Name: Lexocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Découvrez l'imagerie de l'exocytose des vésicules synaptiques dans les cellules bipolaires rétiniennes de poisson rouge par microscopie TIRF. Cette méthode révèle les mécanismes de libération des neurotransmetteurs en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH EY 14990.

Partie 1: Dissection et isolement des cellules bipolaires <ol><li> Préparer des solutions énumérées dans le tableau 2; Le pH de sonneries &#39;(extérieurs) des solutions devraient être ajusté à 7,4 avec NaOH et le pH de la solution interne devrait être ajusté à 7,2 avec CsOH. Protéger la solution interne de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation; </li><li> Dark-adapter un poisson rouge pendant au moins 30 minutes avant la dissection; </li><li> Alors que l&#39;animal s&#39;adapte sombre, préparer 5 ml de hyaluronidase (V hyaluronidase type, 1100 unités / ml à faible Ca 2 + de Ringer; Sigma, St. Louis, MO) et 10 mL de la L-cystéine (0,5 mg / ml à faible Ca 2 + de Ringer) et peser les solutions papaïne (poudre lyophilisée, 40 unités / ml; Sigma, St. Louis, MO) pour 5 mL de la solution de digestion; </li><li> Euthanasier les poissons rouges par décapitation rapide avec des ciseaux chirurgicaux et détruire le cerveau et la moelle épinière avec une lame de bistouri n ° 11; </li><li> Retirer les yeux en détruisant les muscles extra-oculaires à l&#39;aide d&#39;une pince Dumont # 7 courbes et couper le nerf optique avec des ciseaux iris; </li><li> Ampoule oeil seul endroit sur un morceau de papier filtre et perforer le limbe scléral avec la pointe d&#39;une lame de bistouri n ° 11; </li><li> Introduire la lame d&#39;une paire de ciseaux Vannas l&#39;intérieur de la totalité percé et coupé l&#39;ensemble du segment antérieur de suite; </li><li> Placer un petit morceau de papier filtre sur le dessus de la tasse restante optique et exercer une certaine pression afin d&#39;avoir le papier tremper avec humeur vitrée; </li><li> Soulevez le papier filtre avec la rétine attachée à lui et couper le nerf optique d&#39;une valeur nominale de ciseaux Vannas; </li><li> Placez le papier filtre contenant de la rétine dans un plat de culture en plastique de 35 mm avec une solution de hyaluronidase et de décoller la rétine du papier filtre à l&#39;aide d&#39;une pince à épiler Dumont n ° 7; </li><li> Couper la rétine en 4-6 morceaux avec la moitié d&#39;un acier au carbone industrielles seul tranchant de lame et laisser reposer dans la solution de hyaluronidase pendant 20 minutes; </li><li> En attendant la hyaluronidase pour prendre effet, ajouter 5 ml de la solution de L-cystéine à la papaïne et laisser reposer jusqu&#39;à ce que le liquide devient transparent (environ 5-10 minutes); </li><li> Lavez les morceaux de la rétine 3x à faible Ca 2 + de Ringer et laissez-les reposer dans la solution papaïne pendant 30-35 minutes; </li><li> Lavez les morceaux de la rétine 3x à faible Ca 2 + de Ringer et de les stocker jusqu&#39;à utilisation à 4 ° C dans une boîte de culture en plastique de 35 mm contenant une faible Ca 2 + de Ringer; </li><li> Pour dissocier les cellules, mettre un morceau de la rétine dans un microtube contenant 500 ml de faible teneur en Ca 2 + de Ringer et lentement triturer la rétine par l&#39;aspiration et refoulement avec une pipette en verre de dissociation, soigneusement pour ne pas produire les bulles d&#39;air. Pipettes de dissociation sont fabriqués par chauffage jusqu&#39;à la pointe d&#39;une pipette Pasteur en verre avec un bec Bunsen et légèrement plier à l&#39;aide d&#39;une pince anatomique; </li><li> Assiette des cellules isolées en ajoutant une goutte de la suspension rétiniennes à un home-made chambre d&#39;enregistrement préalablement remplie avec 2 ml de faible teneur en Ca 2 + de Ringer. La chambre se compose de la moitié inférieure d&#39;un plat de 35 mm de culture en plastique avec un ensemble de circulaires au milieu et une lamelle de verre circulaire de 1,78 indice de réfraction (PlanOptik, Allemagne) collé au fond d&#39;un élastomère de silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Partie 2: Chargement cellule bipolaire et Wash Out FRBR imagerie des vésicules synaptiques est mieux réalisée à l&#39;aide d&#39;un microscope TIRFM objectif de type avec un objectif très élevé NA et une caméra sensible. Pour nos expériences, nous avons choisi d&#39;utiliser un objectif de 1,65 NA (Apo O x100 RH, NA 1,65, Olympus, Japon) avec une EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). L&#39;utilisation de l&#39;objectif très