Name: Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Apprenez l'enregistrement électrophysiologique dans l'embryon de Drosophila pour étudier les propriétés électriques des muscles et neurones en développement. Cette méthode permet de caractériser la synaptogenèse fonctionnelle.

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

L&#39;enregistrement à partir d&#39;embryons de drosophile électrophysiologique nécessite une manipulation manuelle et de dissection. La santé de la préparation, et la qualité conséquente des enregistrements, dépend d&#39;un seul être capable de préparer rapidement et proprement les tissus fragiles embryonnaires à des fins d&#39;enregistrement, et ensuite exécuter l&#39;expérience. Les expérimentateurs doivent être compétents dans les deux dissections embryonnaire et l&#39;électrophysiologie patch clamp avant d...

enregistrement électrophysiologique dans le drosophile embryon

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophile est un modèle de premier génétique pour l&#39;étude du développement embryonnaire et à la fois fonctionnelles en neurosciences. Traditionnellement, ces champs sont assez isolées les unes des autres, avec des histoires largement indépendantes et les communautés scientifiques. Cependant, l&#39;interface entre ces domaines généralement disparates sont les programmes de développement qui sous-tendent l&#39;acquisition de propriétés fonctionnelles électriques de signalisation et de la différenciation des synapses chimiques fonctionnels pendant les phases finales de la formation des circuits neuronaux. Cette interface est une zone cruciale pour l&#39;enquête. Chez la drosophile, ces phases de développement fonctionnel se produisent pendant une période de &lt;8 heures (à 25 ° C) pendant le dernier tiers de l&#39;embryogenèse. Cette période tardive de développement a été longtemps considérés comme insurmontables à cause enquête pour le dépôt d&#39;un dur, la cuticule épidermique imperméable. Une percée a été l&#39;avance de l&#39;application de l&#39;eau-de polymérisation de la colle chirurgicale qui peut être appliqué localement à la cuticule pour permettre une dissection contrôlée des embryons à un stade avancé. Avec une incision dorsale longitudinale, l&#39;embryon peut être posé à plat, ce qui expose la corde nerveuse ventrale et la musculature paroi du corps d&#39;une enquête expérimentale. Whole-cell patch-clamp techniques peuvent alors être employées pour enregistrer à partir de neurones individuellement identifiables et les muscles somatiques. Ces configurations d&#39;enregistrement ont été utilisées pour suivre l&#39;apparition et la maturation des courants ioniques et la propagation du potentiel d&#39;action dans les deux neurones et les muscles. Mutants génétiques affectant ces propriétés électriques ont été caractérisées pour révéler la composition moléculaire des canaux ioniques et complexes de signalisation associés, et pour commencer l&#39;exploration des mécanismes moléculaires de la différenciation fonctionnelle. Un accent particulier a été le montage de connexions synaptiques, à la fois dans le système nerveux central et la périphérie. Le glutamatergique jonction neuromusculaire (JNM) est plus accessible à une combinaison de l&#39;imagerie optique et l&#39;enregistrement électrophysiologiques. Une électrode d&#39;aspiration de verre est utilisé pour stimuler le nerf périphérique, avec excitateur de jonction actuelle (EJC) des enregistrements réalisés dans la tension musculaire serré. Cette configuration de l&#39;enregistrement a été utilisé pour tracer la différenciation fonctionnelle de la synapse, et de suivre l&#39;apparition et la maturation des présynaptique propriétés de libération du glutamate. En outre, les propriétés postsynaptique peut être dosée de façon indépendante par l&#39;intermédiaire d&#39;iontophorèse ou l&#39;application de pression de glutamate directement à la surface du muscle, de mesurer l&#39;apparition et la maturation des champs récepteurs du glutamate. Ainsi, les deux éléments de pré-et post-synaptiques peuvent être suivis séparément ou en combinaison au cours synaptogenèse embryonnaire. Ce système a été largement utilisé pour isoler et caractériser des mutants génétiques qui altèrent la formation des synapses embryonnaire, et révéler ainsi les mécanismes moléculaires qui régissent la spécification et la différenciation des connexions synaptiques fonctionnelles synapse et propriétés de signalisation.

Enregistrements électrophysiologiques de<em&gt; Drosophile</em&gt; Embryons permettent des analyses des muscles en développement et les propriétés électriques des neurones, ainsi que la caractérisation fonctionnelle de la synaptogenèse à la jonction neuromusculaire et glutamatergique cholinergiques centraux et les synapses GABAergiques.

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Drosophila est un modèle génétique de premier plan pour l'étude du développement embryonnaire et des neurosciences fonctionnelles. Traditionnellement, ces domaines sont assez...

