Name: La récolte et la préparation Drosophile Les embryons destinés à lenregistrement électrophysiologique et autres procédures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Apprenez la dissection d'embryons de Drosophila pour l'électrophysiologie et l'immunohistochimie. Cette méthode expose le système neuromusculaire embryonnaire pour étudier le développement et analyser les mutants incapables d'éclore.

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Partie 1: matériel et fournitures <ol><li> Un microscope de dissection est nécessaire pour une bonne dissections embryon; grossissement 40X est suggéré, avec oculaires 25X au maximum à augmenter le grossissement. </li><li> Pinces fines (numéro 5) sont requis pour la sélection manuelle des embryons et des devitellinization d&#39;embryons. </li><li> Équipement pour faire et modifier des aiguilles de verre fine est nécessaire. Tiré de verre aiguilles sont nécessaires pour la dissection. Nous préférons le verre solide pour la dissection (durent plus longtemps), mais la norme de tubes de verre à parois épaisses (diamètre extérieur 1-1,5 mm) fonctionne aussi bien. Certaines personnes utilisent des aiguilles de tungstène fine, électrolysée à la netteté voulue dans un bain de NaOH 1M en utilisant une batterie 10 Amp + autotransformateur. Aiguisé aiguilles de dissection de tungstène ont l&#39;avantage qu&#39;ils sont relativement résistants et durables. Aiguilles de verre creux (formé similaires à patcher électrodes pince) sont attachés aux tuyaux de plastique et utilisées lors de la dissection pour l&#39;aspiration et l&#39;expulsion des salines, ainsi que la livraison contrôlée de colle. Une variété d&#39;extracteurs de verre sont disponibles pour la fabrication d&#39;aiguilles de verre. Ordinateur programmé extracteurs peut être préréglé pour tirer une variété de formes et tailles. Le Brun-Flaming modèles (Sutter Instrument Co.) sont largement favorisées. Un microscope composé (20-40X objectif) devrait être disponible pour inspecter et modifier des électrodes avant d&#39;utiliser. </li><li> Deux types de solutions sont couramment utilisées pour le bain du tissus embryonnaires lors de la dissection: 1) «standard» (Jan et Jan, 1976a) ou &quot;standard modifié&quot; (Broadie, 2000) Salines, basée sur des solutions couramment utilisés pour l&#39;enregistrement dans d&#39;autres systèmes d&#39;invertébrés , et 2) &quot;hémolymphe-like» (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromis entre la solution saline standard et les concentrations ioniques mesurés dans l&#39;hémolymphe de drosophile. Il est à noter qu&#39;aucun de ces salines précisément imiter la composition chimique de l&#39;hémolymphe in vivo (Broadie, 2000). Salines standard contient (en mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl2, 72 sucrose, 5 TES, pH 7,2. Les expérimentateurs peuvent également envisager une solution saline insectes préparés commercialement (insectes par exemple médias Schneider), qui est impropre à l&#39;enregistrement électrophysiologique, mais les plus susceptibles de protéger la santé des tissus exposés. </li></ol> Partie 2: Mise en scène de l&#39;embryon et dissection <ol><li> Pour la collecte d&#39;œufs optimale, de maintenir les jeunes (&lt;7 jours), de sexe masculin en bonne santé et mouches femelles (20-40) sur les frais des pots de pose de 2-3 jours. Pose des pots se composent généralement de 100 gobelets en plastique ml (Tri-Verser) perforé pour assurer une circulation d&#39;air suffisante, couvrant une plaque de gélose à 60 mm. Plaques de gélose contenant de pomme ou de jus de raisin trempé avec de l&#39;agar. Plusieurs recettes existent, mais un exemple est la suivante: 700 ml d&#39;eau, 25-30 grammes d&#39;agar, 300 ml de concentré de jus (de raisin ou de pomme), 0.5g méthyl paraben (p-hydroxymethylbenzoate), et le sucre 30g. Autoclave l&#39;eau et l&#39;agar, et séparément bouillir le p-hydroxymethylbenzoate avec le sucre et le jus. Mélanger l&#39;agar-agar et des solutions de jus et verser rapidement en 60 plaques mm, éliminer les bulles. </li><li> Avant la collecte d&#39;œufs, les mouches sont nourris avec de la pâte de levure (7 grammes de levure de boulanger dans 9 ml d&#39;eau stockée à 4 ° C) sur des plaques fraîches, changé au moins deux fois par jour pendant au moins deux jours. Au jour 3, un pot de bonne devrait produire 100 à 200 œufs