Name: Techniques de microinjection pour létude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Apprenez la microinjection dans les embryons syncytiaux de Drosophila melanogaster pour étudier la mitose en biologie cellulaire. Cette technique permet d'analyser la division cellulaire avec une imagerie haute résolution.

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Ce protocole est actuellement utilisé dans notre laboratoire et a été affiné au fil des années par de nombreuses personnes, y compris les Drs David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia SOMMI, Dhanya Cheerambathur. Nous remercions le Dr Bill Sullivan (UCSC) qui nous a fourni d&#39;excellents conseils sur la manipulation et la micro-injection d&#39;embryons de drosophile tôt quand notre travail dans ce système a été lancé (réf. 13). Nous remercions tous les membres du laboratoire Scholey. Notre travail sur la mitose chez la drosophile est soutenu par NIH GM55507.

Recettes: Plaques Jus de raisin: <ul><li> 5.5g bacto agar </li><li> 14,5 g de dextrose ou de glucose </li><li> 7,15 g de saccharose </li><li> 45 ml de concentré de jus de raisin (jus 100%). </li><li> 204,5 ml d&#39;H 2 0 </li><li> 625 ul de NaOH 10N </li></ul> Mélanger tous les ingrédients et les micro-ondes jusqu&#39;à ébullition. Ajouter 2,8 ml d&#39;acide mélange (mix d&#39;acide: 20,9 ml d&#39;acide propionique, 2,1 ml d&#39;acide phosphorique, 27 ml de H 2 0) Mélangez et versez sur 35 boîtes de Pétri mm. Laisser solidifier à température ambiante pendant un ou deux jours. Si les plaques ne vont pas être utilisés rapidement, sceller avec du parafilm et de garder à 4 ° C (laisser s&#39;équilibrer à température ambiante avant de l&#39;utiliser). Pâte de levure: Dissolvez environ une cuillère à café de levure (Sigma YSC2, levure de Saccharomyces cerevisiae type II) dans l&#39;eau pour former une pâte épaisse. Placer une petite quantité de ce sur chaque assiette de jus de raisin, juste avant utilisation. G-PEM mémoire tampon: <ul><li> 80 mM de Na-PIPES, pH 6,9 </li><li> MgCl2 1 mM </li><li> 1 mM d&#39;EGTA </li><li> 1 mM GTP </li></ul> Tampon d&#39;injection: <ul><li> 150 mM de K-aspartate </li><li> 10 mM de K-phosphate </li><li> 20 mM imidazole, pH 7,2 </li></ul> Colle Heptane: Dérouler ruban adhésif double collant et le placer dans une bouteille 100ml, ajouter environ 50 ml d&#39;heptane, sceller la bouteille, et le rock pendant plusieurs jours. Lors de l&#39;utilisation, ajouter heptane si la colle est trop épaisse. Chambre de déshydratation: Prenez une boîte de Petri de 100 mm, mettre une partie d&#39;un plat de 35 mm à l&#39;intérieur pour faire une «table» et d&#39;ajouter Drierite (sulfate de calcium anhydre) autour de lui afin que la hauteur des Drierite n&#39;est pas plus élevé que la «table» et couvrir. La lamelle avec des embryons sera mis sur cette &quot;table&quot; pour déshydratation avant l&#39;injection. C&#39;est une bonne idée d&#39;utiliser au moins quelques Drierite indiquant et le changer quand il a changé de couleur. Protocole: Ce protocole peut être utilisé pour l&#39;injection de pratiquement tous les réactifs solubles dans l&#39;embryon de drosophile syncytial: Par exemple, soit une protéine fluorescente pour l&#39;observation ou un inhibiteur de la protéine cible ou les deux. Obtenir tout est prêt: 1 .- 2 à 3 jours avant l&#39;expérience, faire des plaques de jus de raisin et de mettre en place jeter en cage: Prendre une bouteille en plastique (6 oz, à fond rond de scientifique appliquée drosophile), couper deux petits trous (environ 1cm 2) sur les côtés opposés du bouteille et remplissez avec un morceau de coton (ce qui permettra une circulation d&#39;air), appuyez sur les mouches dans la bouteille et couvrir avec une assiette de jus de raisin. Gardez à 25 ° C (ou température ambiante), les mouches devraient définir les embryons pendant environ 10 jours. 2 .- Au moins un jour avant l&#39;expérience tirez aiguilles pour l&#39;injection, on utilise une aiguille Kopf / pipette extracteur de modèle 720 et minces filaments de verre à paroi (World Precision Instruments tw100f). Pour l&#39;injection de tubuline fluorescente, gardez aiguilles à 4 ° C pour empêcher la température induite par polymérisation dans l&#39;aiguille. Préparation de la tubuline: Remarque: Tous les travaux avec la tubuline devrait être fait à 4 ° C pour empêcher la polymérisation. <ol><li> Prenez la tubuline étiquetés hors du congélateur et le mettre sur la glace pendant 5 à 15 minutes. </li><li> Diluer avec le G-PEM tampon (4 à 10 fois selon l&#39;intensité requise). </li><li> Centrifuger à 13k rpm à 4 ° C pendant 10-15 minutes. </li><li> Charge de 1 à 2 ul dans l&#39;aiguille. </li></ol> Anticorps ou d&#39;un inhibiteur chimique: Préparer aiguilles comme pour la tubuline, en utilisant une concentration appropriée (ce peut être nécessaire de tester). L&#39;anticorps peut être dans le tampon d&#39;injection, le G-PEM tampon ou PBS. Si un autre tampon est nécessaire, ce tampon devra être injectée comme un contrôle pour s&#39;assurer que ce tampon provoque pas de dégâts sur son propre. Remarque: la tubuline inhibiteur et fluorescentes peuvent être mélangés et injectés ensemble, si les concentrations le permettent. Sinon, injecter la tubuline fluorescente et attendre 5 à 10 minutes avant l&#39;injection de l&#39;inhibiteur. Lorsque vous effectuez une double injection, commencer avec plus d&#39;embryons, car moins d&#39;embryons va récupérer normalement. Collecte d&#39;embryons: <ol><li> Mettez une plaque de raisin jus de nouvelles sur la cage laïcs. </li><li> Retirez