Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Des enregistrements électrophysiologiques des neurones musculaires et moteurs peuvent être obtenus à partir d’une paroi corporelle d’embryon d’oph correctement préparée. Les muscles 6, 7, 12 ou 13 peuvent être facilement enregistrés à partir de la configuration d’enregistrement de l’ensemble de la cellule et des courants d’amplitude miniatures robustes peuvent être mesurés après avoir obtenu un joint giga ohm pour enregistrer à partir de la jonction neuromusculaire. Une électrode d’aspiration peut être utilisée pour aspirer un nerf moteur près du point de sortie du SNC et fournir une stimulation pré-synaptique pendant que les courants cellulaires entiers sont mesurés dans le muscle post-synaptique.

Alternativement, une pipette peut être utilisée pour délivrer des neurotransmetteurs excitateurs près de l’électrode d’enregistrement par ionophorèse ou éjection de pression. Bonjour, je suis Ton du laboratoire de Dave au Département des sciences biologiques de l’Université de l’Illinois à Chicago. Aujourd’hui, je vais vous montrer l’enregistrement électrophysiologique du stade salate, de la jonction neuromusquée embryonnaire et des neurones centraux.

Nous utilisons ces procédures pour étudier la fonction et le développement du système neuromusculaire Joof. Ces techniques ont été développées à l’origine par Kendall Brody. Passez par David Fit Stone et ensuite c’est à moi aujourd’hui que je vous le transmettrai.

Cette procédure exige que les embryons soient correctement récoltés et disséqués à l’avance. Pour voir comment cela est accompli, consultez le Jo ci-joint de la publication de Brody Featherstone et Chen Electrophysiological. Les enregistrements des muscles embryonnaires et des neurones de Jossa utilisent des techniques standard de clampage de patch de cellules entières. Tout d’abord, l’embryon disséqué est placé dans une petite chambre d’enregistrement en plexiglas.

La zone d’enregistrement de la physiologie est humidifiée électriquement par une cage de Faraday et placée sur une table amortie par les vibrations. La chambre est observée sous lumière transmise à l’aide d’un microscope composé vertical avec optique KY et d’une immersion dans l’eau à longue distance de 40 x. Les enregistrements objectifs sont généralement effectués en dessous de la température ambiante, car il devient de plus en plus difficile de patcher les muscles de la pince oph à mesure que les températures augmentent.

L’électrode d’enregistrement doit avoir une résistance finale de cinq à 10 méga ohms et être polie à chaud à environ un micromètre de diamètre intérieur. À l’extrémité, les électrodes d’enregistrement sont remplies d’une solution physiologique contenant du chlorure de potassium et du saccharose. Un fil de terre en chlorure d’argent est placé dans le bain contenant une solution saline standard, qui est également utilisée dans la dissection d’embryons.

Les signaux sont amplifiés à l’aide d’un amplificateur à pince de patch, filtrés et stockés numériquement pour une analyse ultérieure. Tout système adapté aux expériences de patch clamp peut être utilisé, tel que cet équipement et le logiciel d’axon. Les cellules de trois tissus différents du système nerveux embryonnaire peuvent maintenant être stimulées et enregistrées à partir des neurones musculaires de la JNM et des motoneurones centraux.

Avec cette préparation d’embryon, n’importe quel muscle embryonnaire peut être enregistré à partir de la plupart des expériences. Concentrez-vous sur le groupe de quatre muscles ventraux longitudinaux 6, 7, 12 et 13, en particulier le muscle six dans l’abdomen antérieur, A deux à trois pour enregistrer à partir des muscles dorsaux. L’embryon doit être collé, côté dorsal vers le bas, et disséqué le long de la ligne médiane ventrale chez les jeunes embryons.

Aucun traitement enzymatique n’est nécessaire avant l’enregistrement musculaire. Cependant, chez les embryons ultérieurs avec des cuticules développées, une gaine musculaire se développe également avant l’enregistrement du patch. Cette gaine doit être retirée par une brève immersion dans une collagénase.

La plupart des enregistrements sont effectués dans la configuration d’enregistrement de l’ensemble de la cellule, obtenue facilement à partir de l’état attaché à la cellule avec une légère aspiration ou un bourdonnement électrique. C’est un zap. Il s’agit d’une électrostimulation pour rompre les coupures de la membrane cellulaire.

Les résistances d’étanchéité sur le muscle sont généralement supérieures à un giga ohm Les courants de cellules entières sont généralement obtenus moins de trois minutes après la série de formation de l’étalement. La résistance est nettement accrue dans la plupart des cas et les cellules peuvent développer une fuite accrue. À l’heure actuelle, les embryons doivent être âgés d’au moins 14 heures à des stades de développement plus précoces.

Un couplage électrique étendu entre les myotubes rendra le serrage de tension imprécis pour effectuer des enregistrements de pinces patch des fibres musculaires. Les potentiels de maintien typiques sont de moins 60 à moins 80 millivolts et les méthodes de pince de tension et de pince de courant peuvent être utilisées. Des enregistrements réussis de cellules entières de moins 60 millivolts sont accompagnés de courants synaptiques spontanés robustes allant de quelques à plusieurs centaines de picoampères, comme ceux montrés ici.

