Facteur-Coated Croissance Placement billes sur des explants du cerveau antérieur dorsal

Donc, ce sont les premiers types de billes que j'utiliserai. Ce sont des billes en gel bleu. Elles sont molles.

Je dois donc utiliser une pipette en verre groupée au bout d'une pipette buccale pour placer ces billes sur les X. Le deuxième type de bille que je vais démontrer est constitué de billes acryliques héparinées. Ce sont des billes rigides, et je vais les placer sur des explants X à l'aide d'une aiguille en tungstène. Voici donc les tubes capillaires en verre que je vais d'abord faire fondre à l'aide du bec Bunsen.

Ensuite, je les tire pour former une pointe plus fine. Je tiens donc le tube capillaire au milieu de la flamme et je le fais rouler pendant que le tube fond. Je sens qu'il devient souple.

Je vais le sortir de la flamme, puis le tirer. Je vais graver une ligne sur le tube capillaire à l’aide de ce stylo à pointe en diamant afin d’obtenir une coupe bien droite. Ensuite, je polirai les extrémités à la flamme pour les nettoyer.

Je vais passer le capillaire dans la flamme pour polir l'extrémité et réduire l'ouverture afin qu'il puisse capturer une microbille au lieu que celle-ci traverse le capillaire. Il est important de noter que vous ne devez pas maintenir le tube capillaire dans la flamme trop longtemps. Il s'agit en réalité d'un passage très rapide, sinon il se scellera.

J'en fabrique généralement plusieurs, car beaucoup se terminent par une pointe scellée par la flamme. C'est difficile à contrôler, donc on en fait simplement plusieurs. Voici un exemple où la pointe a été scellée.

Il s'agit d'un exemple de pipette correcte. J'ai prélevé 250 microlitres des billes agel dans ce tube einor, et je vais les laver cinq fois avec un millilitre de PBS afin d'éliminer la solution azi dans laquelle elles étaient immergées. J'attendrai environ trois minutes pour permettre aux billes de se déposer, puis j'aspirerai l'excès de PBS et répéterai cette opération quatre fois supplémentaires.

Les billes ne se sont pas encore complètement déposées, alors j'attends qu'elles soient bien sédimentées avant d'aspirer l'excès de PBS et de répéter cette opération quatre fois. À la fin, j'ajouterai 300 microlitres de PBS et commencerai à manipuler les billes. Il s'agit d'une pipette buccale standard et je vais simplement prendre la capillarité que j'ai préparée et l'insérer d'environ un tiers de la hauteur.

Tout d'abord, remplissez les pipettes avec du PBS. Le remplissage s'effectue généralement par simple action capillaire. Voici le couvercle d'une boîte de culture de 30 millimètres, sur lequel j'ai déposé une goutte de billes en bleu.

À côté se trouve une petite goutte de PBS. Dans cette boîte, il y a des gouttes de cinq microlitres de solution protéique. Dans ce cas, il s'agit de B et P quatre, mais vous pouvez utiliser une protéine au choix à l'aide d'une pipette buccale.

Je vais transférer une perle depuis ce cercle bleu ici, la rincer une fois dans la goutte de PBS. Ensuite, je prendrai la perle à l’aide de la pipette buccale et la placerai dans la goutte de solution protéique, puis l’incuberai soit à température ambiante pendant environ une heure, soit à 4 degrés pendant plusieurs heures. Ici, vous voyez un ensemble de perles dans du PBS, et je dois sélectionner des perles de la bonne taille.

S'ils sont trop petits, ils passeront simplement par la pipette à bouche. Ils doivent juste rester au bout. Vous voyez donc que j'ai choisi quelques billes ici, trois billes plus grandes et trois billes plus petites.

J'utiliserai les billes plus grandes dans l'expérience. Je vais maintenant transférer une bille de grande taille depuis la goutte de PBS vers la goutte de solution protéique. Pour ce faire, je vais doucement retirer ma langue de la pipette buccale.

Il ne s'agit pas d'un mouvement de succion, mais simplement d'appliquer une pression négative. Ensuite, je vais le transférer et, fondamentalement, replacer ma langue au-dessus de l'embouchure. Tête du tuyau, pas en soufflant, mais en appliquant simplement une pression positive pour faire sortir le battement à l'extrémité.

J'ai maintenant cinq billes dans la goutte de solution protéique, et je vais les incuber à quatre degrés pendant plusieurs heures, ou de manière alternative à température ambiante pendant une demi-heure à une heure. Voici donc la boîte de culture contenant la membrane qui flotte dans le milieu, ainsi que les explants que j'ai déjà disséqués. Je vais prendre l'extrémité de ma pipette et aspirer un peu du milieu.

Je vais rincer les billes dans une goutte de milieu une seule fois, juste avant de placer la bille sur l'X explant. Ce sont les aiguilles en tungstène que j'utiliserai pour ramasser et positionner les billes acryliques. Voici l'aiguille en tungstène, qui se trouve actuellement dans son support.

Et ce sont quelques pinces de qualité. À un angle de 45 degrés. Je vais utiliser mon aiguille au tungstène tenue par la pince pour soulever une perle de ce réservoir de PBS et transférer la perle vers une goutte de solution protéique.

Tout comme j'ai procédé avec les billes Agel, j'ai rincé ces billes acryliques cinq fois dans du PBS et j'ai transféré une goutte sur cette plaque. J'utiliserai ensuite mon aiguille en tungstène fixée dans une pince pour transférer une bille dans une goutte de protéine et l'incuber, exactement comme je l'ai fait avec les billes en gel.

Il s'agit donc de soulever une perle. Je maintiens fermement ma main droite contre la table, et j'utilise mon index gauche pour stabiliser l'aiguille pendant que je pénètre doucement dans le liquide. Je touche légèrement une perle avec l'aiguille, puis je la soulève lentement hors du liquide. Parfois, elle tombe de l'aiguille ; dans ce cas, il suffit de retourner en chercher une autre.

Maintenant, avec ma main gauche, j'ai la pince à angle de 45 degrés. Avec les pointes vers le bas, je touche la perle et l'aiguille au liquide et j'utilise. J'utilise la pointe de la pince pour la dégager doucement.

J'ai donc maintenant cinq billes avec des protéines. Très bien, donc avec ma main droite, j'ai l'aiguille en tungstène dans la bille, et de ma main gauche, je tiens la pince avec la pointe orientée vers le bas, de la même manière que je les ai repoussées des quatre ; je vais le refaire ici sur l'explication x. Incuber à 37 degrés, et la durée dépend du dosage spécifique.