Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique

La fabrication du dispositif de co-culture neuronale microfluidique à compartiments multiples commence par la définition de réservoirs sur le bloc PMMA à l’aide d’une fraiseuse, suivie de l’embossage à chaud de réseaux de microcanaux reliant les compartiments. Une fois le moule A-P-M-M-A préparé, on reproduit à partir de celui-ci le moule maître A-P-D-M-S à partir du moule PMMA, puis on le recouvre de trichloroéthylène. Le dispositif final est reproduit à partir du moule maître en PDMS et assemblé sur une plaque de culture revêtue de PDL.

Des neurones primaires de rat E 16 à 18 sont ensuite chargés dans le compartiment des corps cellulaires et cultivés pendant deux semaines avant d'ajouter un à deux cellules d'oligodendrocytes de rat au-dessus des couches axonales à l'intérieur du compartiment axonal pour une co-culture. Bonjour, je suis J Par du Laboratoire de systèmes nano-biologiques du département de génie électrique et informatique de l'Université Texas A&M. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de fabrication d'une plateforme microfluidique multicompartment pour la co-culture de neurones.

Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier in vitro les interactions entre les neurones et les cellules gliales du système nerveux central. Commençons donc. Pour commencer cette procédure, utilisez une fraiseuse micro-métrique afin de réaliser des compartiments profonds de 3,5 millimètres.

Dans le bloc A-P-M-M-A, définir un compartiment soma et six compartiments axonaux ggl. Après avoir préparé les compartiments, effectuer une sonication dans de l'isopropanol pendant 10 minutes afin d'éliminer les débris, puis créer des structures en micro-crêtes sur la lame de verre à l'aide d'un procédé classique de photolithographie et de gravure humide. Reproduire les motifs en micro-crêtes à chaud à partir du verre. Transférer les motifs sur le gabarit maître en PMMA, puis aligner manuellement le gabarit maître en PMMA et le substrat en verre.

Ensuite, augmentez la température jusqu'à 115 degrés Celsius sur une presse chaude. Une fois la température atteinte, appliquez un poids de 0,5 tonne pendant cinq minutes. Après cinq minutes, refroidissez jusqu'à 40 degrés Celsius et relâchez la pression.

Commencez maintenant la préparation du moule en PDMS. Mélangez le prépolymère de PDMS avec son agent de réticulation selon un rapport de 10 à 1 en poids, découpez le moule en PMMA en blocs de 50 millimètres sur 50 millimètres. À l’aide d’une scie courbe, placez-le à l’intérieur d’un moule et versez le mélange de PDMS par-dessus le moule en PMMA. Placez le moule dans un dessiccateur relié à une pompe à vide et aux DGAs pendant 15 minutes.

Pour éliminer les bulles générées lors du processus de mélange du PDMS. Une fois toutes les bulles retirées, placez le moule dans un four nivelé à 85 degrés Celsius pendant une heure pour la polymérisation. Maintenant que le PDMS est complètement polymérisé, décollez le moule en PDMS du moule en PMMA. Vaporisez le moule en PDMS en le plaçant à l'intérieur d'un dessiccateur contenant deux à trois gouttes de trichloréthylène et appliquez un vide pendant 15 minutes.

Le revêtement du moule maître en PDMS facilite le relâchement du dispositif final de co-culture neuronale en PDMS à partir du moule maître en PDMS. Après le revêtement, le moule maître en PDMS est brièvement rincé à l'alcool isopropylique pour éliminer l'excès de trichloroéthylène, puis séché à l'aide de gaz azote. La fabrication du dispositif de co-culture neuronale à partir du polymère PDMS est similaire à la préparation du moule maître en PDMS décrite dans la section précédente. Commencez par mélanger le pré-polymère PDMS avec l'agent opacifiant dans un rapport de 10 à 1 en poids, puis versez le mélange de PDMS sur le moule maître en PDMS. Il est important de ne pas verser trop de PDMS afin que la structure en PDMS haute de 3,5 millimètres sur le moule maître ne soit pas complètement immergée.

Placer les DGA dans un dessiccateur relié à une pompe à vide pendant 15 minutes. Une fois toutes les bulles éliminées, introduire le PDMS dans une étuve de niveau horizontal réglée à 85 degrés Celsius pendant une heure afin de procéder à la polymérisation. Au terme de cette heure, retirer le PDMS de l’étuve et le laisser refroidir à température ambiante. Ensuite, décoller délicatement les dispositifs de culture neuronale en PDMS du moule maître en PDMS.