cette plaque au bout d&#39;une heure, il s&#39;agit de la première collection de la journée et ne sont souvent pas très bon. Il peut être mis au rebut. </li><li> Changer la plaque toutes les heures pour garder les embryons de collecte pour une heure chacune. </li></ol> Préparation de la lamelle: <ol><li> Mettre une lamelle de 50 x 22mm sur un côté d&#39;une lame de microscope. Bande des quatre coins de la lame de sorte qu&#39;il ne bouge pas. </li><li> En utilisant un coton-tige, placez une couche de colle heptane en une seule ligne sur la lamelle (la colle ne doit pas être visqueux et doit sécher en quelques secondes, sinon ajouter plus heptane). </li><li> Placer un morceau dedoubles ruban adhésif sur la lame vers le côté de la lamelle. </li></ol> Préparation de l&#39;embryon: Remarque: Les embryons doivent être imagés environ 2 heures après le début de la collecte, afin de commencer les étapes suivantes laissant suffisamment de temps pour les terminer dans ce laps de temps. <ol><li> Avec un pinceau imbibé soigneusement ramasser les embryons de la plaque de jus de raisin et le placer sur un ruban adhésif double glissière. </li><li> Utilisation de la partie externe de la pince à épiler, rouler les embryons au cours du ruban adhésif double collant jusqu&#39;à la chorion (la membrane externe) Séjours ouverts. </li><li> Ramassez l&#39;embryon par la doucement rouler sur le chorion de sorte qu&#39;il colle à la pince à épiler et le placer sur la colle heptane sur la lamelle avec le côté long du parallèle embryon pour le côté long de la lamelle. Réglez hausse de 10 à 20 embryons dans une rangée. </li><li> Retirer la lamelle et la placer dans la chambre de déshydratation pour les 3 à 8 minutes (cela dépend de l&#39;humidité de la pièce et la quantité à injecter). </li><li> Placer sur une enceinte métallique avec de la graisse à vide. </li><li> Couvrir les embryons avec 700 huile halocarbone pour éviter de nouvelles déshydratation. Les embryons sont maintenant prêtes pour l&#39;injection. </li></ol> L&#39;injection d&#39;embryons: <ol><li> Trouvez les embryons dans un objectif 16x. </li><li> Déplacer les embryons loin, et de trouver l&#39;aiguille sans déplacer le plan focal. </li><li> Centre de l&#39;aiguille et le déplacer en place sans la déplacer en direction X ou Y. </li><li> Si l&#39;aiguille n&#39;est pas ouvert, placez le bord de la lamelle dans le champ de vision, mais pas là où l&#39;aiguille sera, et abaisser l&#39;aiguille au même plan focal. Très soigneusement déplacer la lamelle jusqu&#39;à ce qu&#39;il frappe l&#39;aiguille et la douceur des pauses de l&#39;ouvrir. Si l&#39;aiguille est ouvert, passez à l&#39;étape 5. (Aiguilles peuvent être ouvertes avec de l&#39;acide fluorhydrique, avant le remplissage). </li><li> Mettez les embryons en vue (mais pas là où l&#39;aiguille sera), abaisser l&#39;aiguille dans l&#39;huile et assurez-vous d&#39;obtenir des gouttes de liquide bien de l&#39;aiguille. </li><li> Soigneusement mais sûrement passer l&#39;embryon dans l&#39;aiguille et injecter une goutte dans l&#39;embryon et l&#39;embryon se déplacer loin. (Ou suivez les instructions de votre appareil d&#39;injection). </li><li> Après que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts pour l&#39;observation sur un microscope confocal. </li></ol> Imagerie: Image des embryons sur un microscope confocal avec un objectif de 60 ou 100X: Notes: <ol><li> L&#39;intervalle de temps sur une série laps de temps devrait être au plus de quelques secondes, depuis la mitose chez l&#39;embryon est très rapide, selon le processus exact d&#39;être étudiée. </li><li> Une série en 3D ou un seul plan peut être acquis en fonction du procédé d&#39;intérêt. </li><li> Pour les inhibiteurs à action rapide, le transfert du microscope injection microscope d&#39;imagerie doit être rapide. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Étude de la mitose dans la drosophile embryon syncytial. Noyaux dans l&#39;embryon précoce subissent des divisions rapides sans cytokinèse, lors des cycles de 10 à 13 former des noyaux d&#39;une monocouche au niveau du cortex. Une. Schéma de l&#39;embryon précoce avec des noyaux à cortex. Embryon peut exprimer la GFP et / ou DP protéines marquées et peuvent être microinjectés avec d&#39;autres protéines marquées et / ou inhibiteurs. Imagerie B. laps de temps de l&#39;embryon exprimant la GFP-tubuline et de la DP-histones. Plot C. pôle-pôle de séparation pour les cycles 11 , 12 et 13 dans un embryon de type sauvage. Longueur de la broche expositions des périodes de durée isométrique et des périodes d&#39;allongement, qui sont très cohérents et reproductibles. Dynamique des microtubules D. broche. L&#39;injection d&#39;une faible concentration de tubuline conduit à la rhodamine taches formées d&#39;un sous-unités de tubuline années, ce qui peut être utilisée pour étudier la dynamique des microtubules.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
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<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Ce protocole est relativement simple, cependant, chaque étape requiert la pratique de s&#39;assurer que les embryons ne sont pas endommagés. Expériences de contrôle minutieux toujours besoin d&#39;être fait pour s&#39;assurer que des résultats fiables sont obtenus. Une bonne façon de commencer ce n&#39;est par la micro-injection de tubuline tampon ou la rhodamine dans des embryons de contrôle exprimant la GFP-tubuline afin de s&#39;assurer que la mitose se déroule normalement dans tous les cycles à la surface d&#39;embr...

techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les drosophila melanogaster embryon syncytial

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de l&#39;embryon de Drosophila melanogaster pour l&#39;étude de la mitose syncytial 1. Drosophile a la génétique utile avec un génome séquencé, et il peut être facilement entretenu et manipulé. Il existe de nombreux mutants mitotique, et les mouches transgéniques exprimant fonctionnelle par fluorescence (par exemple GFP) - protéines mitotiques étiquetés ont été et sont générés. L&#39;expression du gène ciblé est possible en utilisant le système GAL4/UAS 2. La drosophile embryon précoce effectue mitoses multiples très rapidement (durée du cycle cellulaire, ≈ 10 min). Il est bien adapté pour l&#39;imagerie de la mitose, parce que pendant les cycles de 10-13, les noyaux se divisent rapidement et de manière synchrone, sans intervenir cytokinèse à la surface de l&#39;embryon dans une seule monocouche juste en dessous du cortex. Ces noyaux se divisent rapidement probablement utiliser la machinerie mitotique même que d&#39;autres cellules, mais ils sont optimisés pour la vitesse, le checkpoint est généralement admis de ne pas être rigoureux, permettant l&#39;étude des protéines mitotique dont l&#39;absence entraînerait l&#39;arrêt du cycle cellulaire dans les cellules avec un checkpoint forte . Embryons exprimant des protéines GFP étiqueté ou microinjectés avec des protéines marquées par fluorescence peut être facilement imagée de suivre la dynamique en direct (Fig. 1). En outre, les embryons peuvent être microinjectés avec fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de protéines spécifiques à étudier l&#39;effet de la perte ou la perturbation de leur fonction 3. Ces réactifs peuvent diffuser dans tout l&#39;embryon, atteignant plusieurs fuseaux pour produire un gradient de concentration de l&#39;inhibiteur, ce qui entraîne à son tour dans un gradient de défauts comparables à une série allélique de mutants. Idéalement, si la protéine cible est marqué par fluorescence, le gradient d&#39;inhibition peut être visualisé directement 4. Il est supposé que la plus forte phénotype est comparable à l&#39;phénotype nul, mais il est difficile d&#39;exclure formellement la possibilité que les anticorps peuvent avoir des effets dominante dans de rares cas, des contrôles afin rigoureuse et une interprétation prudente doit être appliquée. Plus loin du site d&#39;injection, la fonction des protéines n&#39;est que partiellement perdue permettant d&#39;autres fonctions de la protéine cible à devenir évidents.

