Préparation des cultures de cerveau de rat d'agrégation pour Neuron et études sur le développement Glia

Nous présentons un système de culture de progéniteurs neuronaux du SNC au cours de leur développement et de leur différenciation en neurones et en cellules gliales matures. La procédure commence par l'isolement de quatre cerveaux de fœtus de rat à J16, suivie d'une digestion à l'aide de propanéase. Les tissus sont dissociés en une suspension monocellulaire, filtrés, comptés et répartis dans une plaque de six puits.

Les cellules en plaque de culture sont doucement resuspendues une fois par jour pendant deux à trois jours afin de permettre la formation d'agrégats. Les agrégats sont ensuite récupérés et passés au travers d'un tamis de 200 micromètres, et les petits agrégats ainsi que les débris cellulaires sont éliminés par lavage. Enfin, les agrégats sont comptés et ensemencés sur des lamelles recouvertes de Matrigel.

Bonjour, je suis Coto du laboratoire du Dr. John L, du Département des sciences bioscientifiques vétérinaires intégrées de l'Université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de cultures d'agrégats cérébraux. Nous utilisons cette procédure dans notre niveau trois pour étudier la lignée des endocytes, le développement cellulaire et les interactions accélérées.

Commençons. Avant de commencer, tenez prêts sur la paillasse des outils stérilisés, de l'éthanol à 70 %, un coussin absorbant pour travailler, ainsi que des boîtes de Pétri de 10 centimètres pour la dissection. Le milieu doit être conservé sur glace.

Dans la hotte, préparez un microscope stéréoscopique équipé d'une plateforme en glace et plusieurs boîtes de 10 centimètres contenant du milieu de dissection, également placées sur de la glace. Enfin, préparez les solutions que vous utiliserez et réchauffez le milieu de culture à 37 degrés dans un bain-marie. Vous commencez ce protocole en prélevant des embryons du jour 16 (E16) d'un rat Sprague Dawley.

Tout d'abord, euthanasiez une femelle gravide conformément à une procédure approuvée par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux. Placez le rat euthanasié sur un tapis à langer et vaporisez de l’alcool sur son abdomen pour le nettoyer. Ensuite, utilisez une pince pour pincer la peau abdominale et, de l’autre main, utilisez des ciseaux pour inciser uniquement la peau, écartez la peau, puis utilisez une autre paire de pinces et de ciseaux stérilisés pour couper la couche musculaire.

Ensuite, retirez l'utérus et transférez-le dans une boîte de 10 centimètres contenant du milieu de dissection glacé. L'étape suivante s'effectue sous hotte à l'aide de ciseaux de dissection microchirurgicaux. Retirez soigneusement chaque embryon de l'utérus.

Il est maintenant temps de récolter et de commencer. Travaillez avec les cerveaux embryonnaires. Prélevez le cerveau de chaque embryon et placez les cerveaux isolés dans une boîte de 10 centimètres propre contenant du milieu de dissection, posée sur une plateforme glacée. Sous le microscope stéréo, terminez la dissection des cerveaux.

Retirez les sections du mésencéphale et du cerveau postérieur. Utilisez une pince fine pour enlever les méninges, puis transférez ce qui reste du prosencéphale dans un tube Falcon de 50 millilitres contenant du milieu de dissection. Le tissu est désormais prêt pour l'étape suivante.

Dissociation des cellules par digestion enzymatique. Juste avant de commencer la digestion, préparez des solutions fraîches de propane et d'inhibiteur de la trypsine filtrées. Stérilisez-les et réchauffez-les à 37 degrés Celsius dans un bain-marie.

Retirez le milieu excédentaire des cerveaux disséqués. Ajoutez ensuite quatre millilitres de la solution de digestion au propane préparée dans votre tube de 50 millilitres. Incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant exactement cinq minutes.

Lorsque le temps est écoulé, utilisez une pipette pour éliminer la solution de propane. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de solution fraîchement préparée d'inhibiteur de la trypsine et replacez le tube dans le bain-marie à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes supplémentaires. Lorsque le temps est écoulé, retirez la solution d'inhibiteur de la trypsine.

Répétez l'incubation avec la solution d'inhibiteur de la trypsine trois fois supplémentaires. Après avoir retiré la solution d'inhibiteur de la trypsine pour la dernière fois, ajoutez 20 millilitres de milieu de culture pm préchauffé à votre tube.

