Purification des mitochondries de cellules de levure

Ce protocole commence par la conversion des cellules de levure en plaques Sphero en digérant la paroi cellulaire avec une liaison simultanée, les plaques sphero sont ensuite homogénéisées à l’aide d’un homogénéisateur en verre téflon. L’homogénat résultant est soumis deux fois à la centrifugation, à des granules, à des cellules ininterrompues, à des noyaux et à de gros débris. Ensuite, le surnageant résultant est centrifugé pendant 15 minutes à 12 000 G pour sédimenter les mitochondries.

Enfin, la fraction mitochondriale brute qui contient encore d’autres organites est soumise à une centrifugation pendant 60 minutes à 134 000 Gs dans un gradient de densité de saccharose, les mitochondries pures dépourvues de contamination par d’autres organites sont récupérées à l’interface de 60 % en poids par volume et de 32 % en poids par volume de saccharose. Bonjour, je suis le Dr Christopher Greg du laboratoire du Dr Vladimir tko au département de biologie de l’Université Concordia. Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler les mitochondries de la levure scro mysia.

Nous faisons cela pour étudier la dynamique et les changements liés à l’âge qui se produisent dans les mitochondries. Au fur et à mesure que les cellules vieillissent, nous allons examiner les changements dans le protéome, les lipides et l’ADN des mitochondries. Alors commençons.

Commencez ce protocole en cultivant la souche de levure dans dix flacons de deux cent cinquante millilitres. Chacun contenant 50 millilitres de milieu YP à 30 degrés Celsius avec agitation rotative pendant 48 heures. Ensuite, versez la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene de 500 millilitres.

Récoltez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes À 3000 Gs à température ambiante, décantez le surnageant et remettez en suspension les cellules granulées dans 250 millilitres d’eau distillée, centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante. Répétez cette opération. Étape : remettre en suspension les cellules granulées dans 250 millilitres d’eau distillée et centrifuger pendant cinq minutes.

À 3000 G à température ambiante, pesez la pastille de cellule humide résultante, puis remettez en suspension les cellules granulées dans un tampon DTT transféré la suspension de cellule dans une fiole de 250 millilitres. Faites pivoter le ballon à 70 tr/min à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après les 20 minutes, récoltez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes À 3000 Gs à température ambiante, suspendez à nouveau les cellules granulées dans un tampon Xs sans Xs et centrifugez-les pendant cinq minutes.

À 3000 Gs à température ambiante, réanimer les cellules granulées en suspension dans le tampon Zy sans Xs et transférer à nouveau la suspension cellulaire dans une fiole en verre. Ajoutez la poudre zy liase 100 T à la suspension cellulaire et tournez à 70 tr/min dans un agitateur à 30 degrés Celsius Pendant 30 minutes, le Zy liase 100 T digérera les parois cellulaires pour former des plaques Sphero. Toutes les étapes ultérieures à la digestion X précédemment indiquée doivent être effectuées à quatre degrés Celsius ou sur de la glace.

Les suspensions de splats doivent être manipulées doucement à l’aide de pipettes à pointes coupées pour éviter de casser les organites. Une fois la digestion XMO de 30 minutes terminée, transférez les plaques Sphero dans des tubes à centrifuger en plastique de 50 millilitres centrifuger pendant huit minutes à 2200 G à quatre degrés Celsius et suspendre les plaques de S granulées dans une centrifugeuse tampon d’homogénéisation glacée. Le S éclabousse pendant huit minutes à 2200 G à quatre degrés Celsius.

Resus suspend le sphero plast granulé dans la glace. Tampon d’homogénéisation à froid et cellules de transfert vers un homogénéisateur en verre pré-refroidi. À l’aide d’un pilon étanche, homogénéisez les cellules en effectuant 15 coups de pilon.

Ajoutez un volume égal de tampon d’homogénéisation glacé aux éclaboussures en S homogénéisées et transférez-les dans des tubes à centrifuger en plastique de 50 millilitres. Centrifugez les éclaboussures homogénéisées pendant cinq minutes à 1500 G à quatre degrés Celsius pour obtenir des granules, des cellules intactes, des noyaux et de gros débris. Versez le surnageant obtenu dans de nouveaux tubes et centrifugez pendant cinq minutes.