élevé NA nécessite l&#39;utilisation de lamelles de verre de haute réfraction et liquide d&#39;immersion (di-iodométhane avec du soufre). Dans nos conditions, la lumière d&#39;excitation est limitée à un champ de décroissance exponentielle avec une longueur constante d&#39;environ 50 nm. <ol><li> Ajouter une goutte de liquide à indice de réfraction élevé (série M, l&#39;indice de réfraction = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, New Jersey) à l&#39;objectif du microscope; </li><li> Placez la chambre d&#39;enregistrement attentivement sur le dessus de l&#39;objectif du microscope et soigneusement monter électrode de terre et le tuyau de sortie à la chambre de surfusion; </li><li> Laissez-chambre de s&#39;asseoir sur microscope pour 10-20 minutes pour permettre aux cellules de l&#39;évier et adhérer au fond; </li><li> En attendant, préparer 5 ml d&#39;une trolox 1mM ® ((±)- 6-hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylique; Sigma, St. Louis, MO) solution dans K + haute Ringer . Soniquer jusqu&#39;à dissolution; </li><li> Préparer 15 ml de solution ADVASEP-7 à laver: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) à faible Ca 2 + de Ringer. Notez que ADVASEP-7 l&#39;utilisation est facultative et peut être omise si désiré; </li><li> Purger la li surfusionsolution de NDA et ajouter ADVASEP-7 à laver, faible teneur en Ca 2 + de la sonnerie et le contrôle de la sonnerie au système de surfusion; </li><li> Tirez de chargement pipettes de parois minces en verre borosilicate (Kwik-FIL ® TW150-3; WPI, Sarasota, Floride). Puffer résistances pipette sont dans la gamme de 1.5 à 2.5 MQ; </li><li> Préparer le FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryle) pyridinium dibromure, &quot;emballage spécial&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) des solutions. Tout d&#39;abord, faire un bouillon de 1 mM en ajoutant 160 uL d&#39;eau distillée dans un flacon (100 mg) de FM1-43 ®. Ce stock peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à une semaine. Ensuite, ajoutez 5 pi de FM1-43 ® à 1 mL de haute K + + ® Ringer 1mM trolox. Protéger la solution de la lumière avec du papier aluminium et gardez à 4 ° C jusqu&#39;à leur utilisation; </li><li> Tournez la lumière microscope en champ lumineux et rechercher des cellules bipolaires intacte. Légèrement appuyez sur le microscope pour s&#39;assurer que les neurones sont fermement attachés à la partie inférieure de la chambre; </li><li> Position du stylo surfusion proche de la cellule d&#39;intérêt et de permanence perfuser la préparation avec faible teneur en Ca 2 + de Ringer; </li><li> Éteignez les lumières ambiante et ajouter un rouge longue passe de filtre (c&#39;est à dire RG630; Schott, Allemagne) pour le chemin optique de minimiser l&#39;excitation du colorant FM; </li><li> Remplir une pipette de chargement avec 10 ul de la solution de colorant FM, monter la pipette dans le micromanipulateur et inférieure de la pipette sur la préparation sans surpression jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit au même plan focal que la cellule bipolaire que vous voulez charger. Assurez-vous d&#39;avoir au moins deux porte-électrodes: celui utilisé pour la teinture FM ne peut pas être utilisé pour patch clamp, ou bien elle peut contaminer la solution intracellulaire; </li><li> Position de l&#39;ouverture pompe à une distance d&#39;environ 10 um de la terminaison axonale, mettez le système hors tension et surfusion feuilletée la solution de colorant pendant 10 secondes en tournant la pipette sur la surpression; </li><li> Tournez la surpression off et, sans déplacer la pipette, attendre 30 secondes; </li><li> Tourner la surfusion et se baigner sur la chambre en ADVASEP-7 solution pendant 5 minutes. En attendant, retirer la pipette pompe de la baignoire; </li><li> Après 5 minutes, passez à faible teneur en Ca 2 + de la sonnerie et perfuser la chambre pendant 25-30 minutes pour permettre le retrait d&#39;un excès de colorant. </li></ol> Partie 3: patch clamp et imagerie TIRFM <ol><li> Alors que la préparation est lavage, tirez les pipettes de patch de parois épaisses en verre borosilicate (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch résistances pipette dans les 8-10 MQ large; </li><li> Après laver est terminée, placer le terminal de l&#39;axone dans le centre du champ de vue; </li><li> Remplir une pipette de patch avec 7μL de solution interne, appuyez sur la pipette pour se débarrasser des bulles d&#39;air, le manteau de la pipette avec de la cire fondue dentaires (cire collante; Kerr Corporation, Orange, CA) et