Name: En électroporation in vivo et ex utero pour lexpression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Découvrez l'électroporation in utero et ex vivo pour manipuler l'expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de souris. Ces techniques permettent d'étudier le développement rétinien et les voies de projection visuelles.

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Nous remercions le Dr Richard Vallee et Brikha Shrestha de l&#39;aide pour l&#39;in utero et ex vivo des techniques d&#39;électroporation de la rétine, respectivement, et le Dr T. Sakurai pour les commentaires sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes Health F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Médicale, et le Human Frontier Science Program (AR) et R01 EY12736 (CM).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous avons démontré techniques d&#39;électroporation, à la fois in utero et ex vivo, pour la livraison de gènes dans embryonnaire murin CGR. Électroporation in utero rétine fournit un mécanisme permettant de manipuler l&#39;expression des gènes dans les CGR et de visualiser leurs projections axonales in vivo. Permettre les embryons permet de survivre après la naissance examen de ces cellules GFP + projections CJR dans leur cible, le corps genouillé latéral (CGL). Ex vivo électroporation rétine fournit une capacité de plus contrôlée de cibles spécifiques des régions rétiniennes pour une utilisation avec des tests in vitro. Combinant in vivo et in vitro d&#39;analyses issus de ces techniques permet une caractérisation approfondie du développement et des projections axonales CJR dans un sous-ensemble de CGR dans un contexte par ailleurs normal. Alors que notre manifestation se concentre sur CJR axone d&#39;orientation au niveau du chiasma optique, à la fois in utero et ex vivo électroporations rétine pourrait être bénéfique pour étudier comment les perturbations dans la différenciation effet l&#39;expression des gènes du CJR, la morphologie dendritique, les propriétés électrophysiologiques, la formation des synapses et de ciblage approprié dans les zones de résiliation comme le LGN et colliculus supérieur.

<table><tbody><tr><td>Électroporateur carré BTX ECM 830 (avec pédale)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes en pince ronde</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 ou CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Fils de soie</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes en verre avec plongeurs</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycotique</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Milieu DMEM/F12</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Supplément ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à puits avec fond en verre</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

en électroporation in vivo et ex utero pour l&#39;expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

La rétine et ses neurones de sortie seule, la cellule ganglionnaires de la rétine (CJR), comprennent un excellent modèle dans lequel l&#39;examen des questions biologiques tels que la différenciation cellulaire, guidage axonal, organisation rétinotopiques et [1] la formation des synapses. Un inconvénient est l&#39;impossibilité de manière efficace et fiable de manipuler l&#39;expression des gènes dans les CGR in vivo, en particulier dans le autrement accessible murin voies visuelles. Les souris transgéniques peuvent être utilisés pour manipuler l&#39;expression des gènes, mais cette approche est souvent coûteux, prend du temps, et peut produire des effets secondaires indésirables. En poussin, de l&#39;électroporation in ovo est utilisée pour manipuler l&#39;expression des gènes dans le CGR pour examiner la rétine et le développement du CJR. Bien que les techniques d&#39;électroporation similaires ont été développés dans souriceaux nouveau-nés [2], chez le rat adulte [3], et embryonnaires murines in vitro de la rétine [4], aucune de ces stratégies permettent une caractérisation complète de développement et des projections axonales CJR in vivo. À cette fin, nous avons développé deux applications de l&#39;électroporation, une in utero et ex vivo d&#39;autres, de cibler spécifiquement embryon murin CGR [5, 6]. Avec l&#39;électroporation in utero de la rétine, on peut réguler négativement ou misexpress gènes spécifiques dans CGR et de suivre leurs projections axonales par les voies visuelles in vivo, permettant l&#39;examen des décisions d&#39;orientation à des objectifs intermédiaires, comme le chiasma optique, ou à des régions cibles, tels que le corps genouillé latéral. Perturber l&#39;expression des gènes dans un sous-ensemble de CGR dans un contexte autrement type sauvage facilite la compréhension de la fonction des gènes à travers la voie de la rétine. De plus, nous avons développé une technique d&#39;accompagnement pour l&#39;analyse de la croissance axonale CJR in vitro. Nous électroporation d&#39;embryons têtes ex vivo, de collecter et incuber toute la rétine, puis préparer les explants à partir de ces jours rétine plus tard. Explants rétiniens peut être utilisé dans une variété d&#39;essais in vitro afin d&#39;examiner la réponse des axones électroporées CJR à des signaux de guidage ou d&#39;autres facteurs. En somme, cet ensemble de techniques accroît notre capacité à réguler négativement ou misexpress gènes dans CGR et devrait grandement aider études examinant le développement du CJR et des projections axonales.

Nous présentons ici deux techniques pour la manipulation de l&#39;expression génique dans des cellules murines ganglionnaires de la rétine (CGR) en<em&gt; In utero</em&gt; Et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation. Ces techniques permettent d&#39;examiner comment des altérations de l&#39;expression des gènes affectent le développement du CJR, guidage axonal, et les propriétés fonctionnelles.

En électroporation in vivo et ex utero pour l&#39;expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

La rétine et son unique neurone de sortie, la cellule ganglionnaire de la rétine (CGR), constituent un excellent modèle pour examiner des questions biologiques telles que la ...

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Biologie

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

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Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

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Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Cette procédure montre comment cibler les interneurones dans le cerveau antérieur de souris en développement au moyen de l’électroporation in utero. Cette technique s’est avérée particulièrement efficace pour obtenir une expression génique sélective dans des sous-types d’interneurones destinés aux couches superficielles du cortex.

Sous-sélective électroporation corticaux Interneurones

Cultures embryonnaires de cellules rétiniennes chiches constituent des outils précieux pour l'étude de la biologie photorécepteur. Nous avons mis au point une technique de transfert de gène efficace sur la base de plasmide électroporation ex ovo de la rétine antérieure à la culture. Cette technique augmente considérablement les efficacités de transfection sur des protocoles actuellement disponibles, ce qui rend possible une manipulation génétique pour ce système.

Efficient Gene Transfer dans Chick rétines pour cellulaires primaires études sur la culture: Un Ex-ovo Approche d'électroporation

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Découvrez l'électroporation in utero et ex vivo pour manipuler l'expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de souris. Ces techniques permettent d'étudier le développement rétinien et les voies de projection visuelles.

En électroporation in vivo et ex utero pour l'expression génique dans les cellules ganglionnaires de la rétine de la souris

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