Name: Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Découvrez la microscopie de chatoiement fluorescent pour étudier la dynamique de l'actine dans les cellules vivantes. Cette méthode permet des mesures quantitatives de la cinétique des protéines cytosquelettiques en temps réel.

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Le développement de qFSM est financé par le NIH U01 GM06230.

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Plusieurs facteurs clés sont indispensables pour réussir à obtenir des images de speckle, taches aussi bonne commencent et finissent avec la qualité de votre actine marqués par fluorescence. Un ratio élevé de l&#39;étiquetage de teinture à l&#39;actine monomère, autour de 0,4 à 0,7 veillera à ce que taches apparaissent lumineux et discret, tandis que la protéine marquée elle-même doit être soluble et libre de granulats. Tout aussi importante est la procédure la microinjection. Pour assurer l&#39;homéostasie cellulaire n...

Injection de tampon (IB) 50 mM de glutamate de potassium 0,5 M de MgCl2 (annexe 2A) Stockez jusqu&#39;à 2 ans à -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM de Tris Cl ⋅, pH 8,0 (annexe 2A) 0,2 mM CaCl2 (annexe 2A) Ajouter juste avant utilisation: 0,2 mM d&#39;ATP (voir recette de 100 mM) 0,5 mM de 2-mercaptoéthanol Stockez jusqu&#39;à 1 jour à 4 ° C

imagerie de cellules vivantes de la f-actine fluorescente dynamics via chatoiement de microscopie (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la microscopie fluorescente chatoiement (FSM) pour capturer des images haute résolution de la dynamique de l&#39;actine dans les cellules PtK1. Un avantage unique de la FSM est sa capacité à capturer le mouvement et la cinétique chiffre d&#39;affaires (montage / démontage) du réseau de la F-actine dans les cellules vivantes. Cette technique est particulièrement utile dans découlant des mesures quantitatives de F-actine dynamiques quand il est associé avec le logiciel de vision par ordinateur (qFSM). Nous décrivons la sélection, la micro-injection et la visualisation des sondes fluorescentes actine dans les cellules vivantes. Surtout, des procédures similaires sont applicables aux assemblées macomolecular visualisant les autres. FSM a été démontrée pour les microtubules, filaments intermédiaires, et des complexes d&#39;adhérence.

Sélection, la microinjection, et l&#39;imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la microscopie à tachetures fluorescentes (FSM) pour capturer des images à haute résolution de la dynamique de l'actine dans des cellules PtK1. Un...