le monter dans le micromanipulateur; </li><li> Tournez la surpression pipette sur la pipette et inférieur lentement sur la préparation. Vérifiez la résistance pipette dans l&#39;amplificateur et les décalages pipette correct et la capacité avec les commandes amplificateur respectif; </li><li> Mettez la surfusion de contrôler Ringer. Pour créer un gigaseal entre la pipette et la cellule, légèrement toucher la pointe de l&#39;électrode contre le corps cellulaire et tourner la surpression pipette hors tout doucement appliquant une pression négative à l&#39;électrode; </li><li> Bien scellés, choisissez &quot;cellule entière&quot; mode de l&#39;amplificateur et mis au cachot potentiel de -60 mV; </li><li> Choisissez une région d&#39;intérêt avec le logiciel d&#39;imagerie qui englobe toute la terminaison axonale, allumer la lumière hors champ clair et, par un bref exposé (30 ms), le terminal pour le laser à 488 nm, de trouver le bon plan de convergence pour la FRBR imagerie; </li><li> Pause dans la cellule en utilisant le «zapper» le commandement de l&#39;amplificateur tout en appliquant une pression légèrement négative à la pipette; </li><li> Correct pour la capacité des cellules et la résistance série, puis appliquer le protocole de tension d&#39;intérêt tout en imagerie du mouvement des vésicules synaptiques. Il est à ce stade important d&#39;avoir le protocole de tension synchrone à la cadence caméra. Dans notre cas, chaque image est de 30 ms de temps, donc les changements de tension se produisent dans des multiples de cette valeur (c&#39;est à dire, 300 ms ou 10 images); </li><li> Attendre au moins 40 secondes entre les essais pour permettre la récupération; </li><li> Pour vérifier la position des rubans synaptiques, prendre des photos tout en tournant le laser 561 nm sur. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Le montage expérimental. A 488 nm (bleu) laser est focalisé à la périphérie du plan focal arrière de l&#39;objectif et souffre réflexion interne totale quand il atteint le verre aqueuse d&#39;interface moyenne. Le champ électromagnétique généré par le faisceau réfléchi excite le fluorophore chargé dans les vésicules synaptiques plus proche de l&#39;Bottom de la chambre de verre, qui a ensuite fluorescence (vert). La lumière fluorescente est alors guidé vers l&#39;œil de l&#39;observateur (représenté) ou à une caméra CCD. Le potentiel de membrane des cellules imagée est contrôlée simultanément par les patch-clamp. Cette approche permet l&#39;étude de la relation entre les signaux entrants (la tension de membrane) et la sortie des neurones (exocytose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: Résultats typiques. A gauche: l&#39;image en champ clair d&#39;une cellule bipolaire poissons rouges isolés. En haut à droite: image TIRF des vésicules synaptiques dans le terminal bipolaires axone des cellules chargées avec FM 1-43 ® et imagés avec le 488 nm (FM colorant) au laser. En bas à droite: image d&#39;un même terminal, après patcher la cellule et l&#39;imagerie de la terminaison axonale avec le laser 561 nm. Rubans synaptiques sont étiquetés par la rhodamine basé RIBEYE peptide de liaison (Rpep_rhod). Tableau 1: Réactifs et équipements spécifiques. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Tapez </td><td> Fabricant </td><td> Catalogue </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Table </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscope inversé </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> Equipé d&#39;une lampe au tungstène pour le champ lumineux et un port ouverture latérale de la FRBR </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Source d&#39;alimentation de la lampe </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Filtre dichroïque </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtre d&#39;émission </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O RH </td><td> Objectif </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> NA 1.65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Glass Filter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm Laser </td><td> Cohérente </td><td> - </td><td> Utilisez à la puissance minimale </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturateur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Pilote d&#39;obturation </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm Laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturateur </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Pilote d&#39;obturation </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de