par heure. Mieux la pose d&#39;oeuf est observé sur un pot maintenu sur le côté avec l&#39;agar-agar dans la plaque rayée. Beaucoup embryons seront fixées dans ou à côté de la rayure. </li><li> Pour collecter un grand nombre d&#39;embryons, le transfert des embryons en douceur de la plaque de gélose dans un panier à l&#39;aide d&#39;un pinceau. Un panier peut être faite avec un tube de 15 ou 50 ml centrifugeuse. Coupez le bas en laissant une surface suffisante pour piéger un écran (70 mailles um) entre le couvercle et le haut du tube. Rincez les embryons avec dH 2 0 et mis dans une boîte de Pétri des frais de 50% à 100% eau de javel pour enlever le chorion externe. Alternativement, les œufs peuvent être collectés soit individuellement à l&#39;aide de pinces fines, et dechorionated en les plaçant manuellement dans une goutte d&#39;eau de Javel. De-chorionation peut prendre de 30 secondes à 2 minutes (eau de Javel fraîche est beaucoup plus rapide), et doivent être surveillés sous le microscope de dissection. Retrait du chorion expose le brillant, la membrane transparente vitelline. Dechorionated oeufs doivent être brièvement rincés, ou placés dans une solution saline, l&#39;eau de Javel détruit rapidement les tissus devitellinized. </li><li> Il est essentiel de bien l&#39;étape embryons à l&#39;âge désiré de développement. La drosophile défini embryonnaire (1-17; Campos-Ortega et Hartenstein, 1985) ne sont pas utiles, comme tout développement fonctionnelle neuromusculaire survient dans 16 stade tardif ou le stade 17. Ainsi, les embryons sont mis en scène par heure de développement à 25 ° C dans un incubateur humidifié, en quelques heures après la fécondation, ou, plus fréquemment, après la ponte (AEL). Dans ces conditions, l&#39;embryogenèse dure 21 + / - 1 h à 25 ° C. </li><li> Oeufs à partir d&#39;un oeuf chronométrés-lay (1-2 hrs) qui sont d&#39;âge approprié sont considérées pour les prochains critères morphologiques. Après un lavage extensif en DH 2 O, les oeufs dechorionated sont placés dans une boîte de culture en plastique (sous dH 2 O) pour la visualisation. Mise en scène correcte peut être confirmé par des critères morphologiques en utilisant la lumière réfléchie avec un microscope à dissection (Campos-Ortega et Hartenstein, 1985). Mature embryons à un stade avancé (22-24h AEL) sur le point d&#39;incubation sont généralement reconnus par la segmentation de la cuticule et de la trachée gonflée. Les embryons peuvent également être génotypés avec des équilibreurs GFP et un microscope à dissection de fluorescence avec des filtres appropriés. </li><li> Pour la dissection, les embryons et de développement mis en scène dechorionated sont attachés (face dorsale vers le haut) sur une lamelle en une goutte de sérum physiologique (voir étape 1.5). Les embryons sont retirés de la membrane vitelline par ponction de la membrane vers la fin antérieure ou postérieure avec une micropipette de verre ou d&#39;une aiguille de tungstène, et puis doucement en libérant l&#39;embryon de la membrane. En préparation de la dissection, l&#39;embryon doit être placé sur la lamelle avec la surface dorsale jusqu&#39;à (côté dorsal jusqu&#39;à la dissection va exposer le système nerveux et neuromusculaire ventrale pour les expériences. Toutefois, l&#39;embryon ne peut évidemment être placé dans d&#39;autres façons de faciliter l&#39;accès à d&#39;autres les tissus.) </li><li> Embryons au stade précoce (&lt;16 hrs AEL) attacher directement à nettoyer les vitres ou verre recouverte de polylysine (poly-L-lysine bromhydrate; Broadie et Bate, 1993a, b). Âgés embryons (&gt; 16 heures AEL), suite à la formation de la cuticule, doivent être collés, idéalement à Sylgard-enduit (Dow Corning) lamelles. Une eau-polymériser la colle cyanoacrylate chirurgicaux ou vétérinaires est utilisé (Broadie et Bate, 1993c, d). La colle est livrée par le biais d&#39;une pipette d&#39;électrode petit verre (10-20 micromètres de diamètre pointe intérieure) attaché à un tube en caoutchouc avec le flux de la colle contrôlée par la pression bouche. Des précautions doivent être prises lors de la livraison de la colle, la colle polymérise en plus rapidement au contact de la saline. Notez également que le collage ne peut pas être effectuée dans une solution saline sans ou avec de faibles concentrations d&#39;ions divalents, comme la colle nécessite des ions divalents à