Name: Extraction de lADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Découvrez l'extraction d'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de filtres Sterivex 0,2 µm et sa purification par gradient de densité au chlorure de césium. Cette méthode optimise les études d'ADN environnemental marin.

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Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. JJW a été soutenu par des bourses du CRSNG et DAW a été soutenu par des bourses du CRSNG, la Fondation Killam et TULA Centre a financé pour la diversité microbienne et évolution. SL a été soutenu par la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution.

Remarque: Tous les réactifs utilisés dans le présent protocole sont aliquotées des stocks de laboratoire travaillant en petits stocks-ce qui est très important d&#39;éviter la contamination croisée de vos échantillons d&#39;ADN et la contamination des stocks de laboratoire. Aussi, lors du pipetage, assurez-vous de changer d&#39;embout de pipette pour chaque ajout afin d&#39;éviter la contamination croisée. Première partie: la lyse cellulaire et la digestion <ol><li> Commencez ce protocole par la fonte des filtres Sterivex qui contiennent de la biomasse planctonique préalablement concentré sur la glace. Pour plus de simplicité, ici, nous décrire la procédure de traitement d&#39;un filtre individuel. En pratique, nous recommandons le traitement de 16 ou moins de filtres à la fois. </li><li> Une fois le filtre a dégelé, commence la première des deux incubations: un pour lyser les cellules et de supprimer l&#39;ARN, et une pour décomposer les protéines. Pour la première incubation, ajouter 100 ul de lysozyme (125 mg en 1000 ul de TE) et 20 ml de RNase A (10 ug / ml) pour le filtre. Refermer le filtre avec du parafilm et laissez-le tourner dans le four d&#39;hybridation à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Pour l&#39;incubation suivante, ajouter 100 à la protéinase K et 100 ul ul SDS 20% sur le filtre. Refermer avec Parafilm et laissez-le faire tourner une à deux heures de plus dans le four à hybridation, cette fois à 55 ° C. </li><li> En utilisant une seringue 5cc, le transfert du lysat du filtre Sterivex dans un tube Falcon de 15 ml. Rincer le filtre avec un tampon de lyse 1 ml et ajouter le liquide de rinçage au lysat dans votre tube Falcon en utilisant la seringue 5cc. Maintenant que vous avez lysées et digéré vos cellules, vous êtes prêt à extraire leur ADN. </li></ol> Deuxième partie: Extraction de l&#39;ADN <ol><li> L&#39;étape suivante consiste à utiliser la méthode au phénol-chloroforme pour extraire l&#39;ADN à partir de votre lysat. Ajouter un volume égal (environ 3ml) de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (IAA) au tube de lysat, en s&#39;assurant de changer d&#39;embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes pour bien mélanger. </li><li> Spin le tube à 2500 g pendant 5 minutes, en veillant à la centrifugeuse est équilibré. Pendant la centrifugation, le mélange phénol-chloroforme-lysat devrait se séparer en deux couches: une couche organique contenant du phénol, du chloroforme, et des protéines à partir de votre échantillon, sur le fond, et une couche aqueuse, qui se compose de votre ADN, de l&#39;eau, et d&#39;autres molécules plus hydrophiles, sur le dessus. </li><li> Transférer la phase aqueuse (contenant votre ADN) dans un nouveau tube Falcon de 15 ml. Soyez prudent de ne pas toucher à l&#39;interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière). </li><li> Pour ce nouveau tube, ajouter un volume égal (environ 3 ml) de chloroforme: IAA, en s&#39;assurant de changer d&#39;embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes. Cette étape permet de retirer tout le phénol restant de votre échantillon d&#39;ADN. </li><li> Centrifuger à 2500 g pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que la couche aqueuse est claire. Transfert couche aqueuse dans un nouveau tube Falcon étiquetés et ajouter 1 ml de TE à pH 8,0, en faisant attention à ne pas toucher à l&#39;interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière). Cette couche aqueuse contenant vos extraire l&#39;ADN. </li></ol> Troisième partie: Concentration d&#39;ADN et de lavage <ol><li> La prochaine étape est de se laver et de se concentrer l&#39;échantillon d&#39;ADN dans un tube de 15 ml Amicon Ultra centrifugeuse. Les