pression de perfusion </td><td> Système superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Pen perfusion </td><td> Système superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> System Controller superfusion </td><td> Automatiser scientifique </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM caméra CCD </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Logiciel d&#39;imagerie </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Amplificateur Patch Clamp </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulse </td><td> Logiciel Amplificateur </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulateur </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Titulaire d&#39;électrode </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Pour en verre 1,5 mm de diamètre extérieur, 2 unités </td></tr><tr><td> Kwik-FIL ® TW150-3 </td><td> Borosilicate capillaire en verre </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sans fil </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Borosilicate capillaire en verre </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> Avec filaments </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Extracteur de microélectrodes </td><td> Instrument Sutter </td><td> - </td><td> Equipé de filaments boîte 3x3 et de la chambre de l&#39;environnement </td></tr><tr><td> - </td><td> Pompe de pression d&#39;air à vide </td><td> Thomas scientifique </td><td> 7893B05 </td><td> Crée à vide pour éliminer les liquides de la chambre et de surpression pour les pipettes </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Logiciel d&#39;analyse </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 mm en plastique des boîtes de culture </td><td> Falcon </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Haute de verre à indice de réfraction </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Indice de réfraction à 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Série M </td><td> Liquide à haute indice de réfraction </td><td> Labs Cargille </td><td> - </td><td> Indice de réfraction = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Le glutathion </td><td> Tripeptide </td><td> EMD Chemicals </td><td></td><td> Radica gratuitL trésor </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> L&#39;enzyme </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Type V </td></tr><tr><td> L-cystéine </td><td> Amino Acid </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Active la papaïne </td></tr><tr><td> La papaïne </td><td> L&#39;enzyme </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Soluble vitamine E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Gratuit capteur de radicaux </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonés B-cyclodextrine </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Réduit FM 1-43 ® fond de fluorescence </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorant fluorescent </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Un emballage spécial&quot; </td></tr><tr><td> Cire collante </td><td> Agent d&#39;enrobage pipette </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Diminue la capacité pipette </td></tr></tbody></table> Tableau 2: des solutions physiologiques utilisées dans cette étude. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Substance </td><td> Faible Ca 2 + de Ringer </td><td> Contrôle de Ringer </td><td> High K + Ringer </td><td> Solution interne </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mm </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Le glutathion </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CH 3 CsO 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> RPEP-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 ml </td><td> 100 ml </td><td> 5 ul </td><td> 100 uL </td></tr></tbody></table> * Méthanesulfonate de césium. ** RIBEYE peptide de liaison: la rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (MW 1997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

Les avantages de l&#39;objectif de type microscopie TIRF sont que 1) il fournit une excellente sectionnement optique en limitant la lumière d&#39;excitation à une région étroite dans le plan focal de l&#39;objectif, minimisant ainsi les focus-du-léger; 2) car la lumière tombe exponentiellement avec la distance , le mouvement dans une direction verticale peut être surveillé comme un changement dans l&#39;intensité de fluorescence; 3) la collecte efficace de la lumière à travers l&#39;objectif d&#39;ouverture numérique élevée 1,5. ...