À 3000 Gs à quatre degrés Celsius. Après cette centrifugeuse, le surnageant résultant pendant 15 minutes à 12 000 G à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans de la glace. Centrifugeuse tampon d’homogénéisation à froid.

Le granulé a été remis en suspension pendant cinq minutes à 3000 G à quatre degrés Celsius. Enfin, centrifugez le surnageant obtenu pendant 15 minutes. À 12 000 G, à quatre degrés Celsius, décanter le surnageant et remettre le granulé en suspension dans trois millilitres de froid.

Tampon SEM. Cette suspension est la fraction mitochondriale brute. Bien qu’il soit enrichi en mitochondries, il contient également d’autres organites tels que le réticulum endoplasmique ou les microsomes GOGI et VA pour obtenir des mitochondries pures.

La suspension sera soumise à un fractionnement supplémentaire comme décrit dans la section suivante. Pour commencer le fractionnement de la suspension mitochondriale brute afin d’obtenir des mitochondries pures, placez 1,5 millilitre de glace froide, 60 % poids par volume. Du saccharose dans un tampon em dans un tube à centrifuger Beckman UltraClear.

Ensuite, superposez doucement les 60 % de saccharose avec quatre millilitres de 32 % de saccharose, 1,5 millilitres de 23 % de saccharose et 1,5 millilitres de 15 % de saccharose, tout le poids par volume en em. Le tampon place trois millilitres de la fraction mitochondriale brute dans le tampon MEB au-dessus des 15 % de poids par volume. Centrifugeuse à saccharose dans un rotor à godets oscillants Beckman SW 41 TI pendant une heure à 134 000 G ou 33 000 tr/min à quatre degrés Celsius.

Après centrifugation, les mitochondries intactes formeront une bande brune à l’interface 60 % à 32 % de saccharose. Retirez délicatement le saccharose jusqu’à ce qu’il atteigne la bande mitochondriale à l’aide d’une pipette avec une pointe coupée, retirez la bande mitochondriale et placez-la dans un tube à centrifuger Beckman. Pour un rotor MLS five, remplissez le tube avec une pastille tampon SEM, les mitochondries pures par centrifugation dans un rotor MLS five à 10 000 GS ou 31 000 RPM pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius décantez le surnageant.

Ces mitochondries pures peuvent maintenant être utilisées pour l’analyse des fonctions mitochondriales, du protéome mitochondrial, des lipides et de l’ADN mitochondrial. La fraction mitochondriale brute dans les voies de gauche et les mitochondries purifiées par centrifugation dans un gradient de densité de saccharose dans les voies de droite ont été soumises à un transfert de données et d’immunotransfert avec des anticorps dirigés contre des marqueurs protéiques de divers organites. La présence de mitochondries dans les deux préparations a été confirmée par l’immunoréactivité PO un P et COX un p L’immunotransfert a indiqué la présence de DP M1 P, FO 13 p et VPS 10 P, représentant respectivement les protéines réticulum endoplasmique, ulaire et GOGI dans la fraction mitochondriale brute.

En revanche, ces protéines marqueurs n’ont pas été détectées dans les mitochondries purifiées, confirmant que le protocole a produit des mitochondries exemptes de contamination par d’autres organites. Nous venons donc de vous montrer comment isoler les mitochondries de la levure sace visier. N’oubliez pas, lorsque vous exécutez cette expérience, de ne pas laisser les cellules incuber dans zy lies 100 T pendant plus d’une demi-heure, car vous risquez de dégrader vos protéines membranaires ou vos protéines d’organites qui pourraient être présentes dans les cellules.

Cela pourrait être dû à des protéases présentes dans le réactif. De plus, lorsque vous êtes sur le point d’isoler les mitochondries et le gradient de saccharose, vous pouvez congeler ces mitochondries à moins 20 degrés avant de le faire, puis les décongeler avant d’être prêt à effectuer l’étape de centrifugation. Donc c’est tout.

Bonne chance dans vos expériences.