tubes Amicon se composent d&#39;un filtre qui retient les molécules au niveau ou au dessus d&#39;un poids spécifié moléculaire (rétentat) et un tube pour attraper le flux continu (le filtrat). Dans ce cas, le filtre retient votre ADN (le rétentat). Transférez vos extraire l&#39;ADN de l&#39;étape de 2,5 à le compartiment du filtre d&#39;un tube de Amicon Ultra. </li><li> Centrifuger à 3500 g pendant 10 minutes. Assurez-vous qu&#39;il ya moins de 1 ml de liquide retenu dans le filtre Amicon. S&#39;il reste plus d&#39;rétentat, remplir le filtre avec TE et de spin à nouveau. Assurez-vous d&#39;utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d&#39;éviter la contamination croisée. </li><li> Retirez le flux continu, ou filtrat, à un autre tube Falcon et l&#39;enregistrer dans le réfrigérateur jusqu&#39;à ce que vous avez confirmé votre produit d&#39;ADN sur un gel de finale (quatrième partie). </li><li> Ajouter 2 ml de tampon TE au filtre Amicon et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d&#39;éviter la contamination croisée. Piscine filtrat avec celle de l&#39;étape 3.3 et enregistrez-le dans le réfrigérateur. </li><li> Laver l&#39;ADN deux fois plus avec TE pour un total de trois lavages (en veillant à toujours utiliser un embout de pipette frais), et en enregistrant le filtrat à chaque fois (comme des étapes 3.3 et 3.4). Pour le dernier lavage, rotation jusqu&#39;à 200 à 500 ml de rétentat reste dans le filtre Amicon. Noter le volume final et le transfert du rétentat (contenant votre ADN) à un tube étiqueté Eppendorf de 1,5 ml. </li></ol> Quatrième partie: Détermination de la qualité de l&#39;ADN <ol><li> Vérifiez la qualité de l&#39;ADN et estimer la concentration de l&#39;ADN en exécutant vos échantillons sur un gel de 0,8% STA gel d&#39;agaroseINED avec 1ml bromure d&#39;éthidium (BET) pendant la nuit. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d&#39;être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.) Charger les échantillons côté échelles d&#39;ADN, qui servent de normes de taille et d&#39;intensité (voir étape suivante). </li><li> Dans les premières voies de plusieurs, la charge d&#39;échelles avec des bandes de différents poids moléculaires et des concentrations. Nous recommandons le schéma de chargement suivantes: dans les ruelles et prénom (voies ultrapériphériques), 10 pl de la charge de la 50ng/μl 1kb + ou échelle 2log. Dans voies 2,3 et 4, la charge 2 pl, 5 pl, et 10 pl, respectivement, de 50ng/μl λHindIII échelle. Enfin, la charge 5 pl par voie d&#39;extrait d&#39;ADN avec un colorant pour chaque échantillon. </li><li> Exécutez le gel à 15 volts pendant environ 16 heures (nous vous recommandons d&#39;exécuter la nuit). </li><li> Le jour suivant, une photographie du gel en utilisant un système de gel UV de la documentation. Pour déterminer la gamme de poids moléculaire de votre ADN et de sa concentration, de comparer les bandes de l&#39;échantillon à des bandes de l&#39;échelle. L&#39;ADN de bonne qualité aura de haut poids moléculaire (&gt; 36kb), et montrent peu de signes de cisaillement / dégradation. Voir Figure 1. </li></ol> Cinquième partie: Césium Centrifugation gradient de chlorure de <ol><li> Si la qualité de l&#39;ADN est bon et la quantité est suffisante, vous pouvez procéder à purifier l&#39;ADN en effectuant un chlorure de césium (CsCl) centrifugation en gradient. Notez que cette étape de purification est facultatif et n&#39;est pas nécessaire pour toutes les applications en aval (par exemple, si vous voulez générer des bibliothèques fosmide vous DEVEZ purifier, alors si vous voulez simplement de réaliser des réactions de PCR, la purification n&#39;est généralement pas nécessaire). D&#39;abord, l&#39;étiquette d&#39;un tube à centrifuger pour chaque échantillon. </li><li> Pour chaque tube à centrifuger, ajouter 160 mg de CsCl, 178 ul d&#39;ADN génomique. Après l&#39;ajout de CsCl et de l&#39;ADN dans le tube, placer un petit morceau de parafilm sur le haut du tube et retourner doucement le tube dix à vingt fois afin de mélanger les composants. Ne pas mélanger par pipetage, qui peut causer de cisaillement de l&#39;ADN. Ensuite, ajoutez 10 ul de 10 ug / ul EtBr à ce tube et mélanger de la même manière. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d&#39;être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.) </li><li> Assurez-vous que le poids de tous les tubes sont équilibrés avant centrifugation tels que les différences de poids entre les tubes sont inférieures à 1 mg. </li><li> Placer les tubes dans le rotor en utilisant hémostatique, fermer le couvercle et placer le rotor à l&#39;intérieur du ultracentrifugation. </li><li> Fermez la porte d&#39;ultracentrifugation. Vide sera appliquée dès que vous fermez la porte. Exécuter nuit à 100 000 tours par minute pendant 18 heures et de 20 ° C. </li><li> Lorsque la centrifugation est terminée, sortez les tubes du rotor à l&#39;aide hémostatique et le placer sur un portoir. </li><li> Visualisez l&#39;ADN avec transilluminateur lumière bleue, ou à défaut, utiliser la lumière UV à long longueur d&#39;onde, dans une pièce sombre. Porter une paire de lunettes filtre ambre pour voir la bande d&#39;ADN. Voir Figure 2. </li><li> Utiliser une seringue stérile et une aiguille 1cc (26G 5 / 8), retirer la bande d&#39;ADN et de le placer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Pour aider à récupérer la plupart de l&#39;ADN piégé dans l&#39;espace vide dans la seringue, rincer la seringue avec 100 pi de TE et ajouter la solution rincé pour le tube. Préparer un tube avec 100 pi de tampon TE par échantillon afin d&#39;éviter toute contamination croisée. </li><li> Pour supprimer EtBr partir de l&#39;ADN, ajouter un volume égal d&#39;eau saturée de butanol dans le tube, inverser les tubes doucement dix à vingt fois, centrifuger à 10000 rpm pendant 1 minute et jetez la couche supérieure. </li><li> Répéter le lavage jusqu&#39;à ce que la couleur de butanol est transparent, 3 - 4 fois plus. </li><li> Place 4 ml de TE dans un tube à centrifuger Amicon Ultra et ajouter la solution d&#39;ADN de haut. </li><li> Centrifuger à 3500 g à température ambiante, jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à environ 100 à 500 ul (environ 6-7 minutes) et jeter le accréditives. </li><li> Ajouter 2 ml de TE Amicon filtre et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout afin d&#39;éviter la contamination croisée. Répéter deux fois. </li><li> Concentré à un volume final de 50-100 ul par centrifugation supplémentaires si nécessaire et le transfert de la solution d&#39;ADN sur le filtre dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon pipette et de haut en bas le long des deux membranes de filtration pour laver tout ADN restants. Ajouter cette solution dans le tube de 5,15. </li><li> Placer un Microcon YM-30 unité de filtre dans un tube Microcon et prélaver le Microcon en ajoutant 200 ul d&#39;eau à l&#39;autoclave et centrifugation à 10000 rpm pendant 7 minutes. </li><li> Ajouter la solution d&#39;ADN de 5,16 à l&#39;Microcon prélavée afin de concentrer davantage l&#39;ADN. Centrifuger à 5000 à 10000 g pendant 1 - 3 minutes. Vérifiez la quantité de liquidesur le filtre de centrifugation et de répéter jusqu&#39;à ce que la quantité de liquide sur le filtre est réduite à environ 50 pi. </li><li> Placez l&#39;unité de filtre à l&#39;envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 g pendant 3 minutes. La quantité idéale de la solution concentrée est de 50-60 pi. </li><li> Mesurer et enregistrer la concentration de l&#39;ADN sur un Nanodrop de vérifier la qualité de pointe (260 nm devrait être). </li><li> Transférer une petite aliquote de l&#39;ADN dans un tube propre eppendorf pour travailler stocks et de geler à moins 20. Transférer le reste de l&#39;ADN à un deuxième eppendorf propre et geler à moins 80. </li></ol> Les résultats représentatifs: Lorsque ce protocole est fait correctement, vous devriez voir une image du gel après l&#39;étape 4.4 dans la détermination de la qualité de l&#39;ADN similaire à la figure 1. Concentration d&#39;ADN réels des extraits varie en fonction de la source de l&#39;échantillon. Après l&#39;étape de 5,7 dans la centrifugation en gradient de CsCl, l&#39;ADN génomique éclairé par la lumière bleue devrait ressembler à la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figure 1" /> Figure 1. Agarose 0,8% l&#39;image électrophorèse sur gel d&#39;ADN de poids moléculaire élevé recueillies auprès de quatre profondeurs dans l&#39;océan Pacifique subarctique (en double), colorées avec l&#39;agent de intercalant bromure d&#39;éthidium (10 mg / ml). Gel a été exécuté à 15V pour ~ 16hrs au 1X tampon de gel TBE cours d&#39;exécution. Des bandes d&#39;échantillon sont de bonne qualité montrant peu de signes de cisaillement mécanique (montre des bandes simples ou frottis, par opposition à bandes multiples) bien que les extraits 10m conserver certains ARN reporté (voir frottis dans l&#39;intervalle de 0,5 à 2,0 kb). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Bande de l&#39;ADN génomique éclairé par une lumière bleue après centrifugation en gradient de CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Selon le nombre d&#39;échantillons doivent être traitées, ce peut être une procédure prend beaucoup de temps à cause des deux étapes d&#39;incubation d&#39;une heure, et les lavages répétés et les étapes de centrifugation. Il est préférable de prévoir deux jours entiers pour cette procédure de laisser suffisamment de temps. S&#39;il ya des problèmes pour obtenir le volume extrait final dans le tube de Amicon de réduire jusqu&#39;à 200-500μl lors de la concentration de l&#39;ADN et à laver, lave supplémentaires essayer d...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 cc (aiguille 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml (aiguille 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 5 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Dispositifs de filtration centrifuge Amicon&amp;#174; Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>Limite nominale de poids moléculaire 10 000</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Préparer une solution saturée en eau (butanol : eau = 1 : 1)</td></tr><tr><td>Rotateur de centrifugeuse, JA5.3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de césium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme : IAA (24 : 1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d'éthidium (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Éthylènediaminetétraacétate de disodium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Four d'hybridation</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td> tampon de lyse</td><td></td><td></td><td>Saccharose 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg dans 1000 &amp;#x03BC;l de tampon TE</td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>Coupure à 50 pb</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Phénol : Chloroforme : IAA (25 : 24 : 1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Transilluminateur à lumière bleue Safe Imager&amp;#8482;</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodécylsulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>SDS à 20 %</td></tr><tr><td>Filtres Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TE, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&amp;#174;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur de centrifugeuse ultracentrifugeuse, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Tube d'ultracentrifugation (7 x 20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Portoir pour tubes d'ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extraction de l&#39;adn à partir de 0,22 filtres sterivex um et le césium centrifugation gradient de chlorure de densité

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Cette méthode est utilisée pour extraire l&#39;ADN de haute moléculaire génomique du poids de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 uM Sterivex qui ont été traités avec de stockage / tampon de lyse et archivée à -80 ° C, et à purifier cet ADN en utilisant un gradient de densité de chlorure de césium. Le protocole débute par deux étapes d&#39;incubation d&#39;une heure pour libérer l&#39;ADN de cellules et de supprimer l&#39;ARN. Ensuite, une série de phénol: chloroforme chloroforme et extractions sont effectuées suivie par une centrifugation pour éliminer les protéines et les composants de la membrane cellulaire, la collecte de l&#39;ADN extrait aqueux, et plusieurs étapes d&#39;échange de tampon à laver et à concentrer l&#39;extrait. Cinquième partie décrit la purification en option via gradient de chlorure de césium de densité. Il est recommandé de travailler avec moins de 15 échantillons en une seule fois pour éviter la confusion et de réduire le temps de protocole. Le temps total requis pour ce protocole dépend du nombre d&#39;échantillons à extraire. Pour 10-15 échantillons et en supposant que l&#39;équipement de centrifugation adéquate est disponible, ce protocole devrait prendre toute les 3 jours. Assurez vous d&#39;avoir les fours hybridation réglé à la température au début du processus.