Il est maintenant temps d'itérer et de laver vos cellules. Itérez les cellules à l’aide d’une pipette de 10 millilitres jusqu’à disparition complète des agrégats, environ 20 à 30 fois. Ensuite, centrifugez à 100 ×g pendant sept minutes.

À ce stade, vos cellules doivent être bien séparées les unes des autres. Après sept minutes, retirez le surnageant et resuspendez le culot dans 10 millilitres de milieu de culture pour laver les cellules.

Ensuite, centrifuger à nouveau. Éliminer le surnageant et répéter le lavage et la centrifugation. Passer à l'étape suivante après le deuxième lavage.

Resuspendre le culot dans 10 millilitres de milieu de culture en agrégat, faire passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres. Enfin, dénombrer les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre.

Et maintenant, vous êtes prêt à permettre aux cellules cérébrales dissociées de former des agrégats. Après le comptage, suspendez les cellules dissociées dans un milieu de culture d'agrégats à une densité de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture non revêtue à six puits.

Les cellules sont resuspendues délicatement chaque jour pendant trois nuits. Une fois, à l’aide d’une pipette P1000, les cellules commencent à former des agrégats le jour de la mise en place des agrégats. Après que les cellules ont poussé pendant trois nuits, resuspendre à nouveau les cellules délicatement et filtrer la suspension à travers une maille de 200 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres.

Laisser les agrégats se déposer au fond du tube pendant environ trois à cinq minutes. Ensuite, retirer soigneusement le surnageant, ajouter du milieu, resuspendre délicatement les agrégats et les laisser de nouveau se déposer. Répéter cette procédure plusieurs fois.

Pour éliminer les cellules mortes, les cellules individuelles et les débris, utilisez le microscope afin de vérifier si les surnageants contiennent encore des cellules non agrégées et des débris. Une fois les agrégats soigneusement lavés, resuspendez-les délicatement dans le même milieu et comptez les agrégats pour déterminer leur concentration. Ajustez ensuite la densité des agrégats à environ 25 à 30 agrégats par 50 microlitres.

Il est maintenant temps de semer les lamelles avec des agrégats. Transférez des aliquotes de 1000 microlitres de la suspension d'agrégats dans des tubes eend Dwarf de deux millilitres, car les agrégats ont tendance à se déposer au fond des tubes ; il est donc essentiel de préparer plusieurs tubes de suspension d'agrégats pour la mise en culture. Les lamelles utilisées lors de cette étape sont recouvertes d'un substrat de culture cellulaire, le matrigel, par une incubation nocturne à 37 degrés Celsius.

Une fois que vous avez préparé Alec watts de la suspension agrégée, sortez la plaque de culture contenant les lamelles recouvertes de Matrigel de l'incubateur. Retirez la solution de chaque puits. Lavez les lamelles avec du PBS tiède, puis avec de l'eau DD H2O.

Ils sont désormais prêts pour la sémination d'agrégats afin de semer la lame avec des agrégats. Inverser le tube de suspension d'agrégats pour mélanger et distribuer uniformément les agrégats. Ensuite, déposer 50 microlitres de suspension d'agrégats au centre de chaque lame.

Remettez délicatement la plaque dans l’incubateur sans aucune perturbation supplémentaire afin de permettre aux agrégats de s’attacher uniformément sur le lamelle. La densité des agrégats est cruciale : si les agrégats sont placés trop près les uns des autres ou si la densité d’ensemencement est élevée, ils ont tendance à fusionner lorsqu’ils grandissent, quatre à six heures après l’ensemencement initial. Ajoutez 500 microlitres de milieu de culture dans chaque puits.

Pour maintenir la culture d'agrégats, renouvelez la moitié du milieu toutes les trois à quatre journées. Lors du changement de milieu, ajoutez-le le long de la paroi du puits afin d'éviter de perturber les agrégats. Quelques heures après que les agrégats se soient fixés sur le lamelle, des prolongements neuronaux peuvent être observés à partir des agrégats.

Les axones poussent rapidement durant les deux premières semaines et établissent d'abondantes connexions entre les agrégats. Les progéniteurs de gl gl migrent radialement hors des agrégats et se différencient au fil du temps en astrocytes et en oligodendrocytes matures. Nous venons de vous montrer comment cultiver les agrégats CS.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de bien indiquer la capacité et de veiller à ce que l'agrégat soit uniforme. Voilà tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.