Enveloppez les dispositifs en PDMS dans du paraforme pour les protéger de la poussière ou des débris. Pour terminer, découpez le PDMS enveloppé dans du paraforme en pièces individuelles à l’aide d’une perceuse équipée d’une lame ; les dispositifs en PDMS pour co-culture neuronale sont alors presque prêts à être utilisés dans des plaques de culture cellulaire. Avant de placer le dispositif en PDMS pour co-culture neuronale dans une plaque de culture cellulaire, insérez-le dans le nettoyeur à plasma et exposez-le au plasma d’air pendant 90 secondes afin de rendre la surface hydrophile.

Ce traitement facilitera le remplissage des microcanaux avec le milieu de culture après assemblage sur des plaques revêtues de polylysine. Afin de stériliser le dispositif traité au plasma, immergez-le dans de l'éthanol à 70 % pendant 30 minutes, puis placez le récipient dans la hotte stérile. Après 30 minutes, retirez le dispositif et séchez-le à l'aide d'un gaz azote filtré par un filtre Millipore de 0,2 micron.

Placez ensuite les dispositifs séchés sur une plaque de culture en polystyrène de six puits revêtue de poly-D-lysine et appliquez une pression douce pour assurer un joint étanche entre la surface de la plaque de culture et la glace du dispositif. Remplissez maintenant le compartiment des corps cellulaires avec le milieu de culture. Attendez une à deux minutes pour vous assurer qu'aucune bulle n'est piégée dans les microcanaux.

Ensuite, remplir les six compartiments axone-glie. Enfin, incuber les dispositifs remplis de milieu de culture toute la nuit dans une étuve à 37 degrés Celsius afin d'éliminer tout débris ou résidu toxique éventuel. Après l'incubation nocturne, la culture peut être initiée en vue de la mise en charge des cellules dans le dispositif.

Utilisez une pipette pour aspirer le milieu de culture des compartiments Soma et Axone. Ensuite, chargez 40 microlitres de cellules neuronales primaires du cerveau antérieur provenant de rats au jour embryonnaire 16 à 18 dans le compartiment soma autour des entrées des microcanaux, avec une densité aérienne de 500 cellules par millimètre carré. Il est important de ne pas toucher le dispositif en PDMS lors du chargement des cellules, car cela pourrait rompre le scellement entre le dispositif et la plaque de culture cellulaire.

Ces images microscopiques montrent des cellules neuronales marquées au colorant pour le calcium. À l'intérieur du compartiment du soma, les cellules sont uniformément chargées dans le compartiment et situées près des canaux microfluidiques. Incuber les dispositifs chargés de cellules pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius afin d'améliorer l'adhérence cellulaire au substrat.

Après cette incubation, remplir tous les compartiments avec le milieu de culture. Maintenir les cellules en croissance dans le dispositif à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2, et renouveler uniquement la moitié du milieu de culture tous les trois ou quatre jours. Un réseau axonal dense devrait se former à l'intérieur des compartiments axone-glie.

Après deux semaines de culture, soit 14 jours après la mise en culture, les cellules CLIA de neurones primaires in vitro sont ajoutées avant le chargement des cellules ; aspirez environ 60 % du milieu de culture à partir des compartiments. Les oligodendrocytes ont été disséqués à partir des hémisphères cérébraux de rats Sprague Dawley âgés de un à deux jours après la naissance. Ajoutez cinq microlitres de cellules oligodendrocytaires dans chaque compartiment axone-glie à une densité surfacique de 1000 cellules par millimètre carré. Il est essentiel de faire attention à ne pas toucher le substrat du fond avec la pipette lors du chargement, car cela pourrait endommager le réseau axonal formé sur le substrat. Après l'ajout des oligodendrocytes, incubez les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis complétez les compartiments avec du milieu.

Avec le milieu de culture, continuer à cultiver les neurones comme avant l'ajout du CLIA, en renouvelant uniquement la moitié du milieu de culture tous les trois ou quatre jours pendant encore deux semaines, tout en étudiant le système nerveux central des mammifères. L'interaction axone-glie lorsque les expériences sont correctement réalisées. Les cellules neuronales chargées dans le compartiment du soma se localisent près des entrées des microcanaux et une couche axonale commence à se former à l'intérieur des compartiments axonaux Ggl.

Après une semaine de culture, la présence d'agrégats cellulaires de neurones à l'intérieur du compartiment somatique peut indiquer que les cellules ne sont pas en bonne santé lors du chargement des oligodendrocytes. Après deux semaines de culture neuronale, les compartiments axonaux doivent être recouverts d'une couche dense d'axones, et les oligodendrocytes doivent être ajoutés par-dessus la couche axonale. Nous venons de vous montrer comment fabriquer une plateforme de culture neurogliale multicompartment et comment l'utiliser pour étudier in vitro les interactions entre les cellules nerveuses centrales et la neuroglie.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de protéger les dispositifs de la poussière et de ne pas les stériliser trop longtemps dans l'éthanol, car cela pourrait altérer le collage. Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.