polymériser. De petites quantités de colle sont d&#39;abord utilisées pour fixer fermement la tête et la queue. </li><li> Une fois les extrémités de l&#39;embryon sont collés à la lamelle, une incision est faite le long de la ligne médiane dorsale avec une électrode en tungstène de verre ou d&#39;une aiguille aiguisée. Ceci est rendu plus facile par la douceur de perforation de la ligne d&#39;incision avant d&#39;effectuer le montage final. Les côtés de l&#39;incision sont ensuite attachés à la lamelle avec plus de colle, pour doucement répandre la plate embryon. Les organes internes, y compris l&#39;intestin, des corps gras et, éventuellement, la trachée sont ensuite éliminés par aspiration avec une pipette de verre attaché au tuyau en caoutchouc (Broadie et Bate 1993a-c). L&#39;embryon doit maintenant être attachés à plat pour la lamelle, l&#39;épiderme vers le bas avec le système nerveux central ventrale, les nerfs périphériques, et la musculature somatique exposés pour l&#39;expérimentation. </li></ol>

Staging précis des embryons est essentielle en raison de la maturation rapide des propriétés fonctionnelles au cours du temps de seulement quelques heures. Plusieurs questions compliquent cette mise en scène. Premièrement, la plupart des chercheurs utilisent oeuf chronométré établit au embryons au stade, mais le temps de ponte peut varier énormément d&#39;un animal à des conditions différentes (Broadie et al. 1992). En particulier, les femelles sur un régime alimentaire restreint tendent à retenir les oeufs fécondés pen...

<table><tbody><tr><td>Chambres de collecte d'embryons</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (pour boîte de 60 mm ; d'autres tailles disponibles)</td><td>Les chambres peuvent également être fabriquées maison à l'aide de béchers Tri-Pour perforés, comme illustré dans la vidéo</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Disponible auprès de diverses entreprises</td><td>La colle chirurgicale adhère mieux aux lamelles recouvertes de Sylgard</td></tr><tr><td>Tube en verre fin, diamètre extérieur de 1,0 à 1,5 mm</td><td>Divers</td><td></td><td>Pour tirer des aiguilles en verre fines destinées à la dissection et des tubes pour l'application de colle</td></tr><tr><td>Tuyau en plastique, à fixer au pipetage en verre pour aspiration buccale et application de colle</td><td>Tygon</td><td></td><td>Le diamètre intérieur du tuyau doit correspondre au diamètre extérieur du verre.</td></tr></tbody></table>

la récolte et la préparation drosophile les embryons destinés à l&#39;enregistrement électrophysiologique et autres procédures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophile est un modèle de premier génétique pour l&#39;étude du développement embryonnaire et à la fois fonctionnelles en neurosciences. Traditionnellement, ces champs sont assez isolées les unes des autres, avec des histoires largement indépendantes et les communautés scientifiques. Cependant, l&#39;interface entre ces domaines généralement disparates sont les programmes de développement qui sous-tendent l&#39;acquisition de propriétés fonctionnelles électriques de signalisation et de la différenciation des synapses chimiques fonctionnels pendant les phases finales de la formation des circuits neuronaux. Cette interface est une zone cruciale pour l&#39;enquête. Chez la drosophile, ces phases de développement fonctionnel se produisent pendant une période de &lt;8 heures (à 25 ° C) pendant le dernier tiers de l&#39;embryogenèse. Cette période tardive de développement a été longtemps considérés comme insurmontables à cause enquête pour le dépôt d&#39;un dur, la cuticule épidermique imperméable. Une percée a été l&#39;avance de l&#39;application de l&#39;eau-de polymérisation de la colle chirurgicale qui peut être appliqué localement à la cuticule pour permettre une dissection contrôlée des embryons à un stade avancé. Avec une incision dorsale longitudinale, l&#39;embryon peut être posé à plat, ce qui expose la corde nerveuse ventrale et la musculature paroi du corps d&#39;une enquête expérimentale. Ce système a été largement utilisé pour isoler et caractériser des mutants génétiques qui altèrent la formation des synapses embryonnaire, et révéler ainsi les mécanismes moléculaires qui régissent la spécification et la différenciation des connexions synaptiques fonctionnelles synapse et propriétés de signalisation.