l&#39;exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Réflectance interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie est une technique qui permet l&#39;étude des événements qui se déroulent à la membrane cellulaire, l&#39;imagerie par sélectif des molécules fluorescentes qui sont proches d&#39;une substance indice de réfraction élevé, comme le verre<sup&gt; 1</sup&gt;. Dans cet article, nous appliquons cette technique à l&#39;exocytose image de vésicules synaptiques dans les cellules rétiniennes bipolaires isolés de la rétine des poissons rouges. Ces neurones sont très convenable pour ce genre d&#39;étude en raison de leur grande terminaisons axonales. Par simultanément patch clamp les cellules bipolaires, il est possible d&#39;étudier la relation entre la tension pré-synaptique et la libération synaptique<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Les vésicules synaptiques l&#39;intérieur des terminaux cellulaires bipolaires sont chargées avec un colorant fluorescent (FM 1-43 ®) par la co-soufflant le colorant et une solution de Ringer contenant un K élevé<sup&gt; +</supConcentration&gt; sur le terminaisons synaptiques. Cette dépolarise les cellules et stimule l&#39;endocytose et conséquente absorption de colorants dans les vésicules glutamatergique. Après le lavage l&#39;excès de colorant loin pour environ 30 minutes, les cellules sont prêtes pour être serré de patch et imagé simultanément avec un laser à 488 nm. La solution la pipette de patch contient un peptide rhodamine base qui se lie sélectivement à l&#39;RIBEYE protéines synaptiques ruban<sup&gt; 4</sup&gt;, Ce qui l&#39;étiquetage des rubans spécifiquement lorsque les terminaux sont imagés avec un laser 561 nm. Cela permet la localisation précise des zones actives et la séparation des synaptique à partir des événements extra-synaptiques.

Dans cette vidéo, nous démontrons comment étiqueter et de visualiser seule exocytose des vésicules synaptiques et la traite des cellules rétiniennes bipolaires poissons rouges en utilisant la fluorescence totale internes réflectance (FRBR) microscopie.

L&#39;exocytose imagerie dans les cellules bipolaires rétine par microscopie TIRF

La microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRF) est une technique qui permet l'étude d'événements se produisant au niveau de la membrane cellulaire, grâce à une sélection...

Cette procédure commence par la dissection de la rétine nerveuse de poissons rouges adultes, qui correspond au tissu nerveux situé à l'arrière de l'œil. Les rétines sont placées dans une solution enzymatique pendant 35 minutes, rincées puis triturées à l’aide d’une pipette en verre à embout feuilleté pour dissocier les cellules. Les cellules sont ensuite ensemencées sur des lamelles en verre à haut indice de réfraction et montées dans des boîtes de culture plastiques. Les cellules bipolaires isolées sont identifiées par leur morphologie distincte afin de charger leurs terminaisons. Nous appliquons une brève impulsion pendant 10 secondes avec une solution contenant du FM 1-43, puis attendons 30 secondes avant de laver le colorant. Après un lavage de 30 minutes, les cellules sont soumises à la technique du patch, fixées en potentiel et observées par microscopie TIRF.Bonjour, je m'appelle Christina Jovi du laboratoire ZEC du Département de physiologie cellulaire et moléculaire de la faculté de médecine de l'Université Yale. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'étudier l'exocytose dans des cellules bipolaires rétiniennes vivantes à l'aide de la microscopie TURF. Nous utilisons cette procédure au laboratoire pour étudier les mécanismes de libération synaptique.Commençons. Pour commencer, adaptez un poisson rouge à l'obscurité pendant au moins 30 minutes avant la dissection. Après la décapitation et l'ablation de l'œil, placez un globe oculaire sur un morceau de papier filtre et utilisez la pointe d'une lame de bistouri n°11 pour percer le limbe scléral. À l'intérieur du trou percé.Utilisez une paire de ciseaux de Bonna pour découper tout le segment antérieur. Ensuite, placez un petit morceau de papier filtre sur le cupula optique restant et exercez une légère pression pour l'inciter à absorber l'humeur vitrée. Soulevez le papier filtre avec la rétine attachée et, à l’aide d’une paire de ciseaux VNA, sectionez le nerf optique.Placer le papier filtre contenant la rétine dans une boîte de culture plastique de 35 millimètres contenant de la solution haute en alur et utiliser des pinces Dumont n°7 pour détacher la rétine du papier filtre. Ensuite, à l’aide de la moitié d’une lame industrielle en acier au carbone à bord unique, couper la rétine en quatre à six morceaux et les laisser tremper dans la solution d’hyaluronidase pendant 20 minutes. En attendant que l’hyaluronidase agisse, ajouter cinq millilitres de solution de L-cystéine à la papaine et laisser reposer environ cinq à dix minutes, jusqu’à ce que le liquide devienne transparent. Rincer les morceaux de rétine trois fois dans une solution de Ringer à faible teneur en calcium et les laisser tremper dans la solution de papaine pendant 30 à 35 minutes.Après une incubation de 35 minutes dans la solution de papaine, lavez les fragments rétiniens trois fois. Transférez les fragments dans une boîte de culture plastique de 35 millimètres contenant du ringer à faible teneur en calcium, et conservez la boîte à 12 à 14 degrés Celsius jusqu'à ce que vous soyez prêt à commencer la dissociation des cellules.Tout d'abord, fabriquez une pipette de dissociation en chauffant l'extrémité d'une pipette en verre PE ou d'une pipette à l'aide d'un bec Bunsen, puis utilisez des pinces anatomiques pour la courber légèrement. Placez un morceau de rétine dans un tube de microcentrifugeuse contenant une solution de Ringer à faible concentration en calcium et dissociez délicatement la rétine en aspirant et en expulsant lentement la suspension à l'aide de la pipette de dissociation confectionnée. Veillez à ne pas produire de bulles d'air et déposez les cellules isolées en ajoutant une goutte de la suspension rétinienne dans une chambre d'enregistrement maison remplie de solution de Ringer à faible concentration en calcium.La chambre est constituée de la moitié inférieure d'une boîte de culture plastique de 35 millimètres, comportant un orifice circulaire au centre, et d'un couvre-objet circulaire en verre d'indice de réfraction 1,78 collé au fond. L'isolement des cellules bipolaires et la dissection étant terminés, nous sommes prêts à commencer le chargement et le lavage des cellules bipolaires. Dans cette expérience, il est préférable d'utiliser un microscope à fluorescence par réflexion totale interne de type objectif, équipé d'un objectif à très grande ouverture numérique et d'une caméra sensible.Dans cette vidéo, nous utiliserons un objectif à ouverture numérique de 1,65 et un dispositif électronique à multiplication de charge couplé. Pour commencer, ajoutez une goutte de liquide à indice de réfraction élevé sur l'objectif du microscope. Placez la chambre d'enregistrement au-dessus de l'objectif du microscope.Fixez soigneusement l'électrode de masse et le tuyau de sortie de la superfusion sur la chambre. Laissez la chambre reposer sur le microscope pendant 10 à 20 minutes, afin de permettre aux cellules de couler et d'adhérer au fond. Ensuite, purgez les lignes de superfusion et ajoutez la solution de lavage.Solution de Ringer à faible teneur en calcium et solution de Ringer contrôle vers le système de superfusion. Allumez la lumière de champ clair du microscope et recherchez des cellules bipolaires intactes. Tapez légèrement sur le microscope pour vous assurer que les neurones sont fermement attachés au fond de la chambre.Positionnez le stylo de superfusion près d'une cellule intacte et perfusez continuellement le prélèvement avec une solution de Ringer à faible teneur en calcium. Éteignez maintenant les lumières dans la pièce et ajoutez un filtre passe-long rouge dans le