Nous décrivons une méthode pour l&#39;extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d&#39;une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

Cette méthode est utilisée pour extraire de l'ADN génomique de haut poids moléculaire à partir de biomasse planctonique concentrée sur des filtres Sterivex de 0,22 $\mu$M ayant été...

Bonjour, je suis Jody du laboratoire de Steven Hallam, du Département de microbiologie et d'immunologie à l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'extraction d'ADN génomique, concentré à partir d'échantillons d'eau de mer sur des filtres STX de 0,2 micron, puis purifié par centrifugation en gradient de densité au chlorure de césium. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire afin d'obtenir de l'ADN environnemental, ce qui nous permet d'étudier la structure, la diversité et le métabolisme des communautés microbiennes dans les environnements marins.Commençons donc. Commencez ce protocole en décongelant sur de la glace le filtre X contenant la biomasse planctonique que vous avez précédemment concentrée, traitée avec un tampon de lyse et congelée par commodité. Ici, nous décrivons la procédure de traitement d'un filtre individuel.En pratique, nous recommandons de traiter 15 filtres ou moins à la fois. Une fois que le filtre a dégelé, commencez la première des deux incubations : une pour lyser les cellules et éliminer l'ARN, et une autre pour dégrader les protéines.Pour la première incubation, ajoutez 100 microlitres de lysozyme et 20 microlitres d'ARNase A sur le filtre. Refermez hermétiquement le filtre avec du parafilm et laissez-le tourner à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour l'incubation suivante, ajoutez 100 microlitres de protéinase K et 100 microlitres de SDS à 20 % sur le filtre.Refermer le filtre à l’aide de perfil et le laisser tourner encore une à deux heures. Cette fois à 55 degrés. Utiliser une seringue de cinq cm³ pour transférer le lysat du filtre Stax vers un tube Falcon de 15 millilitres.Rincez le filtre avec un millilitre de tampon de lyse et ajoutez le liquide de rinçage au lysat dans votre tube conique. Maintenant que vous avez lysé et digéré vos cellules, vous êtes prêt à en extraire l'ADN. L'étape suivante consiste à utiliser la méthode au phénol-chloroforme pour extraire l'ADN de votre lysat.Ajouter un volume égal d'environ trois millilitres de phénol-chloroforme-alcool isoamylique au tube de lyzat et vortexer pendant 10 secondes pour bien mélanger. Faire tourner le tube à 2 500 ×g pendant cinq minutes. Pendant la centrifugation, le mélange de lyzat au phénol-chloroforme doit se séparer en deux couches.Une couche organique située en bas, contenant le phénol, le chloroforme et les protéines de votre échantillon, ainsi qu'une couche aqueuse généralement en haut, composée de votre ADN, de l'eau et d'autres molécules plus hydrophiles. Transférez la couche aqueuse contenant votre ADN dans un nouveau tube Falcon de 15 millilitres. À ce tube, ajoutez un volume équivalent d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique, puis vortexez pendant 10 secondes.Cette étape élimine tout phénol résiduel de votre échantillon d'ADN. Faites-le centrifuger à 2 500 ×g pendant cinq minutes ou jusqu'à ce que la couche aqueuse soit claire. Transférez la couche aqueuse dans un nouveau tube conique étiqueté et ajoutez un millilitre de tampon TE à pH huit.Vous disposez désormais de votre extrait d'ADN. La prochaine étape consiste à laver et concentrer l'échantillon d'ADN dans un tube d'ultracentrifugeuse Amazon de 15 millilitres. Transférez votre échantillon d'ADN dans le compartiment du filtre d'un non.Les tubes ultrafuges consistent en un filtre qui retient les molécules de poids moléculaire égal ou supérieur à une valeur spécifiée, d'une