Cette technique expose les neuromusculaire Drosophila embryonnaire pour l&#39;immunohistochimie ou l&#39;enregistrement électrophysiologiques. Il est utile pour étudier les événements précoces de développement neuromusculaire ou d&#39;effectuer l&#39;électrophysiologie dans des mutants qui ne peuvent pas éclore.

La récolte et la préparation Drosophile Les embryons destinés à l&#39;enregistrement électrophysiologique et autres procédures

Drosophila est un modèle génétique de premier plan pour l'étude du développement embryonnaire et des neurosciences fonctionnelles. Traditionnellement, ces domaines sont assez...

Pour effectuer des enregistrements électrophysiologiques chez les embryons de drosophile, il faut d'abord les récolter, les aligner et les disséquer. Une dissection contrôlée est rendue possible grâce à une colle chirurgicale polymérisable à l'eau, qui stabilise les embryons sur des lamelles. Les organes internes sont ensuite retirés des embryons stabilisés afin d'exposer le système nerveux central ventral, les nerfs périphériques et la musculature somatique. Bonjour, je suis Dave Featherstone du Département des sciences biologiques de l'Université de l'Illinois à Chicago.Bonjour, je suis Ton du laboratoire de Dave Featherstone, au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Illinois à Chicago. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment collecter et disséquer manuellement des embryons à un stade tardif de Joof. Nous utilisons cette procédure en laboratoire général pour préparer des tests électrophysiologiques permettant d'évaluer le développement et la fonction du système neuromusculaire de Joof, ce que je vous présenterai dans une prochaine vidéo JoVE.Commençons donc. Ce protocole débute par la collecte d'embryons, une procédure courante utilisée dans diverses expériences joof, que nous allons maintenant examiner. Établissez un mélange de 20 à 40 mouches jeunes mâles et femelles dans un pot de ponte.Les maintenir dans une enceinte humidifiée à 25 degrés Celsius. Pour estimer précisément le stade de développement de l'embryon, la température et l'humidité doivent être constantes. Bien que des pots de ponte commerciaux soient disponibles, ils peuvent être fabriqués à partir de béchers en plastique perforés de 100 mil trip poor s'adaptant sur des plaques Apple de 60 millimètres.La recette de la tarière à pommes se trouve dans le protocole écrit. Les perforations dans le bécher peuvent être réalisées à l’aide d’une sonde chauffée et doivent être plus petites que les mouches adultes. Les boîtes sont supplémentées avec une dose de pâte de levure, ce qui stimulera les femelles pour qu’elles pondent de nombreux œufs ; mélangez la levure et l’eau jusqu’à obtenir une consistance semblable à celle du beurre d’arachides, puis étalez-la sur les boîtes à l’aide d’une spatule.Changez la plaque deux fois par jour, en faisant tomber les mouches de la plaque. Et maintenant, je peux mettre une nouvelle plaque, qui peut retourner à l’incubateur. Mais entre-temps, je peux vérifier combien d’œufs ont été pondus ici d’ici le troisième jour.Un bon pot devrait produire de 100 à 200 œufs par heure, avec un débit maximal d'œufs entre l'aube et le milieu de la matinée. Pour faciliter la collecte, gratter ou tailler des entailles en forme de croix sur la plaque de collecte de l'archimède ; la majorité des œufs seront ainsi pondus dans ou à proximité des entailles pour cette procédure. Les mouches sont autorisées à pondre des œufs pendant une à deux heures afin de pouvoir récolter des embryons à un stade tardif, bien que cette durée puisse varier selon l'expérience. Les méthodes de collecte des embryons varient également selon le nombre d'embryons nécessaires pour l'expérience. Pour la dissection et l'électrophysiologie, peu d'embryons sont nécessaires ; dans ce cas, ils peuvent être prélevés délicatement depuis les boîtes à l’aide de fines pinces. Pour retirer le chorion externe, rincez les embryons avec de l’eau distillée et placez-les dans une boîte contenant une solution fraîche d’eau de Javel à 50 à 100 % ; surveillez les embryons au microscope stéréoscopique.Après 30 à 120 secondes, le chorion se dissoudra, exposant la membrane vitelline brillante et transparente. Comme l'eau de javel peut détruire rapidement les tissus vivants, les œufs désinfectés doivent être rincés brièvement ou placés dans une solution saline. Placez les œufs désinfectés dans une boîte de culture en plastique contenant de l'eau distillée.