Ce protocole décrit l&#39;utilisation de micro-injection et l&#39;imagerie à haute résolution dans le<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embryon syncytial pour étudier la mitose.

Techniques de microinjection pour l&#39;étude de la mitose dans les Drosophila melanogaster Embryon syncytial

Ce protocole décrit l'utilisation de l'embryon syncytial de Drosophila melanogaster pour l'étude de la mitose. Drosophila possède une génétique utile avec un génome séquencé...

Cette procédure commence par la collecte d'embryons sur des boîtes contenant de la gelée de jus de raisin, pendant 30 à 60 minutes. Après avoir retiré la boîte de la cage d'élevage, prélevez les embryons à l’aide d’un pinceau humide et déposez-les sur un ruban adhésif double face. Faites rouler délicatement un embryon sur le ruban à l’aide d’une moitié de pince à épiler jusqu’à ce que le chorion s’ouvre.Prenez l'embryon et placez-le délicatement sur la lamelle. Recouvrez-le d'une couche de colle het. Répétez cette opération jusqu'à ce que vous ayez suffisamment d'embryons.Après la déshydratation, les embryons sont prêts pour l'injection. Bonjour, je suis Ingrid Bruce Musher du laboratoire du Dr. Jonathan Sculley, du Département de biologie moléculaire et cellulaire de l'Université de Californie à Davis. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'injecter microscopiquement des embryons syncytiaux de drosophile.Nous utilisons cette procédure pour étudier le rôle des microtubules et des moteurs basés sur la protéine mitotique dans la mitose. Par exemple, nous micro-injectons des anticorps ou d'autres inhibiteurs de protéines mitotiques spécifiques. En analysant l'effet de l'inhibiteur sur la mitose, nous sommes en mesure de déterminer la fonction de la protéine ciblée.Commençons. Pour commencer les préparatifs deux à trois jours avant l'expérience, installez la cage de ponte en découpant deux petits trous d'environ un centimètre carré sur des côtés opposés d'une bouteille en plastique. Boucher les trous avec un morceau de coton, afin de permettre la circulation de l'air.Faites tomber les mouches dans la bouteille, puis recouvrez-la avec une plaque de jus de raisin. En présence de levure, maintenez la cage à mouches à température ambiante afin que les mouches pondent des œufs pendant jusqu'à 10 jours, au moins un jour avant l'expérience. Prélevez les aiguilles destinées à l'injection et conservez-les à quatre degrés Celsius.Le jour de l'expérience, préparez et chargez les aiguilles. Tout d'abord, sortez la tubuline étiquetée du congélateur et placez-la sur de la glace pendant cinq à quinze minutes. Ensuite, diluez-la avec du tampon GPEM, puis centrifugez-la de 10 à 15 minutes à 13 000 tr/min à quatre degrés Celsius.Enfin, chargez un à deux microlitres dans l'aiguille et conservez-la à quatre degrés Celsius afin d'éviter la polymérisation induite par la température dans l'aiguille. Avant de mettre en place la lame couvre-objet, préparez une colle à heptane en enroulant du ruban adhésif double face et en le plaçant dans un flacon de 100 millilitres.Ajoutez environ 50 millilitres d'heptane, scellez la bouteille et agitez-la pendant plusieurs jours. Avant de préparer les embryons, préparez une chambre de déshydratation dans laquelle les embryons seront placés avant l'injection. Pour ce faire, placez une partie d'une boîte de 35 millimètres à l'intérieur d'une boîte de Petri de 100 millimètres afin de former une plateforme, puis ajoutez un dessiccant, à savoir du sulfate de calcium anhydre, autour de celle-ci, de sorte que la hauteur du dessiccant ne dépasse pas celle de la plateforme, et recouvrez le tout.Pour commencer la préparation des embryons, commencez par les recueillir à partir de la cage lacustre en changeant la plaque de jus de raisin avec de la levure chaque heure ; les embryons doivent être observés environ deux heures après le début du prélèvement. Pour préparer la lamelle, placez-la sur un côté d'une lame de microscope et fixez les quatre coins avec du ruban adhésif afin qu'elle ne bouge pas. À l'aide d'un applicateur en coton, appliquez une couche de colle à l'heptane en ligne sur la lamelle.La colle ne doit pas être visqueuse et doit sécher en quelques secondes. Si elle est trop épaisse, ajoutez davantage d'heptane. Enfin, placez un morceau de ruban adhésif double face sur la lame, à côté du