tige et d'un tube destiné à recueillir l'écoulement du filtrat. Dans ce cas, le filtre retient votre ADN lors d'une centrifugation à 3 500 fois G pendant 10 minutes. Vérifiez qu'il reste moins d'un millilitre de liquide dans le filtre Amon.Si davantage de rétentat persiste, remplissez à nouveau le filtre avec du tampon TE et effectuez une nouvelle centrifugation. Transférez l’écoulement ou le filtrat dans un autre tube conique et conservez-le au réfrigérateur jusqu’à ce que vous ayez confirmé la présence de votre produit final sur gel. Ajoutez deux millilitres de tampon TE au filtre Amazon et centrifugez à 3 500 ×g pendant six minutes. Récupérez le filtrat comme précédemment.Lavez l'ADN deux fois supplémentaires avec du tampon TE, pour un total de trois lavages, en conservant à chaque fois le filtrat jusqu'à la dernière centrifugation, jusqu'à ce qu'il reste entre 200 et 500 microlitres de Tate dans le filtre Amon. Notez le volume final et transférez-le dans un tube einor de 1,5 millilitre étiqueté. Prélevez une aliquote de 70 microlitres d'ADN concentré lavé pour l'utiliser comme stock de travail.Conservez le stock de travail à moins 20 degrés Celsius. Congelez le reste de l'ADN à moins 80 degrés Celsius. Vérifiez la concentration et la qualité de votre produit final en faisant migrer vos échantillons sur un gel en parallèle avec de l'ADN.Les échelles servant de standards de taille et d'intensité permettent de configurer un gel AROS à 0,8 % additionné de bromure d'athérium pour une électrophorèse nocturne. Dans les premières allées, chargez des échelles contenant des bandes de poids moléculaires et de concentrations variés ; nous recommandons le schéma de chargement suivant. Dans les deux premières allées, chargez 10 microlitres d'une échelle d'un kilobase plus ; dans les trois allées suivantes, chargez respectivement 2 microlitres, 5 microlitres et 10 microlitres d'une échelle Lambda H trois à 50 nanogrammes par microlitre.Enfin, chargez cinq microlitres par puits d'échantillon d'extrait d'ADN. Faites migrer le gel à 15 volts pendant environ 16 heures. Prenez une photographie du gel à l'aide du système de documentation des gels UV afin de déterminer la gamme de poids moléculaire de votre ADN ainsi que sa concentration.Comparez les bandes de l'échantillon aux bandes de l'échelle. Un ADN de bonne qualité présentera un poids moléculaire élevé et montrera peu de signes de cisaillement ou de dégradation. Si la qualité de l'ADN est bonne et que la quantité est suffisante, passez à la purification de l'ADN en réalisant un gradient de chlorure de césium.Étiquetez d'abord par centrifugation, un tube de centrifugation pour chaque échantillon ; ajoutez 160 milligrammes de chlorure de césium et 178 microlitres d'ADN génomique dans chaque tube de centrifugation. Couvrez le tube avec un petit morceau de Parafilm et retournez délicatement le tube 10 à 20 fois afin de mélanger les composants. N'effectuez pas le mélange par pipetage, car cela pourrait provoquer une fragmentation de l'ADN.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de bromure d'AUM au tube et mélangez à nouveau. Assurez-vous que les tubes sont bien équilibrés avant la centrifugation et que les différences de masse entre les tubes sont inférieures à un milligramme. Placez les tubes dans le rotor de l'ultracentrifugeuse à l’aide de ciseaux-pincettes.Ensuite, fermer le couvercle du rotor et placer le rotor à l'intérieur du centrifugeuse ultracentrifugeuse. Le vide de la porte de l'ultracentrifugeuse sera appliqué dès que vous fermerez la porte. Faire tourner toute la nuit pendant un total de 18 heures à 100 000 tr/min à 20 degrés Celsius.Lorsque la centrifugation est terminée, retirez les tubes du rotor à l’aide de ciseaux à pincettes et placez-les sur le