À ce stade, ils peuvent être génotypés visuellement en détectant les marqueurs GFP à l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence et des filtres appropriés ; après avoir trié les embryons d’intérêt, poursuivre avec la dissection. Étant donné que les embryons sont trop petits pour être manipulés avec des épingles à dissection, une préparation préalable est nécessaire. Les embryons plus âgés, dont la cuticule est déjà développée, doivent être collés sur des lamelles recouvertes de soie à l’aide d’une colle chirurgicale ou vétérinaire à base de cyanoacrylate, également connue sous le nom de histo aal.Le bleu fonctionne bien car il polymérise au contact d'une solution contenant des ions bivalents. Commencez la dissection en transférant un embryon d'intérêt sur un lamelle recouverte de cigar sous une goutte de solution saline, avec son côté dorsal vers le haut. Retirez la membrane vitelline en pratiquant une petite incision dans la membrane à l'aide d'une micropipette en verre ou d'une aiguille au tungstène.Ensuite, détacher délicatement l'embryon de la membrane. Les embryons au stade précoce adhèrent directement au verre propre ou au verre recouvert de poly-L-lysine. Pour les embryons plus âgés, les fixer sur des lamelles recouvertes de gélatine en appliquant une colle chirurgicale à l’aide d’une petite pipette en verre reliée à un tube en caoutchouc.L'écoulement de la colle est contrôlé par la bouche. Utilisez de petites quantités de colle pour fixer fermement la tête et la queue. Procédez avec précaution, car la colle se mélange rapidement dans la solution saline.Pour disséquer l'embryon stabilisé, perforez délicatement une ligne le long de la ligne médiane dorsale à l'aide d'une électrode en verre ou d'une aiguille en tungstène aiguisée. À l'aide du même outil, pratiquez une incision en coupant à travers les perforations. Il est essentiel que l'aiguille de dissection soit toujours maintenue selon un angle faible afin d'éviter d'endommager la musculature neuro-végétative ventrale.Ensuite, retirez les organes internes à l'aide d'une aspiration douce effectuée par la bouche à partir d'une pipette en verre reliée à un tube en caoutchouc. Aplatissez l'embryon en utilisant davantage de colle pour fixer les bords de l'incision sur le couvre-objet. Une fois que tous les organes internes ont été aspirés, le système nerveux central ventral, les nerfs périphériques et la musculature somatique sont exposés pour l'expérimentation.À ce stade, l'embryon est prêt pour des enregistrements électrophysiologiques ou peut être fixé pour une immunohistochimie suivie d'une microscopie en utilisant des techniques classiques. Nous venons de vous montrer comment isoler et disséquer les embryons au stade tardif jusqu'aux embryons plus mous. L'application de la colle chirurgicale et la dissection des embryons seront frustrantes au début, mais il n'existe aucune astuce secrète.Vous devez développer les habiletés motrices fines par la pratique sur plusieurs semaines, mais progressivement, le pourcentage de dissections réussies augmentera. Veuillez consulter notre autre vidéo géo, qui détaille les configurations d'enregistrement à partir de cellules musculaires et des neurones moteurs. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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