trajet optique afin de minimiser l'excitation de la sonde fluorescente. Remplissez une pipette de chargement avec 10 microlitres de solution de colorant fluorescent.Montez-le sur le micromanipulateur, puis abaissez-le sur la préparation sans utiliser l'option de surpression jusqu'à ce qu'il se trouve dans le même plan focal que la cellule bilatérale sélectionnée. Positionnez l'ouverture du piqueur à une distance d'environ 10 micromètres de la terminaison axonale. Arrêtez le système de perfusion superficielle et appliquez la solution de colorant pendant 10 secondes en activant la surpression sur la pipette.Maintenant, arrêtez la pression excessive sans déplacer la pipette. Attendez 30 secondes, allumez le système de superfusion et immergez la chambre dans la solution de lavage pendant cinq minutes. Pendant ce temps, retirez la pipette puffer du bain.Après cinq minutes, passez le système de SUPERFUSION à la solution de Ringer à faible teneur en calcium et perfusez pendant 25 à 30 minutes, ce qui permet d'éliminer l'excès de colorant une fois le chargement et le lavage des cellules bipolaires terminés. Nous sommes alors prêts à commencer le patch-clamp et l'imagerie T-I-R-F-M. Une fois le lavage terminé, changez les porte-électrodes afin d'éviter toute contamination de votre pipette de patch par le colorant.Placer le terminal axonal au centre du champ de vision. Remplir une pipette de patch avec sept microlitres de solution interne. Tapoter la pipette pour éliminer les bulles d'air.Recouvrez-le de cire dentaire fondue, puis fixez-le sur le micromanipulateur. Inversez la pipette, appliquez une pression et abaissez lentement la pipette sur le prélèvement. Vérifiez la résistance de la pipette et effectuez les corrections nécessaires.Ensuite, avec le système de perfusion réglé sur la solution de Ringer contrôle, créez un scellement gigaseal entre la pipette et la cellule en effleurant légèrement l'extrémité de l'électrode contre le corps cellulaire. Une fois le scellement établi, retirez la pression sur la pipette et appliquez doucement une pression négative à l'électrode. Sélectionnez le mode « cellule entière » sur l'amplificateur et réglez le potentiel de maintien de la cellule à moins 60 millivolts.Utilisez maintenant un logiciel d'imagerie pour sélectionner une région d'intérêt englobant tout le terminal axonal. Éteignez la lumière en champ clair et exposez brièvement le terminal au laser de 488 nanomètres. Trouvez le plan focal approprié pour l'imagerie TIRF.Ensuite, pénétrez dans la cellule en utilisant la commande « zap » de l'amplificateur tout en appliquant une légère pression négative à la pipette, puis corrigez la capacité cellulaire et la résistance en série. Appliquez ensuite le protocole de tension tout en imager le déplacement des vésicules synaptiques. Attendez au moins 40 secondes entre chaque essai pour permettre la récupération.Tout d'abord, nous choisissons une cellule bipolaire en microscopie de champ clair. Nous effectuons ensuite un zoom et chargeons son terminal axonal avec un colorant fluorescent. Après un lavage de 30 minutes, le terminal marqué peut être observé en microscopie à fluorescence, ainsi que le déplacement des vésicules glutamatergiques fluorescentes.Ici, nous introduisons un peptide fixant l'œil de ruban par la pipette de patch, ce qui nous permet de visualiser la position des rubans synaptiques lorsqu'ils sont observés avec un laser de 561 nanomètres. Nous dépolarisons ensuite les cellules et imprimons le mouvement des vésicules avec un laser de 488 nanomètres. Nous venons de vous montrer comment dissocier une plaque et charger des cellules bipolaires rétiniennes avec un colorant fluorescent, ainsi que comment réaliser un patch, bloquer ces neurones et les imager simultanément par microscopie TURF.Lors de cette procédure, il est important de ne pas trop exposer les cellules au laser. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biologie

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