Name: La détection des protéines ubiquitination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez les méthodes de détection de l'ubiquitination des protéines dans les cellules en culture et in vitro. Ces protocoles permettent d'étudier les ligases ubiquitines et leurs substrats pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 et PO1 ES016738 (à Z. Zhang); California Institute for Regenerative Medicine subventions RS1-00331-1 et RL1-00682-1 (à Z. Zhang), la maladie de Parkinson américaine Disease Association (à Z. Zhang et YS Choo) et la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson (Z. Zhang).

Détection de l&#39;ubiquitination de protéines dans des cellules en culture <ol><li> Transfecter des cellules en culture avec des plasmides exprimant la protéine d&#39;intérêt et (épitope taggés version de) l&#39;ubiquitine. </li><li> Faire complète du tampon de lyse cellulaire (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0) avec orthovanadate de sodium 2 mM, 50 mM de fluorure de sodium, et les inhibiteurs de protéase. </li><li> Lyse des cellules avec tampon de 100 cellules lyse ul par plaque (6 vaisselle cm). Si un plus grand plat est utilisé, régler le volume en conséquence. Agiter le plat de soin de laisser le tampon de lyse couvrir toute la zone de cellules cultivées. </li><li> Recueillir les cellules avec un racleur de cellules et de transférer les lysats de cellules dans un tube eppendorf de 1,5 ml. Placer le tube sur une plaque chaude immédiatement à bouillir pendant 10 min. </li><li> Cisaillement des cellules avec un dispositif de sonication. </li><li> Ajouter 900ul de tampon de dilution (10 Triton mM Tris-HCI, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 1%). Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30-60 min avec rotation. </li><li> Faites tourner les échantillons dilués à 20.000 xg pendant 30 min. Transférer le surnageant résultant d&#39;un nouveau tube Eppendorf. Attention à ne pas perturber le culot. </li><li> Mesurer la concentration en protéines. </li><li> Préparer la protéine A ou G-agarose perles conjugué anticorps contre la protéine cible dans un tampon compatible (50% lisier). Coupez l&#39;extrémité étroite d&#39;une pointe P-200 pipette et transférer 14-20 ul de résine 500-1500 mg de lysats de cellules préparées pour immunoprécipitation. Pour les cellules avec une efficacité de transfection élevée, 500 ug sera suffisant. Pour les cellules avec une efficacité de transfection bas, plus de protéines peuvent être nécessaires. </li><li> Incuber le lysat cellulaire-billes mélange à 4 ° C pendant la nuit avec la rotation. </li><li> Isoler les perles à 5000 xg pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Laver la résine avec le tampon de lavage (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) à deux reprises. </li><li> Faites tourner les perles pour une dernière fois à 20 000 xg pendant 30 sec. Aspirer le tampon de lavage résiduelle et faire bouillir la résine avec le tampon de chargement SDS 2X. </li><li> Charger les échantillons sur un gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse. </li><li> Détecter l&#39;ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs. Pour immunoblot, nous avons généralement de détecter l&#39;ubiquitine premier. La membrane sera alors utilisé pour détecter les protéines précipitées. </li></ol> Détection de l&#39;ubiquitination de protéines cibles par le biais d&#39;ubiquitination in vitro dans le test <ol><li> Faire tampon ubiquitination 5X (100 mM Tris-HCI, pH 7,5, 25 mM de MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM d&#39;ATP). Rangez-les dans de petites aliquotes à -20 ° C pendant 6 mois. Certains protocoles aussi ajouter de la créatine phosphate et la créatine kinase dans le tampon pour régénération de l&#39;ATP 1,2. </li><li> Pour chaque réaction, préparer un mélange contenant les éléments suivants: <table border="1"><tbody><tr><td> 8 pl </td><td> Buffer 5X ubiquitination </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubiquitination E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubiquitination E2 </td></tr><tr><td> 0,5 pg </td><td> ubiquitine </td></tr><tr><td> 0,5 pg </td><td> protéine d&#39;intérêt </td></tr><tr><td></td><td> l&#39;eau à 40 ul volume total </td></tr></tbody></table> Comme témoins, de préparer des réactions similaires en l&#39;absence de soit E1, E2, ou ubiquitine. </li><li> Incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure ou plus. </li><li> Arrêter la réaction par addition de tampon échantillon SDS-PAGE et faire bouillir l&#39;échantillon pendant 10 min. </li><li> Charger les échantillons sur gel SDS-PAGE pour immunoblot analyse. </li><li> Détecter l&#39;ubiquitine et la protéine cible avec des anticorps respectifs. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Dans cette présentation, nous avons d&#39;abord décrit les étapes qui permettent de détecter la modification d&#39;ubiquitine sur une protéine d&#39;intérêt dans des cultures de cellules de mammifères. Afin de détecter spécifiquement sur ​​l&#39;ubiquitination de la protéine d&#39;intérêt, non pas sur les protéines qui interagissent de façon non covalente, nous avons utilisé une condition stricte pour la lyse cellulaire, immunoprécipitation et de lavage 1,3. L&#39;ubiquitination, détectée par immunoprécipitat...