Des enregistrements électrophysiologiques provenant des muscles et des motoneurones peuvent être obtenus à partir de la paroi corporelle d’un embryon oph correctement préparé. Les muscles 6, 7, 12 ou 13 peuvent facilement être enregistrés en configuration d’enregistrement en tout-ouvert, et des courants de faible amplitude robustes peuvent être mesurés après obtention d’un scellement de gigaohm pour l’enregistrement à la jonction neuromusculaire. Une électrode à aspiration peut être utilisée pour aspirer un nerf moteur près du point de sortie du SNC et délivrer une stimulation présynaptique, tandis que les courants en tout-ouvert sont mesurés dans le muscle postsynaptique.Alternativement, une pipette peut être utilisée pour délivrer des neurotransmetteurs excitateurs près de l'électrode d'enregistrement par iontophorèse ou éjection sous pression. Bonjour, je suis Ton du laboratoire de Dave au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Illinois à Chicago. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment enregistrer électrophysiologiquement la jonction neuro-musculaire au stade embryonnaire et les neurones centraux.Ces procédures que nous utilisons permettent d'étudier la fonction et le développement du système neuromusculaire de joof. Ces techniques ont été initialement mises au point par Kendall Brody, transmises à David Fit Stone, puis à moi-même ; aujourd'hui, je vais vous les transmettre.Cette procédure exige que les embryons soient prélevés et disséqués correctement au préalable. Pour voir comment cela est réalisé, consultez la publication JoVE accompagnant celle de Brody Featherstone et Chen. Les enregistrements électrophysiologiques effectués sur les muscles et les neurones embryonnaires de Jossa utilisent des techniques standards de blocage en configuration whole cell. Tout d'abord, l'embryon disséqué est placé dans une petite chambre d'enregistrement en plexiglas.La zone d'enregistrement physiologique est électriquement amortie par une cage de Faraday et installée sur une table amortie aux vibrations. La chambre est observée en lumière transmise à l'aide d'un microscope composé droit équipé d'optiques KY et d'un objectif à immersion dans l'eau de 40 x à longue distance de travail. Les enregistrements objectifs sont généralement réalisés à une température inférieure à celle de la pièce, car il devient de plus en plus difficile de réaliser le patch-clamp sur les muscles oph à mesure que la température augmente.L'électrode d'enregistrement doit avoir une résistance finale comprise entre cinq et dix mégohms et être polie à la chaleur jusqu'à un diamètre intérieur d'environ un micromètre. À l'extrémité, les électrodes d'enregistrement sont remplies en arrière avec une solution physiologique contenant du chlorure de potassium et du saccharose. Un fil de masse en argent chloré est placé dans le bain contenant la solution saline standard, qui est également utilisée lors de la dissection de l'embryon.Les signaux sont amplifiés à l'aide d'un amplificateur de type patch clamp, filtrés et stockés numériquement pour une analyse ultérieure. Tout système adapté aux expériences de patch clamp peut être utilisé, comme cet équipement et ce logiciel d'Axon. Des cellules provenant de trois tissus différents du système nerveux embryonnaire peuvent désormais être stimulées et enregistrées à partir des muscles, des neurones à la jonction neuromusculaire et des motoneurones centraux.Avec cette préparation embryonnaire, on peut enregistrer n'importe quel muscle embryonnaire dans la plupart des expériences. Concentrez-vous sur le groupe de quatre muscles longitudinaux ventraux 6, 7, 12 et 13, en particulier le muscle 6 dans l'abdomen antérieur, de A2 à A3, pour enregistrer les muscles dorsaux. L'embryon doit être collé, côté dorsal vers le bas, et disséqué le long de la ligne médiane ventrale chez les jeunes embryons.Aucun traitement enzymatique n'est nécessaire avant l'enregistrement musculaire. Toutefois, chez les embryons plus âgés possédant une cuticule développée, une gaine musculaire se forme également avant l'enregistrement en patch. Cette gaine doit être éliminée par une immersion brève dans une solution de collagénase.La plupart des enregistrements sont effectués en configuration de type « tout-cellule », obtenue facilement à partir de l'état attaché à la cellule par une légère aspiration ou un choc électrique. C'est un petit choc. C'est une stimulation électrique destinée à rompre la membrane cellulaire.Dans un montage en cellule entière, les résistances de scellement sur le muscle sont généralement supérieures à un gigaohm. Les courants en cellule entière sont habituellement obtenus en moins de trois minutes après la formation du scellement. La résistance augmente nettement dans la plupart des cas, et les cellules peuvent présenter une fuite accrue. Pour la technique de patch clamp, les embryons doivent avoir au moins 14 heures, car aux stades de développement plus précoces, cela n'est pas possible.Un couplage électrique étendu entre les myotubes rendra le maintien en tension inexact pour effectuer des enregistrements par électrode à micro-rupture sur les fibres musculaires. Les potentiels de maintien typiques se situent entre -60 et -80 millivolts, et les méthodes de maintien en tension et de maintien en courant peuvent être utilisées. Des enregistrements en configuration globulaire réussis à -60 millivolts sont accompagnés de courants synaptiques spontanés importants allant de quelques picoampères à plusieurs centaines de picoampères, comme ceux illustrés ici.De