La microscopie à taches fluorescentes est utilisée pour étudier la dynamique de diverses protéines du cytosquelette dans des cellules vivantes. Lorsqu'elle est utilisée correctement, il est possible d'obtenir des mesures quantitatives de la vitesse et des cinétiques de renouvellement des protéines du cytosquelette. Nous commençons cette procédure par une microinjection d'un petit volume d'actine marquée fluorescentement dans des cellules vivantes.Nous assemblons ensuite la chambre d'imagerie afin de réduire les effets du photoblanchiment. Deux morceaux de ruban adhésif double face sont d'abord placés de chaque côté de la lame microscopique, là où reposera notre lamelle contenant les cellules. Ensuite, le milieu d'imagerie est pipeté dans la chambre en déposant le milieu près de l'une des fentes ouvertes.Enfin, les quatre côtés sont scellés avec du valet. Bonjour, je m'appelle James Lim et je travaille au laboratoire de Galden's Deucer, dans le Département de biologie cellulaire de l'Institut de recherche Scripps. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de microscopie à taches fluorescentes.Nous utilisons cette procédure pour étudier la dynamique de l’actine dans les cellules épithéliales migrantes. Commençons donc. Un élément essentiel pour obtenir de bons films de microscopie à taches fluorescentes est l’étiquetage adéquat de l’actine. À l’aide du fluorophore de votre choix, nous recommandons d’utiliser des dérivés de type ester mixte d’Alexa Fluor ou de Xérodine Cin, qui ciblent les résidus de lysine exposés à la surface de l’actine.Il est important que le taux de marquage soit élevé, de l'ordre de 0,3 à 0,7 colorants par monomère d'actine, afin de garantir que les taches apparaissent brillantes et bien définies avant un stockage prolongé. Clarifier la solution d'actine marquée par centrifugation à 75 000 à 80 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. L'actine marquée doit être conservée en solution tampon G à moins 80 degrés Celsius.Préparez des aliquotes de deux microlitres afin d'éviter les cycles répétés de congélation-décongélation, qui peuvent entraîner la formation d'agrégats insolubles. Pour éviter la décoloration photochimique des floral fours, n'exposez pas la solution d'actine marquée à la lumière directe pendant de longues périodes et utilisez des tubes microcentrifuges opaques pour le stockage à long terme. Les cellules destinées à la microinjection sont placées sur des lamelles carrées en verre traitées à l'acide.Un revêtement standard de substrat peut être appliqué sur la lame et ne perturbera pas la microinjection. Conservez les cellules à 37 degrés pendant la préparation de l'actine afin de sélectionner les cellules propices à la microinjection. Pour la FSM, prenez en compte ces critères.Les cellules doivent être grandes, de diamètre supérieur à 50 micromètres, s’aplatir après leur ensemencement et adhérer naturellement aux substrats. Il est également utile que la région isolée de la cellule occupe une surface plus grande que celle de son noyau. Certaines lignées cellulaires appropriées incluent PTK one, les cellules pulmonaires de triton et les neurones AIA.Dans cette démonstration, nous allons injecter des cellules épithéliales PTK1. Le choix correct des microaiguilles dépend de la taille de l'ouverture de la pointe. En général, les diamètres des trous peuvent varier de 0,5 micromètre à trois micromètres.Nous recommandons une taille d'ouverture optimale comprise entre 0,5 et un micromètre. Pour l'injection, les microaiguilles peuvent être achetées ou fabriquées. Si un tireur d'aiguilles commercial est disponible, nous conseillons aux débutants d'avoir 10 à 20 aiguilles tirées prêtes avant de commencer la procédure d'injection.L'étape suivante consiste à diluer l'actine marquée avec du tampon de perfusion glacé. Conservez toutes les solutions de travail sur glace. La concentration idéale de perfusion, qui correspond à la concentration finale d'actine chargée dans l'aiguille, se situe entre 0,5 et 1 microgramme par microlitre.En fonction d'un taux d'étiquetage de 40 % de D par rapport à la charge de monomère d'actine, charger de 0,5 à un microlitre de la solution d'actine diluée. À l'aide d'une aiguille de microsyringe, distribuer soigneusement la solution d'actine. Essayer d'éviter les bulles.S'il y a des bulles, elles peuvent être facilement éliminées en aspirant les liquides excédentaires situés autour de la bulle. Veillez à ce que la solution d'Acton repose entièrement à l'extrémité de l'aiguille. Il ne doit pas y avoir de solution en excès le long du capillaire de l'aiguille, car cela pourrait perturber le débit d'injection.L'aiguille chargée est désormais prête à être fixée au porte-injecteur pour la microinjection. Récupérez vos cellules à partir de l'incubateur et placez la lamelle sur la platine du microscope. Pour commencer la procédure de microinjection, apportez l'aiguille chargée au microscope.Fixez soigneusement l'aiguille en évitant tout contact avec la pointe de l'aiguille sur le porte-injecteur. Positionnez le porte-injecteur de manière à ce que l'aiguille forme un angle de 35 à 50 degrés par rapport à la base de la platine du microscope. Abaissez la pointe de l'aiguille jusqu'à ce qu'elle perce à peine la surface du milieu de bain.Positionnez maintenant vos cellules de sorte que la pointe de l'aiguille se trouve directement au-dessus du centre de l'objectif. Si la pointe de l'aiguille est alignée avec l'objectif, vous devriez