la détection des protéines ubiquitination

Detection of Protein Ubiquitination

L&#39;ubiquitination, la fixation covalente de l&#39;ubiquitine polypeptide de cibler les protéines, est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Ils comprennent l&#39;enzyme activant l&#39;ubiquitine-E1, E2 enzyme conjuguant l&#39;ubiquitine et ubiquitine ligase E3. Contrairement à E1 et E2, E3 ubiquitine ligases la spécificité de substrat d&#39;affichage. D&#39;autre part, de nombreuses enzymes deubiquitylating ont des rôles dans le traitement des protéines polyubiquitinated. L&#39;ubiquitination peut entraîner un changement de la stabilité des protéines, localisation cellulaire et l&#39;activité biologique. Des mutations de gènes impliqués dans la voie d&#39;ubiquitination / déubiquitination ou altération de la fonction système ubiquitine sont associés à différentes pathologies humaines telles que divers types de cancer, maladies neurodégénératives et les troubles métaboliques. La détection de l&#39;ubiquitination altérée ou normale de protéines cibles peuvent fournir une meilleure compréhension de la pathogenèse de ces maladies. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l&#39;ubiquitination de protéines dans des cellules en culture<em&gt; In vivo</emTubes&gt; et le test<em&gt; In vitro</em&gt;. Ces protocoles sont également utiles pour détecter d&#39;autres ubiquitine-like modification de petites molécules telles que sumolyation et neddylation.

L&#39;ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l&#39;ubiquitination de protéines dans des cellules en culture<em&gt; In vivo</emTubes&gt; et le test<em&gt; In vitro</em&gt;.

La détection des protéines ubiquitination

L'ubiquitination, l'attachement covalent du polypeptide ubiquitine à des protéines cibles, est une modification post-traductionnelle clé réalisée par un ensemble de...

