Name: Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Découvrez la microscopie de chatoiement fluorescent pour étudier la dynamique de l'actine dans les cellules vivantes. Cette méthode permet des mesures quantitatives de la cinétique des protéines cytosquelettiques en temps réel.

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Le développement de qFSM est financé par le NIH U01 GM06230.

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Plusieurs facteurs clés sont indispensables pour réussir à obtenir des images de speckle, taches aussi bonne commencent et finissent avec la qualité de votre actine marqués par fluorescence. Un ratio élevé de l&#39;étiquetage de teinture à l&#39;actine monomère, autour de 0,4 à 0,7 veillera à ce que taches apparaissent lumineux et discret, tandis que la protéine marquée elle-même doit être soluble et libre de granulats. Tout aussi importante est la procédure la microinjection. Pour assurer l&#39;homéostasie cellulaire n...

Injection de tampon (IB) 50 mM de glutamate de potassium 0,5 M de MgCl2 (annexe 2A) Stockez jusqu&#39;à 2 ans à -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM de Tris Cl ⋅, pH 8,0 (annexe 2A) 0,2 mM CaCl2 (annexe 2A) Ajouter juste avant utilisation: 0,2 mM d&#39;ATP (voir recette de 100 mM) 0,5 mM de 2-mercaptoéthanol Stockez jusqu&#39;à 1 jour à 4 ° C

imagerie de cellules vivantes de la f-actine fluorescente dynamics via chatoiement de microscopie (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Dans ce protocole, nous décrivons l&#39;utilisation de la microscopie fluorescente chatoiement (FSM) pour capturer des images haute résolution de la dynamique de l&#39;actine dans les cellules PtK1. Un avantage unique de la FSM est sa capacité à capturer le mouvement et la cinétique chiffre d&#39;affaires (montage / démontage) du réseau de la F-actine dans les cellules vivantes. Cette technique est particulièrement utile dans découlant des mesures quantitatives de F-actine dynamiques quand il est associé avec le logiciel de vision par ordinateur (qFSM). Nous décrivons la sélection, la micro-injection et la visualisation des sondes fluorescentes actine dans les cellules vivantes. Surtout, des procédures similaires sont applicables aux assemblées macomolecular visualisant les autres. FSM a été démontrée pour les microtubules, filaments intermédiaires, et des complexes d&#39;adhérence.

Sélection, la microinjection, et l&#39;imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la microscopie à tachetures fluorescentes (FSM) pour capturer des images à haute résolution de la dynamique de l'actine dans des cellules PtK1. Un...

La microscopie à taches fluorescentes est utilisée pour étudier la dynamique de diverses protéines du cytosquelette dans des cellules vivantes. Lorsqu'elle est utilisée correctement, il est possible d'obtenir des mesures quantitatives de la vitesse et des cinétiques de renouvellement des protéines du cytosquelette. Nous commençons cette procédure par une microinjection d'un petit volume d'actine marquée fluorescentement dans des cellules vivantes.Nous assemblons ensuite la chambre d'imagerie afin de réduire les effets du photoblanchiment. Deux morceaux de ruban adhésif double face sont d'abord placés de chaque côté de la lame microscopique, là où reposera notre lamelle contenant les cellules. Ensuite, le milieu d'imagerie est pipeté dans la chambre en déposant le milieu près de l'une des fentes ouvertes.Enfin, les quatre côtés sont scellés avec du valet. Bonjour, je m'appelle James Lim et je travaille au laboratoire de Galden's Deucer, dans le Département de biologie cellulaire de l'Institut de recherche Scripps. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure de microscopie à taches fluorescentes.Nous utilisons cette procédure pour étudier la dynamique de l’actine dans les c

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Ce document vise à instruire le lecteur dans le fonctionnement d'un système intégré à force atomique, microscope optique d'imagerie pour la stimulation mécanique des cellules vivantes en culture. Un protocole étape par étape est présentée. Un ensemble représentatif de données qui montre la réponse de cellules vivantes à la stimulation mécanique est présenté.

Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d'actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

Les informations spatio-temporelles sur les protéines dynamiques à l’intérieur des cellules vivantes sont cruciales pour comprendre la biologie. Un type de microscopie à super-résolution appelé microscopie à illumination rapide structurée en 3D (f3D-SIM) révèle des informations uniques sur l’anneau cytocinétique Z chez les bactéries : à la fois son apparence en forme de perle et la dynamique rapide de FtsZ à l’intérieur de l’anneau.

Super-résolution d&#39;imagerie de l&#39;Anneau Z cytokinétique en utilisant des bactéries vivantes 3D structuré rapide Illumination Microscopy (F3d-SIM)

La distribution spatiale et la dynamique temporelle des protéines et des lipides de la membrane plasmique sont un sujet brûlant en biologie. Ici, cette question est abordée par une analyse de fluctuation d’image spatio-temporelle qui fournit conceptuellement les mêmes quantités physiques de suivi de particules uniques, mais elle utilise de petits marqueurs moléculaires et des configurations de microscopie standard.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

Pour étudier les vitesses d’écoulement et la directionnalité de l’actine filamenteuse au niveau de la synapse immunologique des lymphocytes T, l’imagerie à super-résolution des cellules vivantes est combinée à la fluorescence par réflexion interne totale et quantifiée par spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Nous présentons un protocole pour l'application de localisation interférométrique photoactive Microscopie (iPALM), une méthode nanoscope trois dimensions molécule unique de localisation, à l'imagerie du cytosquelette d'actine dans les cellules de mammifères adhérentes. Cette approche permet la visualisation à base de lumière des caractéristiques structurelles nanométriques qui autrement resteraient en suspens par microscopie optique à diffraction limitée classique.

Trois dimensions Super Resolution Microscopie de Filaments F-actine par interférométrique photoactive Localisation Microscopy (iPALM)

Ce protocole décrit une nouvelle méthode permettant la visualisation quantitative de la formation d’un complexe de protéines SNARE, basée sur le transfert d’énergie Förster et durée de vie de fluorescence imaging microscopy.

Visualisation de SNARE intracellulaire traite par Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Ici, nous présentons des méthodes pour préparer des assemblages d’actine quasi-bidimensionnels (2D) intriqués, réticulés et à cristaux liquides à partir de protéines purifiées.

Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

Découvrez la microscopie de chatoiement fluorescent pour étudier la dynamique de l'actine dans les cellules vivantes. Cette méthode permet des mesures quantitatives de la cinétique des protéines cytosquelettiques en temps réel.

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

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