De grands courants NMJ peuvent être évoqués en stimulant le nerf moteur avec des électrodes d’aspiration. Ceux-ci peuvent être tirés d’une variété d’électrodes en verre remplies de fibres et doivent être polis au feu pour obtenir la configuration souhaitée en utilisant une aspiration douce sur la pipette aspirer dans un petit segment du nerf moteur segmentaire approprié près du point de sortie du SNC Pour former un joint étanche, une brève stimulation fonctionne mieux avec une intensité déterminée expérimentalement, généralement entre un et cinq volts. Une stimulation fiable est obtenue en réglant l’intensité du stimulus d’un à deux volts au-dessus du seuil déterminé expérimentalement.

récepteurs post-synaptiques du glutamate NMJ peuvent être activés en appliquant le neurotransmetteur Les molécules chargées de glutamate comme le glutamate peuvent être délivrées au NMJ à l’aide de l’ionophorèse. Les pipettes à haute résistance sont utilisées pour cartographier les récepteurs et les pipettes à faible résistance sont utilisées pour estimer la réponse totale des récepteurs du glutamate. Les pipettes ionophores sont chargées d’une solution de glutamate de 100 millimolaires L.

Pour libérer le glutamate L, utilisez une courte impulsion de courant négatif avec un petit courant de soutien positif pour éviter les fuites, le glutamate ou toute molécule non chargée peut également être délivré au NMJ en utilisant l’éjection de pression. Pour l’éjection par pression, utilisez un à deux millimolaires de glutamate et appliquez une force de cinq à 10 PSI vers l’extérieur à la pipette. À l’aide d’un pico spritzer.

La monnaie NMJ évoquée par la stimulation nerveuse ou l’application de glutamate à moins 60 millivolts est généralement de 1500 à 2000 pico ampères. De nombreux neurones embryonnaires peuvent être identifiés individuellement en fonction de la position du soma et de la morphologie de projection. La plupart des enregistrements expérimentaux se sont concentrés sur un groupe de cinq neurones dorsaux superficiels à l’intérieur du cordon nerveux ventral embryonnaire.

Pour enregistrer à partir de ces neurones, la gaine du névrome du cordon nerveux ventral doit être retirée avec un bref traitement focal à la protéase, les corps cellulaires sont dégainés en délivrant 0,5 à 1 % de protéase lors de l’enregistrement à l’aide d’une pipette patch de grand diamètre, aspirer le matériau de la gaine dans la pipette contenant la protéase. Une action douce de la bouche peut être utilisée pour itérer à plusieurs reprises la gaine dans et hors de la pipette. Au bout d’une à deux minutes, la gaine va se rompre.

Les cellules sont maintenant exposées pour le serrage de patchs de cellules entières. Ce paradigme d’enregistrement n’exige pas que le sérum physiologique soit circulé ou réchauffé. La solution saline d’enregistrement externe dans cette préparation est différente de ce qui est utilisé dans l’enregistrement des muscles.

La pipette patch peut être chargée de jaune Lucifer pour visualiser plus tard la position et la morphologie de la cellule du patch. Voici un motoneurone central qui a pris du jaune de Lucifer et visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence. Les enregistrements de pinces de tension de cellules entières sont effectués à des potentiels de maintien de moins 60 millivolts à 18 degrés Celsius.

Des enregistrements par pince de courant sont également possibles. Les neurones peuvent être stimulés par les neurotransmetteurs, l’acétylcholine ou le gaba. Ceux-ci sont appliqués au niveau du soma cellulaire à l’aide de l’ionophorèse ou de l’éjection de pression comme lors de l’enregistrement à partir de njs.

Une fois qu’une connexion cellulaire entière a été établie, des courants spontanés sont d’abord observés. Il s’agit d’une minute de données brutes obtenues à partir d’un muscle longitudinal ventral embryonnaire à six patchs serrés à moins 60 millivolts en l’absence de stimulation. Une préparation saine présente généralement une activité synaptique spontanée robuste représentée ici par les nombreuses déviations de courant vers le bas.

Voici les données du même muscle avec une stimulation appliquée à l’aide d’une pipette d’aspiration sur le nerf moteur menant à ce muscle. Cela a entraîné de multiples déviations vers le bas du courant représentant les courants jonctionnels évoqués ou e jcs. Il s’agit de données provenant du même muscle stimulé par un glutamate millimolaire appliqué à l’aide de l’éjection de pression.

Le glutamate ouvre des récepteurs conduisant à d’importantes déviations vers le bas. Dans le courant, deux traces sont montrées représentant deux applications ultérieures de glutamate. Je viens de vous montrer comment utiliser des techniques de chasse aux parcelles standard, que nous ne pourrions pas décrire ici en profondeur.

Idéalement, toute personne cherchant à enregistrer à partir de vos embryons d’adoucissant aura déjà appris la campagne de patch en utilisant une préparation plus facile. Voilà. Merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos minutes d’expériences.