support. Transportez les tubes vers le transilluminateur à lumière bleue, mettez les lunettes de protection avec filtre ambré, puis allumez la lumière bleue et observez votre bande d’ADN à l’aide d’une seringue stérile de un cm³ et de son aiguille.Retirez la bande d'ADN, puis placez-la dans un tube einor de 1,5 millilitre afin de récupérer la majeure partie de l'ADN piégé dans l'espace mort de la seringue. Rincez la seringue avec 100 microlitres de tampon te et ajoutez la solution de rinçage dans le tube. Préparez un tube contenant 100 microlitres de tampon te par échantillon afin d'éviter toute contamination croisée.Pour éliminer le bromure d'AUM de l'ADN, ajoutez un volume égal de butanol saturé en eau dans le tube. Retournez doucement les tubes de 10 à 20 fois, centrifugez à 10 000 tr/min pendant une minute, puis jetez la couche supérieure. Répétez le lavage environ trois à quatre fois supplémentaires jusqu'à ce que la couleur du butanol devienne transparente.Placer quatre millilitres de tampon TE dans un tube d'ultracentrifugation conique et ajouter la solution d'ADN provenant de la centrifugation précédente à 3 500 × g à température ambiante jusqu'à ce que le volume d'ADN soit réduit à environ 100 à 500 microlitres, puis jeter le flux traversant. Ajouter deux millilitres de tampon TE sur le filtre Amazon et centrifuger à 3 500 × g pendant six minutes. Répéter deux fois, pour un total de trois lavages, puis concentrer l'échantillon à un volume final de 50 à 100 microlitres par centrifugation supplémentaire si nécessaire.Et transférez la solution d'ADN sur le filtre dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 millilitre. Ajoutez 40 microlitres de TE sur le filtre et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas le long des deux membranes du filtre afin de récupérer tout l'ADN restant. Ajoutez cette solution au tube contenant l'ADN concentré.Placer une unité de filtration MicroCon YM 30 dans un tube MicroCon et pré-laver le MicroCon en ajoutant 200 microlitres d'eau stérilisée au autoclave et en centrifugeant à 10 000 tr/min pendant sept minutes. Ajouter la solution d'ADN au MicroCon pré-lavé afin de concentrer davantage l'ADN par centrifugation à 5 000 à 10 000 ×g pendant une à trois minutes. Vérifier la quantité de liquide sur le filtre et répéter la centrifugation jusqu'à ce que le volume de liquide sur le filtre soit réduit à environ 50 microlitres.Placer l'unité de filtration à l’envers dans un nouveau tube MicroCon et centrifuger à 1000 × g pendant trois minutes. La quantité idéale de solution concentrée est de 50 à 60 microlitres. Transférer votre échantillon d'ADN dans un nouveau tube einor de 1,5 millilitre.Measurez la concentration d'ADN au NanoDrop et vérifiez la qualité du pic. Un graphique des absorbances pour un ADN pur doit présenter un pic net à 260 nanomètres. Congelez le reste de l'ADN à moins 80 degrés Celsius.Lorsque ce protocole est réalisé correctement, vous devriez observer une image de gel similaire à la figure un ; la concentration réelle en ADN des extraits variera selon la source de l'échantillon. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, vous devriez clairement voir une bande d'ADN au milieu du tube. Comme illustré à la figure deux, nous venons de vous montrer comment extraire l'ADN génomique de filtres Sterex et le purifier à l'aide d'un gradient de densité de chlorure de césium.Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vérifier avant de commencer que vous disposez de tous les réactifs et articles consommables nécessaires. Deuxièmement, prévoyez au moins trois jours complets afin d'avoir suffisamment de temps pour réaliser soigneusement la procédure. Voilà tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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