couvre-objet.Faites glisser avec un pinceau humidifié. Ramassez délicatement les embryons depuis la plaque de jus de raisin et placez-les sur le ruban adhésif double face fixé sur la lame. Ensuite, utilisez une moitié de pince pour faire rouler les embryons sur le ruban adhésif double face jusqu'à ce que le chorion s'ouvre.Prendre l'embryon en le faisant doucement rouler sur le Corian afin qu'il adhère à la pince, puis le placer sur la colle à heptane présente sur la lamelle. Positionner l'embryon de façon que son côté long soit parallèle au côté long de la lamelle. Placer 10 à 20 embryons en une seule rangée.Retirez la lame couvre-objet et placez-la dans la chambre de déshydratation pendant trois à huit minutes. Le temps nécessaire dépend de l'humidité locale et de la quantité à injecter. Ensuite, placez la lame couvre-objet sur une chambre métallique munie de graisse à vide.Enfin, recouvrez les embryons avec de l'huile de carbone halo pour éviter toute déshydratation supplémentaire. Les embryons sont maintenant prêts pour l'injection. Commencez par localiser les embryons sous un objectif 16 x.Déplacez les embryons et localisez l’aiguille sans modifier le plan focal. Centrez l’aiguille puis déplacez-la vers le haut sans la bouger dans les directions X ou Y. Pour ouvrir l’aiguille, insérez le bord de la lame couvre-objet dans le champ de vision, mais pas à l’endroit où se trouvera l’aiguille.Et abaissez l’aiguille jusqu’au même plan focal. Déplacez très prudemment la lame couvre-objet jusqu’à ce qu’elle touche l’aiguille et la brise délicatement. Remontez l’aiguille.Placez maintenant les embryons en vue. Abaissez l’aiguille dans l’huile, et veillez à obtenir de belles gouttes de liquide à l’extrémité de l’aiguille. Déplacez l’embryon vers l’aiguille, injectez-y une goutte, puis éloignez l’embryon.Une fois que tous les embryons ont été injectés, ils sont prêts à être observés au microscope confocal avec un objectif de 60 ou 100 x. Un embryon témoin doit ressembler à celui présenté dans ce film. Il s'agit d'un embryon exprimant la tubuline GFP et l'histone RFP, imagé avec un objectif de 100 x sur un microscope confocal à disque tournant.Le temps total indiqué est de huit minutes. Les courbes représentant la distance du pôle au pôle sont très reproductibles et constituent une mesure fiable du succès chez les embryons témoins. Elles doivent ressembler à celles présentées ici pour les cycles 11 à 13.On observe dans ce film un autre embryon témoin. Celui-ci exprime KLP61F-GFP et a été injecté avec de la tubuline marquée au rhodamine. L'observation a également été réalisée avec un objectif 100 x sur un microscope confocal à disque tournant, et la durée totale est de sept minutes.Ce film a été enregistré immédiatement après la microinjection, et le gradient de concentration de la tubuline r Domine est clairement visible au début du film. Ces embryons peuvent être utilisés pour étudier l'inhibition de Klp 61 F après microinjection de l'anticorps anti-Klp 61 F. On peut observer la perte de Klp 61 FGFP à partir des fuseaux.Nous venons de vous montrer comment réaliser une microinjection chez les embryons de drosophile en stade de blastodermes cellulaires. Lors de cette procédure, il est important de prévoir des contrôles, de s'exercer d'abord à injecter du tampon ou de la rutine seul, et de s'assurer que la mitose progresse normalement au cours de la phase cellulaire. Une fois que toutes vos injections sont fiables et ne causent aucun dommage, vous pouvez injecter un inhibiteur et étudier l'effet de cette inhibition particulière.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

La contractilité de l’actomyosine joue un rôle important dans la morphogenèse des cellules et des tissus. Cependant, il est difficile de manipuler la contractilité de l’actomyosine in vivo de manière aiguë. Ce protocole décrit un système optogénétique qui inhibe rapidement la contractilité de l’actomyosine médiée par Rho1 dans les embryons de drosophile , révélant la perte immédiate de la tension épithéliale après l’inactivation de l’actomyosine in vivo.

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Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.

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Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

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