitées pour l&#39;immunohistochimie au cours de l&#39;année.

Banques de cerveaux et l&#39;échantillonnage systématique de matériel biologique fournit la base pour stéréologie impartiale et maximise le potentiel des données obtenues de chaque spécimen.

Banques de cerveaux: Tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche

La stéréologie non biaisée est une méthode permettant d'estimer avec précision et efficacité le nombre total de neurones (ou d'un autre type cellulaire) dans une zone d'intérêt donnée1. Pour...

Pour commencer cette procédure, le bloc cérébral doit être préparé pour le microtome cryostat et la fréquence d'échantillonnage des sections doit être déterminée. Ensuite, la préservation de l'antigène et les lames doivent être préparées. Le bloc cérébral doit être placé sur le mandrin à l'intérieur du cryostat.Une fois que le cerveau est solidement inclus dans la section du mandrin à une épaisseur prédéfinie, des sections systématiques doivent être réalisées de sorte qu'une série soit placée sur une lame, et que les séries suivantes soient placées dans des puits préremplis de conservateur d'antigène. Une fois le bloc épuisé, placez la plaque dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius dans le cadre de votre banque de cerveaux. Bonjour, je suis le Dr Mark Burke du Laboratoire de neurosciences visuelles de l'École d'optométrie de l'Université de Montréal.Bonjour, je suis le Dr Shahin Zur, également du Laboratoire des neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Montréal. Bonjour, je suis le Dr Mo Petto, directeur du Laboratoire des neurosciences visuelles à l'École d'optométrie de l'Université de Mon�treal. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de prélever systématiquement des tissus cérébraux dans un état préservé pour les antigènes.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin de maximiser le matériel de recherche et de servir de base à la réalisation d'une théologie impartiale. Commençons donc. Ce protocole décrit comment prélever systématiquement des échantillons de tissu cérébral qui a été fixé, découpé stéréotaxiquement en tranches d'un centimètre d'épaisseur et congelé.Pour voir ces premières étapes en détail, consultez notre récent article JoVE sur la dissection du cerveau de primate non humain dans l'espace stéréotaxique. La première étape de l'échantillonnage systématique consiste à établir votre plan d'échantillonnage, à décider comment vous allez sectionner votre tissu, comment vous diviserez ces sections en séries ou en échantillons, et comment vous organiserez et suivrez ces échantillons. Commencez tout d'abord par consulter un atlas stéréotaxique selon les besoins.Définissez clairement votre région d'intérêt dans les dimensions rostro-caudale et dorso-ventrale, puis choisissez le plan de sectionnement. Ensuite, déterminez l'épaisseur de vos sections et calculez combien de sections vous pouvez obtenir à partir de votre région d'intérêt. Par exemple, d'après l'atlas stéréotaxique, vous établissez que l'étendue rostro-caudale totale de votre région mesure environ trois millimètres de long.Vous décidez ensuite de régler le cryostat pour réaliser des sections de 50 micromètres, et à ce rythme, vous obtiendrez 60 sections coronales couvrant toute la région. À ce stade, vous pouvez définir votre intervalle d'échantillonnage. Pour une étude théologique typique sans biais, il faut prélever systématiquement six à dix sections afin d'obtenir des résultats fiables.Dans cet exemple, 10 sections espacées uniformément sur l'ensemble de l'étendue du Ros coddle donnent un intervalle d'échantillonnage d'une section sur six. Une fois que vous avez déterminé cette fréquence d'échantillonnage des sections, vous devez ensuite décider quelles colorations vous souhaitez réaliser. Vous monterez immédiatement les sections que vous souhaitez colorer directement sur des lames, au fur et à mesure que vous sectionnez votre tissu.Par exemple, si vous effectuez une coloration avec, disons, le violet de crésyl, vous allez capturer l'une des six sections sur une lame. Ce sera la série un. Vous conserverez les sections restantes dans des plaques contenant un conservateur d'antigènes pour des immunohistochimies futures.Le schéma d'échantillonnage illustré ici comprend deux diapositives et une plaque standard de 24 puits de sections, constituant une banque cérébrale pour un total de six séries pour ce bloc de tissu. L'étape suivante consiste à sectionner intégralement le bloc de tissu à l'aide du microtome cryostat. Tout d'abord, vous devez fixer votre échantillon de tissu congelé sur la pièce appelée mandrin, qui s'insère dans la tête du microtome et sert de plateau pour votre échantillon.Pour commencer, déposez une petite quantité de milieu d'inclusion sur le mandrin et laissez-le geler. Placez le mandrin dans la tête du microtome et rasez suffisamment le milieu congelé pour obtenir une surface plane destinée à votre échantillon. Retirez le mandrin de la tête du microtome et placez-le à plat dans le cryostat.Placer le milieu d'inclusion sur le mandrin et bien fixer. Poser lentement et complètement le bloc cérébral, côté coupé vers le bas, sur le mandrin. Inclure le morceau de cerveau dans le milieu de montage.Placer le mandrin maintenant fixé avec le cerveau dans la section de tête du microtome en utilisant la fréquence prédéterminée d'échantillonnage des sections. Après avoir réalisé une section, soit en la montant sur une lame, soit en l'ajoutant à une série spécifique dans la plaque contenant le conservateur d'antigène, veillez soigneusement à conserver les sections dans l'ordre dans lequel elles ont été coupées, afin de pouvoir ultérieurement retourner à la banque de cerveaux et prélever un autre échantillon systématique.Une fois que vous avez sectionné exhaustivement le tissu et placé les sections dans les puits, couvrez la plaque avec son couvercle, enveloppez le couvercle avec du parafilm et placez-la dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Notez le nombre total de sections dans chaque série, l'intervalle d'échantillonnage des sections et le nombre de séries par animal. Ce registre sera essentiel pour suivre les sections lorsque vous les retirerez de la banque cérébrale pour des expériences futures.L'échantillonnage systématique selon cette méthode est une pratique courante dans notre laboratoire. Au cours des trois dernières années, nous avons obtenu de très bons résultats en réalisant de l'immunohistochimie sur des échantillons conservés pendant trois ans dans un milieu de préservation des antigènes, sans dégradation du signal. Par ailleurs, dans le cadre de notre banque cérébrale, nous avons archivé près de 20 000 sections systématiques du cerveau de primates non humains.Dans le cadre de nos plans de recherche à long terme, nous venons de vous montrer comment échantillonner systématiquement un spécimen biologique et le conserver dans le cadre de vos plans de recherche à long terme. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir de tenir un registre détaillé du nombre total de séries prélevées et du nombre total de sections par série. En outre, si une section est perdue ou endommagée, noter ce numéro de section dans le registre afin de maintenir une procédure d'échantillonnage systématique.Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