voir un halo lumineux à travers l'oculaire. C'est la fin de la pointe de l'aiguille.Déplacer lentement l'aiguille de côté à côté peut aider à mieux localiser l'halo. Lors de la navigation, assurez-vous que la pointe de l'aiguille est bien au-dessus de vos cellules. Pour éviter de casser la pointe de l'aiguille, ajustez le Z.Focus du microscope jusqu'à ce que vos cellules soient clairement visibles.Abaissez ensuite lentement la pointe de l'aiguille tout en contrôlant la mise au point, jusqu'à ce que le halo se rétrécisse progressivement et converge finalement vers la pointe de l'aiguille. Vous pouvez également repérer le corps de l'aiguille, qui projette des ombres linéaires. L'abaissement de l'aiguille permettra de définir progressivement le corps de l'aiguille.De légers ajustements de l'anneau de phase peuvent être nécessaires pour améliorer le contraste ; à présent, l'extrémité de l'aiguille et vos cellules doivent être clairement visibles. Lors du choix des cellules à injecter, privilégiez celles dont les bords libres sont orientés vers l'extrémité de l'aiguille. Cela garantit que la pente décroissante de la cellule, allant du point le plus épais où se trouve le noyau jusqu'au point le plus mince du bord antérieur, rencontrera l'extrémité de l'aiguille plutôt que de lui être parallèle.Réglez la pression de l'aiguille entre 0,3 et 0,8 PSI. La pression constante appliquée entraînera un écoulement régulier de la solution d'actine. Une fois que vous avez choisi une cellule à injecter, positionnez l'aiguille de manière à ce que sa pointe soit à côté du noyau de la cellule, puis abaissez-la lentement et réajustez sa position jusqu'à ce que la pointe exerce une pression.Abaissez progressivement l'aiguille jusqu'à ce que sa pointe ait traversé la membrane. Si l'aiguille a complètement traversé la membrane, la cellule apparaîtra plus lumineuse. Dès que vous observez ce changement, remontez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle ne touche plus la cellule.Le processus réel de perforation et d'injection durera de 0,5 à deux secondes. Lorsqu'il est correctement effectué, la forme de la cellule apparaîtra inchangée. Afin de minimiser le stress subi par les cellules, ne consacrez pas plus de 20 à 45 minutes à chaque séance de microinjection.Parfois, vous ne pouvez pas observer de changements dans la cellule lors de l'injection et la cellule ne devient pas plus brillante. Cela indique que la pointe de l'aiguille pourrait être obstruée. Vous pouvez tester cela en appuyant sur le bouton de nettoyage, s'il est disponible sur votre injecteur trans.Si la pointe de l'aiguille est ouverte, cela augmentera considérablement le débit à pression constante, ce qui se manifestera par des ondulations et une dispersion des débris environnants. Si la pointe de l'aiguille est obstruée, vous pouvez soit insérer une nouvelle aiguille de microinjection, soit tenter de briser la pointe en abaissant délicatement l'aiguille jusqu'à ce que sa pointe appuie contre la lame de verre, provoquant ainsi la rupture de l'extrémité terminale.La zone de rupture ne doit pas dépasser un cinquième de la surface de la pointe de l'aiguille, c'est-à-dire la partie de l'aiguille qui commence à converger vers une pointe, une fois la microinjection terminée. Remplacer le milieu cellulaire dans la boîte par du milieu frais préchauffé afin d'éliminer tout résidu fluorescent. Après le changement de milieu, laisser les cellules se rétablir pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés avant l'acquisition d'images.Cela permettra également à l’actine de s’intégrer au réseau cytosquelettique existant pendant que les cellules se rétablissent dans l’incubateur ; commencez à assembler la chambre d’imagerie. Préchauffez tout d’abord le milieu d’imagerie dans un bain-marie à 37 degrés. Ensuite, décongelez un aliquot de 15 microlitres d’oxa erase à température ambiante.L'ajout d'acide rétinoïque (RA) ultérieurement dans le milieu réduira considérablement les effets de photodégradation. Conserver l'oxa erase enveloppé dans du papier d'aluminium garantira que le composé photosensible soit protégé de la lumière. Préchauffer le scellant VAP sur un agitateur chauffant réglé à faible température, sans surchauffer ni brûler le VAP, sinon il perdra son efficacité en tant que scellant.Essuyez une lame microscopique avec un chiffon Kim imbibé d'éthanol pur pour nettoyer et éliminer les petits débris. Superposez deux morceaux de ruban adhésif double face de taille égale, de 2,5 centimètres de long, l'un sur l'autre, en utilisant une surface plane propre telle qu'une autre lame microscopique. En tant que plate-forme, faites sortir toutes les bulles d'air emprisonnées afin de créer un plan parfaitement plat.Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour découper deux bandes droites le long de l'axe longitudinal du ruban adhésif, de sorte que chaque bande mesure 0,5 centimètre de largeur. À l'aide de pinces, placez chaque bande le long des bords longs de votre lame de microscope, de manière à ce que les deux bandes de ruban créent un espace au centre de la lame. Appuyez doucement sur le ruban pour obtenir un bon scellement avec le verre.Ces bandes de ruban serviront d'espacements entre la lame microscopique et la lamelle. Vérifiez la vanne pour vous assurer qu'elle a complètement liquéfié. Avant de commencer l'étape suivante, récupérez votre milieu d'imagerie préchauffé.Ajoutez 15 microlitres d'oxy rays à chaque 500 microlitres de milieu. Pliez une lingette chimique en triangle pour créer trois bords rigides. Cette forme sera utilisée pour essuyer la lamelle ultérieurement.Retirer les cellules de l’incubateur à l’aide de pinces. Saisir rapidement un coin du lamelle. Placer le lamelle sur une serviette Kim avec la face contenant les cellules vers le haut, sans que celle-ci touche le tissu, puis utiliser la serviette Kim pliée pour essuyer deux côtés opposés du lamelle afin d’obtenir une surface semi-sèche.Ensuite, saisissez un coin de la lame à l’aide de pinces et placez la lame sur la lamelle de manière à ce que les surfaces sèches soient alignées avec les deux bandes de ruban adhésif. Observez que vous disposez maintenant de deux côtés fermés et de deux fentes ouvertes. Introduisez lentement 200 microlitres de votre solution RA de milieu d’imagerie près de l’une des ouvertures à l’aide d’une pipette.Il est important de ne pas introduire de bulles d'air. La solution doit être aspirée dans la chambre nouvellement assemblée par des forces capillaires, immergeant ainsi complètement vos cellules dans la solution. À l'aide d'un coton-tige, tamponnez les quatre coins de votre lame avec du vap fondu afin de fixer et stabiliser rapidement la lame.Vous remarquerez que le VAP sèche en quelques secondes à température ambiante. Ensuite, en partant des côtés fermés, appliquez une fine bande de VAP à l’aide du coton-tige en imitant un mouvement de brossage. Répétez l’opération pour les côtés ouverts.Construisez lentement la couche de VAP, en renforçant le scellement en répétant les étapes de revêtement. Le VAP doit être limité aux bords, en laissant le centre de la lame couvre-objet transparent. Une fois les bords de la lame couvre-objet scellés, nettoyez délicatement la partie centrale de la lame couvre-objet à l’aide d’un coton-tige imbibé d’eau DD H2O pour éliminer tout milieu résiduel.Veillez à ne pas écraser les cellules. Répétez cette étape de nettoyage avec de l'éthanol pur. Vous disposez maintenant d'une chambre d'imagerie entièrement fermée, optimisée pour l'imagerie par taches fluorescentes.Un boîtier entièrement scellé empêchera vos cellules florales de se décolorer rapidement par photoblanchiment. Les cellules dans la chambre entièrement close sont désormais prêtes à être observées. Nous utilisons un microscope inversé à champ large équipé d'une lampe au mercure, d'un épi-éclairage, de filtres appropriés et d'un objectif à immersion huile plan.Les images capturées avec des objectifs apochromatiques sont obtenues à l’aide d’une caméra CCD refroidie équipée de pixels de 6,7 micromètres et d’un logiciel d’acquisition d’images. Préchauffez la platine du microscope à 37 degrés. Placez la chambre d’imagerie et attendez de 10 à 15 minutes afin que la température se stabilise avant de débuter l’imagerie.Une fois que la température est stabilisée, mettez vos cellules au point en champ clair, puis repérez vos cellules injectées en activant les réglages fluorescents appropriés. Essayez de minimiser le temps d'exposition à la fluorescence afin de réduire le photoblanchiment. Recherchez des cellules injectées présentant des bords antérieurs sains et incurvés.Les cellules surinjectées seront caractérisées par des bords rétractés et irréguliers, ressemblant à de nombreux phylopodes. N'analysez pas en image ces cellules. Les paramètres d'acquisition dépendront du type cellulaire, de la qualité de l'actine marquée et des composants du microscope.Cependant, les réglages d'exposition ne doivent pas dépasser deux secondes et l'intervalle de temps entre les images doit être fixé entre cinq et dix secondes. Les réglages de gain sur la caméra peuvent être augmentés pour améliorer le rapport signal sur bruit. Les caractéristiques idéales des taches doivent présenter une distance d'environ deux diamètres de tache entre chaque tache et sa voisine la plus proche.Pour les cellules épithéliales, le réseau d'actine en taches apparaîtra homogène, avec des taches réparties uniformément. Les réglages d'exposition doivent être ajustés pour obtenir les meilleures images en taches.La clé pour obtenir de bons films de taches est de maintenir la mise au point. Cela est particulièrement important pour l'analyse postérieure impliquant des mesures d'écoulement et de renouvellement des taches. Ainsi, la qualité de l'analyse quantitative dépendra de la stabilité de la mise au point pendant toute la durée de la prise de vue en laps de temps.Diverses stratégies pour maintenir le focus sont décrites dans le texte, car cette démonstration utilisera le système de focus parfait Nikon. Voici différents exemples de cellules micro-injectées. Le panneau de gauche montre une cellule sous-micro-injectée avec une image de taches à faible concentration.Le panneau central montre une cellule sur-microinjectée avec une image de taches présentant une concentration trop élevée, et le panneau droit montre une cellule microinjectée de manière optimale. Pour la microscopie à taches fluorescentes (FSM) avec une bonne image de taches, nous venons de vous montrer comment microinjecter de l’actine marquée fluorescentement dans des cellules épithéliales.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est extrêmement important de garder à l'esprit que la qualité de votre actine marquée, ainsi que la technique de microinjection, détermineront la qualité globale de vos images de taches. Voilà, et bonne chance avec vos expériences.

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