forts courants de la jonction neuromusculaire peuvent être provoqués en stimulant le nerf moteur à l'aide d'électrodes à succion. Celles-ci peuvent être tirées à partir d'une variété d'électrodes en verre remplies de fibres et doivent être polies à la flamme afin d'obtenir la configuration souhaitée, en appliquant une succion douce sur la pipette pour aspirer un petit segment du nerf moteur segmentaire approprié près du point de sortie du SNC. Pour former un scellement étanche, une stimulation brève donne les meilleurs résultats avec une intensité déterminée expérimentalement, généralement comprise entre un et cinq volts. Une stimulation fiable est obtenue en réglant l'intensité du stimulus à un ou deux volts au-dessus du seuil déterminé expérimentalement.Les récepteurs post-synaptiques de glutamate à la jonction neuromusculaire peuvent être activés en appliquant le neurotransmetteur glutamate ; des molécules chargées comme le glutamate peuvent être délivrées à la jonction neuromusculaire par iontophorèse. Des pipettes à haute résistance sont utilisées pour cartographier les récepteurs, tandis que des pipettes à résistance plus faible servent à estimer la réponse totale des récepteurs au glutamate. Les pipettes iontophorétiques sont chargées avec une solution de L-glutamate à 100 millimolaire.Pour libérer le L-glutamate, utilisez une courte impulsion de courant négatif avec un faible courant positif de compensation afin d'éviter toute fuite ; le glutamate ou toute autre molécule non chargée peut également être délivré à la jonction neuromusculaire par éjection sous pression. Pour l'éjection sous pression, utilisez une concentration de un à deux millimolaire de glutamate et appliquez une force sortante de cinq à 10 PSI sur la pipette, à l’aide d’un pico-spritzer.Les courants de la JNM provoqués par une stimulation nerveuse ou par l'application de glutamate à moins 60 millivolts sont généralement de 1500 à 2000 picoampères. De nombreux neurones embryonnaires peuvent être identifiés individuellement en fonction de la position du soma et de la morphologie des projections. La plupart des enregistrements expérimentaux se sont concentrés sur un groupe de cinq neurones dorsaux superficiels situés dans le cordon nerveux ventral embryonnaire.Pour enregistrer l'activité de ces neurones, il est nécessaire d'éliminer la gaine du neurome du cordon nerveux ventral à l'aide d'une brève application localisée de protéase. Les corps cellulaires sont débarrassés de leur gaine en appliquant 0,5 à 1 % de protéase lors de l'enregistrement, à l’aide d’une pipette de patch de grand diamètre permettant d’aspirer les débris de gaine dans la pipette contenant la protéase. Une aspiration douce par la bouche peut être utilisée pour faire entrer et sortir répétitivement la gaine de la pipette. Après une à deux minutes, la gaine se rompt.Les cellules sont maintenant exposées pour la réalisation d'un enregistrement en configuration whole cell par patch clamp. Ce paradigme d'enregistrement ne nécessite pas que le liquide salin soit circulé ou chauffé. Le liquide salin externe utilisé dans cette préparation diffère de celui employé pour les enregistrements réalisés sur les muscles.La micropipette de patch peut être chargée avec du jaune de lucifer afin de visualiser ultérieurement la position et la morphologie de la cellule enregistrée. Voici un neurone moteur central qui a intégré le jaune de lucifer et qui a été visualisé par microscopie de fluorescence. Des enregistrements en configuration whole cell en mode blocage de tension sont réalisés à des potentiels de maintien de –60 millivolts à 18 degrés Celsius.Des enregistrements en mode courant imposé sont également possibles. Les neurones peuvent être stimulés à l'aide de neurotransmetteurs, tels que l'acétylcholine ou le GABA. Ceux-ci sont appliqués au niveau du soma cellulaire par iontophorèse ou éjection sous pression, comme lors de l'enregistrement à partir des NJ. Une fois qu'une connexion en mode cellule entière a été établie, on observe d'abord des courants spontanés. Il s'agit d'une minute de données brutes obtenues à partir du muscle longitudinal ventral embryonnaire numéro six, enregistré en configuration « patch clamp » à −60 millivolts, en l'absence de stimulation. Une préparation saine présente généralement une activité synaptique spontanée importante, représentée ici par les nombreux déflexions de courant vers le bas.Voici des données provenant du même muscle avec une stimulation appliquée à l'aide d'une pipette à aspiration sur le nerf moteur menant à ce muscle. Cela a entraîné plusieurs déflexions descendantes du courant, représentant des courants jonctionnels évoqués ou e jcs. Il s'agit de données provenant du même muscle stimulé par un millimolaire de glutamate appliqué par éjection sous pression.Le glutamate ouvre les récepteurs, provoquant de grandes déflexions descendantes. Dans le tracé actuel, deux enregistrements sont affichés, représentant deux applications successives de glutamate. Je viens de vous montrer comment réaliser un enregistrement électrophysiologique à partir d'embryons de géo doux à un stade tardif ; l'enregistrement électrophysiologique utilise généralement des techniques standard de patch clamp, que nous ne pouvons pas décrire ici en détail.Idéalement, toute personne souhaitant enregistrer à partir de vos embryons sensibles aura déjà appris la technique de patch en utilisant une préparation plus simple. Voilà. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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