Techniques de microinjection pour l'étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

Cette procédure commence par la collecte des embryons sur des assiettes de jus de raisin frais de 30 à 60 minutes. Après avoir retiré la plaque de la cage du lac, ramassez les embryons avec une brosse humidifiée et placez-les sur du ruban adhésif double. Faites rouler doucement un embryon sur le ruban à l’aide de la moitié d’une pince à épiler jusqu’à ce que le corion s’ouvre.

Prenez l’embryon et placez-le doucement sur le couvercle. Glissez-le sur une couche de colle het. Répétez cette opération jusqu’à ce que vous ayez suffisamment d’embryons.

Après déshydratation, les embryons sont prêts à être injectés. Bonjour, je suis Ingrid Bruce Musher du laboratoire du Dr Jonathan Sculley au Département de biologie moléculaire et cellulaire de l’Université de Californie à Davis. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour micro-injecter des embryons syncytial de drosophiles.

Nous utilisons cette procédure pour étudier le rôle des micro ttes et des moteurs mitrals dans la mitose. Par exemple, nous micro-injectons des anticorps ou d’autres inhibiteurs de protéines mitotiques spécifiques. En analysant l’effet inhibiteur sur la mitose, nous sommes en mesure de déterminer la fonction des protéines cibles.

Alors commençons. Pour commencer les préparatifs deux à trois jours avant l’expérience, installez la cage de ponte en découpant deux petits trous d’environ un centimètre carré sur les côtés opposés d’une bouteille en plastique. Remplissez les trous avec un morceau de coton, en laissant l’air circuler.

Tapotez les mouches dans la bouteille, puis couvrez-la d’une assiette de jus de raisin. Avec la levure, gardez la cage de la patte à température ambiante, les mouches pondront des œufs jusqu’à 10 jours au moins un jour avant l’expérience. Tirez sur les aiguilles pour l’injection et maintenez-les à quatre degrés Celsius.

Le jour de l’expérience, préparez et chargez les aiguilles. Tout d’abord, sortez la tubuline étiquetée du congélateur et mettez-la sur de la glace pendant cinq à 15 minutes. Ensuite, diluez-le avec un tampon GPEM, puis centrifugez-le pendant 10 à 15 minutes à 13 000 tr/min quatre degrés Celsius.

Enfin, chargez un à deux microlitres dans l’aiguille et maintenez-la à quatre degrés Celsius. Pour empêcher la polymérisation induite par la température dans l’aiguille. Avant de mettre en place le bordereau de couverture, faites de la colle à l’heptane en enroulant du ruban adhésif double et en le plaçant dans une bouteille de 100 millilitres.

Ajoutez environ 50 millilitres d’heptane, fermez la bouteille et bercez-la pendant plusieurs jours. Avant de préparer les embryons, faites une chambre de déshydratation dans laquelle les embryons seront placés avant l’injection. Pour ce faire, placez une partie d’une parabole de 35 millimètres à l’intérieur d’une boîte de Pétri de 100 millimètres pour faire une table ajouter un séchoir, à droite, qui est du sulfate de calcium anhydre autour d’elle de sorte que la hauteur de la sécheuse à droite ne soit pas supérieure à la table et au couvercle.

Pour commencer à préparer les embryons, il faut d’abord les collecter dans la cage du lac en changeant la plaque de jus de raisin avec de la levure toutes les heures, les embryons doivent être imagés environ deux heures après le début de la collecte. Pour préparer la lamelle, placez-la sur un côté d’un microscope, glissez-la et collez les quatre coins vers le bas pour qu’elle ne bouge pas. À l’aide d’un applicateur à embout en coton, placez une couche de colle heptane en ligne sur le lamelle.

La colle ne doit pas être visqueuse et doit sécher en quelques secondes. S’il est trop épais, ajoutez plus d’heptane. Enfin, placez un morceau de ruban adhésif double sur la diapositive à côté du couvercle.

Glisser avec une brosse humide. Ramassez soigneusement les embryons dans la plaque de jus de raisin et placez-les sur le double ruban adhésif sur la lame. Ensuite, utilisez la moitié d’une pince à épiler pour rouler les embryons sur le double ruban adhésif jusqu’à ce que le corion s’ouvre.

Prenez l’embryon en le faisant rouler doucement sur le Corian pour qu’il adhère à la pince à épiler et placez-le sur la colle heptane sur le couvercle. Glisser avec le côté long de l’embryon parallèle au côté long de la lamelle. Placez 10 à 20 embryons dans une rangée.

Retirez la lamelle et placez-la dans la chambre de déshydratation pendant trois à huit minutes. Le temps dépend de l’humidité locale et de la quantité à injecter. Ensuite, placez la lamelle sur une chambre métallique avec de la graisse sous vide.

Enfin, couvrez les embryons avec de l’huile de halo de carbone pour éviter une déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés. Tout d’abord, trouvez les embryons sous un objectif de 16 x.

Éloignez les embryons et trouvez l’aiguille sans bouger le plan focal. Centrez l’aiguille et déplacez-la vers le haut sans la déplacer dans la direction X ou Y. Pour ouvrir l’aiguille, placez le bord de la lamelle dans le champ de vision, mais pas là où se trouvera l’aiguille.

Et abaissez l’aiguille au même plan focal. Déplacez très soigneusement la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche l’aiguille et l’ouvre doucement. Déplacez l’aiguille vers le haut.

Maintenant, voyez les embryons. Abaissez l’aiguille dans l’huile, et pour vous assurer d’obtenir de belles gouttes de liquide de l’aiguille. Déplacez régulièrement l’embryon dans l’aiguille, injectez une goutte dans l’embryon, puis éloignez l’embryon.

Une fois que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observés au microscope confocal avec un objectif 60 ou 100x. Un embryon témoin devrait ressembler à celui de ce film. Il s’agit d’un embryon exprimant la tubuline GFP et l’histone RFP imagé avec un objectif 100 x sur un microscope confocal à disque rotatif.

Le temps total indiqué est de huit minutes. Les parcelles de distance d’un pôle à l’autre sont très reproductibles et constituent une mesure fiable du succès chez les embryons témoins. Ils devraient ressembler à ceux illustrés ici pour les cycles 11 à 13.

On voit dans ce film un autre embryon témoin. Celui-ci exprimant KLP 61 FGFP et injecté avec de la tubuline r Domine. Cela a également été imagé avec un objectif de 100 x sur un disque confocal en rotation, et le temps total est de sept minutes.

Ce film a été acquis immédiatement après la microinjection, et le gradient de concentration de la tubuline Domine est clairement visible au début du film. Ces embryons peuvent être utilisés pour étudier l’inhibition de Klp 61 F après micro-injection d’anticorps Klp 61 F. On peut voir la perte de Klp 61 FGFP des broches.

Nous venons de vous montrer comment micro-injecter des embryons incisionnels de drosophiles. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer des contrôles, de s’entraîner d’abord à injecter du tampon ou de la rutine seuls, et de s’assurer que la mitose se déroule normalement dans les cellules cellulaires. Une fois que toutes vos injections sont fiables et ne causent pas de dommages, vous pouvez injecter un inhibiteur et étudier l’effet de cette inhibition particulière.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.