Bonjour, je suis Chu du laboratoire de Jo à l'Institut de recherche médicale de Birmingham. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de détecter la néosynthèse protéique. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le parking ou les ligases UBI trois et leur substrat.Commençons. Pour commencer ce protocole, transfectez les cellules avec des plasmides exprimant à la fois la protéine cible et une version de l'ubiquitine marquée par un épitope. Incubez les cellules environ 40 heures, puis placez-les sur la paillasse du laboratoire. Aspirez le milieu liquide et lavez les cellules deux fois avec du PBS.Lysez ensuite les cellules en ajoutant 100 microlitres de tampon de lyse cellulaire, contenant 2 % de SDS par plaque de six centimètres. Faites tourner doucement chaque plaque afin que le tampon recouvre complètement les cellules. Ensuite, utilisez un grattoir à cellules pour recueillir les cellules lysées et transférez-les dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre.Placer immédiatement le tube sur un bloc chauffant et faire bouillir les cellules lysées pendant 10 minutes afin de dénaturer et de dissoudre davantage les protéines. Après ébullition, utiliser un appareil à ultrasons pour cisailler les cellules et leur ADN. Cette étape rend les lysats cellulaires moins visqueux.Après la sonication, ajouter 900 microlitres de tampon de dilution et laisser les échantillons tourner à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes. Après l'incubation, centrifuger les échantillons dilués à 20 000 Gs pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin d'obtenir les protéines solubles. Ensuite, sans perturber le culot, transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau tube einor.Enfin, mesurez la concentration en protéines dans le surnageant par une méthode telle que le dosage de Lowry modifié que nous utilisons ici. Vous êtes maintenant prêt à utiliser une immunoprécipitation pour isoler votre protéine d'intérêt parmi les autres présentes dans le surnageant. La première étape de l'immunoprécipitation consiste à préparer les billes conjuguées à des anticorps dirigés contre votre protéine d'intérêt.Vous pouvez utiliser des billes couplées à des anticorps disponibles dans le commerce ou préparer votre propre anticorps immobilisé à l'aide d'agents de réticulation. Comme indiqué ici, préparez l'anticorps immobilisé dans un tampon compatible afin d'obtenir une suspension à 50 % pour mettre en place la réaction de précipitation des amines. Coupez l'extrémité étroite d'une pipette P200 et transférez 14 à 20 microlitres de résine dans 500 à 1500 microgrammes de lysats cellulaires préparés.Ajustez la quantité de lysat cellulaire utilisée en fonction de l'efficacité de transfection de vos cellules. Laissez le mélange de lysat cellulaire et de billes tourner à quatre degrés Celsius toute la nuit. Pendant cette période, l'anticorps fixé sur les billes se liera spécifiquement à votre protéine cible.Le lendemain, centrifuger les billes à 5 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius afin de faire précipiter votre protéine. Maintenant liée aux billes, aspirer le surnageant et laver la résine deux fois avec le tampon de lavage à haute teneur en sel en centrifugeant à 5 000 G pendant cinq minutes. À quatre degrés Celsius, centrifuger les billes une dernière fois à 20 000 GS pendant 30 secondes et aspirer le tampon de lavage résiduel.À présent que vous avez purifié votre protéine d'intérêt, il est temps de faire migrer la protéine sur un gel SDS-PAGE. Commencez par faire bouillir la résine chargée avec un volume double de tampon de charge SDS afin de dénaturer les protéines et leur conférer une charge négative. Chargez ensuite vos échantillons préparés sur un gel SDS-PAGE.Transférez les protéines sur une membrane à l’aide du protocole de votre laboratoire pour le transfert sur gel L en vue d’un western blot. Incubez ensuite la membrane avec des anticorps dirigés contre l’ubiquitine ou la protéine cible, puis révélez la membrane sur film afin de visualiser les protéines ubiquitinées. Nous venons de vous montrer comment détecter l’ubiquitination des protéines dans des cellules en culture.Cette même expérience peut être réalisée in vitro dans un tube à essai. Cette réaction a un volume total de 40 et peut être effectuée dans un tube PCR. Préparez chaque réaction comme suit.Tout d'abord, ajoutez cinq fois le tampon d'UBIQUITINATION, qui contient un TP et l'agent réducteur DIO trois etol, DTT. Ensuite, ajoutez les enzymes d'ubiquitination E un et E deux. Ajoutez les substrats, l'ubiquitine et la protéine cible.Compléter le volume réactionnel total à 40 microlitres avec de l'eau comme témoins. Préparer des réactions similaires en l'absence d'ubiquitine E1, E2 ou de la protéine cible. Incuber une heure ou plus à 37 degrés Celsius.Arrêter la réaction en ajoutant du tampon d'échantillonnage pour électrophorèse SDS-PAGE. Faire bouillir l'échantillon pendant 10 minutes. Charger les échantillons sur un gel SDS-PAGE et procéder à l'analyse par immunotransfert comme vous l'avez fait pour l'expérience in vivo.Voici un exemple de résultat obtenu avec ce protocole. Parkinson. Une protéine associée à la maladie de Parkinson est la protéine d'intérêt ici. Et la bande quatre montre la parine ubiquitinée.Les bandes ou échelles fortes typiques sont indiquées au-dessus de la masse moléculaire de la parine non modifiée afin de comparer plusieurs conditions expérimentales, ainsi que les niveaux d'expression cellulaire de la protéine cible non modifiée, la parine et l'ubiquitine, que chaque condition doit également prendre en compte. Il s'agit d'un exemple de polyubiquitination in vitro de la parine ; la parine purifiée par affinité a été utilisée dans un test de ubiquitination in vitro en présence des protéines recombinantes E1, E2 et d'ubiquitine marquée par une biotine. La parine ubiquitinée biotinylée a été détectée par streptavidine-HRP. La parine ubiquitinée apparaît sous forme d'échelles au-dessus de la masse moléculaire de la parine non modifiée. Les lignes un, deux et quatre sont des contrôles qui ne contiennent pas respectivement d'ubiquitine, d'E1, d'E2 et de parkine.Nous venons de vous montrer comment détecter une protéine après une nouvelle vaccination dans des cellules en culture. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de préparer le lysat cellulaire dans des conditions fortement tamponnées et de diluer le lysat cellulaire avant d'ajouter les anticorps marqués. Voilà donc ce qu'il faut retenir.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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Cette vidéo décrit une méthode permettant d’extraire et de purifier des peptides ubiquitinylés contenant des peptides de diglycine restants à partir d’un mélange complexe de peptides. La méthode présentée peut aider à identifier les sites d’ubiquitination originaux dans la protéine.

Extraction basée sur l’immunoaffinité de peptides ubiquitinylés : une technique d’extraction sélective de peptides marqués à l’ubiquitine à partir de fractions peptidiques purifiées

Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Méthode de mesure de l&#39;activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

Nous présentons une méthode pour la purification, la détection et l’identification des peptides diGly qui proviennent de protéines ubiquitinées à partir d’échantillons biologiques complexes. La méthode présentée est reproductible, robuste et surpasse les méthodes publiées par rapport au niveau de profondeur de l’analyse ubiquitinome.

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.

Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à des technologies de sonde pour prédire et valider l’interaction entre de petites molécules de la médecine traditionnelle chinoise et des cibles protéiques.

Criblage de composés de médecine traditionnelle chinoise pour inhiber l’activité d’UCHL3 sur la base de la technologie des sondes enzymatiques d’amarrage moléculaire et de désubiquitination

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Découvrez les méthodes de détection de l'ubiquitination des protéines dans les cellules en culture et in vitro. Ces protocoles permettent d'étudier les ligases ubiquitines et leurs substrats pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires.

La détection des protéines ubiquitination

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