brain-banking-making-the-most-of-your-research-specimens

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons un modèle de rat de trouble de stress post-traumatique (SSPT) qui révèle les altérations persistantes dans la fonction neuroendocrine et le retard à long terme, l'intervention crainte exagérée, caractéristiques des patients SSPT. Le modèle animal et les méthodes décrites ici sont utiles pour corréler des biomarqueurs dans les noyaux du cerveau, qui sont mécaniste, mais ne peut pas être mesurée chez les patients avec des biomarqueurs en globules blancs périphériques, ce qui peut.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

La vidéo montre une procédure étape par étape pour disséquer symétriquement un cerveau humain post-mortem fixe, en préparant des blocs de tissus plus petits pour une analyse plus approfondie.

Coupe bihémisphérique symétrique du cerveau humain post-mortem

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d&#39;extraction pour l&#39;étude de l&#39;homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

procédures de coupe du cerveau organisés sont nécessaires pour corréler les phénomènes neuropsychiatriques spécifiques avec des diagnostics neuropathologiques définitives. boutures de cerveau sont effectuées différemment selon diverses éventualités clinico-académique. Ce protocole décrit une procédure de coupe du cerveau bihemispheric symétrique pour étudier les différences hémisphériques dans les pathologies du cerveau humain et de maximiser les techniques biomoléculaire / neuroimagerie...

Symmetric Bihemispheric Postmortem cerveau de coupe pour étudier en santé et états pathologiques du cerveau chez les humains

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Ce protocole décrit une méthode pour suivre les trajectoires individuelles de vieillissement du cerveau à travers un programme de don de cerveau et une caractérisation appropriée des cerveaux. Les donneurs de cerveau sont impliqués dans une étude longitudinale à long terme comprenant des évaluations multidimensionnelles en série. Le protocole contient une description détaillée du traitement du cerveau et une méthodologie diagnostique précise.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

Les biobanques sont des ressources cruciales pour la recherche biomédicale et l’unité Biobanque de médecine translationnelle et numérique de l’Institut européen d’oncologie est un modèle dans ce domaine. Nous fournissons ici une description détaillée des procédures opérationnelles normalisées des biobanques pour la gestion de différents types d’échantillons biologiques humains.

Biobanque de médecine translationnelle : Modes opératoires normalisés pour une gestion optimale des échantillons

Une méthode d’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes à partir du cerveau de rats vivants est présentée ici en détail expérimental. Il permet de multiples prélèvements de ces cellules chez les mêmes animaux sans compromettre leur bien-être.

La méthode de « traite cérébrale » pour l’isolement de cellules souches neurales et de cellules progénitrices d’oligodendrocytes provenant de rats vivants

Ce protocole décrit une méthode pour faciliter le prélèvement d’échantillons de prostatectomie radicale. L’objectif est de cartographier, caractériser et micro-macro disséquer des échantillons de tissus à partir des échantillons sur la base de critères anatomopathologiques avant de les stocker dans une biobanque.

Amélioration de la fiabilité des biobanques de tumeurs de la prostate grâce à une technique d’échantillonnage et une caractérisation histologique améliorées

Les neurosciences modernes doivent explorer les différences entre de nombreuses espèces, y compris les rongeurs de laboratoire et les humains. Cependant, des difficultés techniques surviennent lorsque des mammifères à gros cerveau sont impliqués. Cette approche aborde la variation interespèces des populations neuronales chez des mammifères très différents, produisant des résultats comparables à cartographier pour révéler des schémas évolutifs.

Une approche comparative pour les études quantitatives de comptage cellulaire dans des cerveaux de mammifères très différents

Découvrez la préparation d'échantillons cérébraux pour la cryostatie et l'importance de l'échantillonnage systématique dans les banques de cerveaux. Cette méthode préserve le matériel biologique pour l'analyse stéréologique non biaisée.

Banques de cerveaux: Tirer le meilleur parti de vos spécimens de recherche

Explorer plus de vidéos