Name: Purification des mitochondries de cellules de levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Apprenez à purifier les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae par homogénéisation et centrifugation sur gradient de saccharose. Cette méthode rapide assure une isolation à haut rendement sans contamination par d'autres organites.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des IRSC et le CRSNG du Canada. VIT est une nouvelle chercheuse des IRSC et président de Concordia recherche universitaire en génomique, biologie cellulaire et le vieillissement.

Matériel et méthodes Les souches de levures et de conditions de croissance La souche de type sauvage BY4742 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) a été cultivé en milieu riche YEPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, glucose 2%). Les cellules ont été cultivées à 30 ° C avec rotation agitation à 200 rpm dans des erlenmeyers à un &quot;flacon de volume / moyen volume&quot; ratio de 5:1. Isolement de la fraction mitochondriale brut <ol><li> Cultivez 1 L de la culture souche sauvage BY4742 pendant 48 h. </li><li> Verser la culture dans 500 ml tubes à centrifuger Nalgene. Équilibrer la charge et les cellules de récolte par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre les cellules granulées dans 250 ml d&#39;dH2O. Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre les cellules granulées dans 250 ml d&#39;dH2O. Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Déterminer le poids humide de culot cellulaire. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de la TNT [2 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à tubes de 50 ml en plastique Falcon. </li><li> Tournez les tubes à 70 rpm dans un shaker pendant 20 min à 30 ° C. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de Zymolyase sans Zymolyase [7 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de Zymolyase sans Zymolyase [7 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Transfert suspension cellulaire dans un flacon en verre. </li><li> Ajouter la poudre de Zymolyase-100T [1 mg de Zymolyase-100T / g (poids humide) de cellules] à la suspension cellulaire. </li><li> Tournez la fiole avec la suspension cellulaire à 70 rpm dans un shaker pendant 30 min à 30 ° C. </li><li> Sphéroplastes Transfert formé en raison de la digestion de la paroi cellulaire avec Zymolyase-100T à 50 ml tubes à centrifuger en plastique. </li><li> Pellet sphéroplastes par centrifugation pendant 8 min à 2200 xg à 4 ° C. </li></ol> ** Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées à 4 ° C ou sur glace. Suspensions de sphéroplastes doit être manipulé avec soin en utilisant des pipettes avec des conseils coupé pour éviter de casser les organelles .** <ol start="18"><li> Resuspendre sphéroplastes granulés de tampon d&#39;homogénéisation glacée [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Pellet sphéroplastes par centrifugation pendant 8 min à 2200 xg à 4 ° C. </li><li> Resuspendre sphéroplastes granulés de tampon d&#39;homogénéisation glacée [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Transfert des cellules à un pré-refroidis sur la glace de verre homogénéisateur. </li><li> En utilisant un pilon serré, homogénéiser les cellules en faisant 15 coups de pilon. </li><li> Ajouter 1 volume de tampon d&#39;homogénéisation glacée. </li><li> Transfert sphéroplastes homogénéisé à 50 ml tubes à centrifuger en plastique. </li><li> Pellet cellules ininterrompue, les noyaux, et les gros débris par centrifugation pendant 5 min à 1500 xg à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le surnageant résultant pendant 5 min à 3000 xg à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le surnageant résultant pendant 15 min à 12000 xg à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans glacée tampon d&#39;homogénéisation [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules]. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à 4 ° C. </li><li> Centrifuger le surnageant résultant pendant 15 min à 12000 xg à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de tampon glacé SEM. </li></ol> ** Bien que cette suspension est enrichi dans les mitochondries, il contient également d&#39;autres organites tels que le réticulum endoplasmique (microsomes), Golgi, et de vacuoles. Pour obtenir des mitochondries pur, cette fraction grossière mitochondriale peut être soumis à un fractionnement supplémentaire, comme décrit ci-dessous .** Purification des mitochondries dépourvue de contamination par d&#39;autres organites <ol><li> Placer 1,5 ml de glace-froid 60% (p / v) de saccharose dans EM tampon dans un tube à centrifuger Beckman Ultra-Clear. </li><li> Superposition de 60% (p / v) de saccharose avec 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de saccharose à 15% (tous les tampons p / v dans EM). </li><li> Placer 3 ml de la fraction grossière des mitochondries dans les SEM de tampon au-dessus de 15% (p / v) de saccharose. </li><li> Centrifugeuse Beckman SW41 dans un Ti-balancer Rotor pendant 1 h à 134 000 xg (33 000 rpm) à 4 ° C. </li><li> La forme intacte mitochondries une bande brune au 60% / interface de saccharose 32%. </li><li> Retirer délicatement le saccharose jusqu&#39;à atteindre la bande mitochondriale. </li><li> Retirez la bande mitochondriale aide d&#39;une pipette avec une pointe de coupe et le placer dans un tube de centrifugeuse Beckman pour un MLS-5 du rotor. </li><li> Remplir le tube avec un tampon de SEM. </li><li> Pellet les mitochondries pur par centrifugation dans un rotor MLS-5 pendant 30 min à 10000 xg (31 000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Décanter le surnageant à l&#39;aided&#39;une pipette. </li><li> Utilisez les mitochondries purs pour l&#39;analyse des fonctions mitochondriales, mitochondriale protéome et lipidome, et l&#39;ADN mitochondrial. </li></ol> Réactifs <ol><li> DTT [100 mm Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM de dithiothréitol] (pour 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml de 1 M Tris/H2SO4 tampon (pH 9,4) </li><li> 150 pi de 1 M de DTT </li><li> Volume à 15 ml </li></ul></li><li> Buffer Zymolyase [20 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 1,2 M de sorbitol] (pour 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml de 1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,4) </li><li> 60 ml de 2 M de sorbitol </li><li> Volume à 100 ml </li></ul></li><li> Tampon d&#39;homogénéisation [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M de sorbitol, EDTA 1 mM, 0,2% (p / v) de BSA] (pour 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4) </li><li> 75 ml de 2 M de sorbitol </li><li> 500 ul d&#39;EDTA 500 mM </li><li> 0,5 g de BSA </li><li> Volume de 250 ml </li></ul></li><li> SEM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de saccharose, 1 mM EDTA] (pour 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de MOPS M 1 / KOH (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml de 2 M de saccharose </li><li> 500 ul d&#39;EDTA 500 mM </li><li> Volume de 250 ml </li></ul></li><li> EM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), EDTA 1 mM] (pour 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de MOPS M 1 / KOH (pH 7,2) </li><li> 500 ul d&#39;EDTA 500 mM </li><li> Volume de 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Cette méthode permet l&#39;isolement à haut rendement des mitochondries pur à partir de cellules de levure. Les mitochondries purifiées par cette méthode sont essentiellement libres de contamination par d&#39;autres organites et conservent leur intégrité structurale et fonctionnelle après leur purification. Les rendements méthode décrite mitochondries qui sont adaptés à la cellule sans reconstitution des processus essentiels mitochondriale. Ces mitochondries très purs peuvent aussi être utilisées pour l&#39;analyse de l...

purification des mitochondries de cellules de levure

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Les mitochondries sont le site principal de production d&#39;ATP au cours du métabolisme aérobie dans eucaryotes non photosynthétiques cellules<sup&gt; 1</sup&gt;. Ces organites complexes jouent également un rôle essentiel dans la mort cellulaire par apoptose<sup&gt; 2</sup&gt; La survie cellulaire,<sup&gt; 3</sup&gt;, Le développement des mammifères<sup&gt; 4</sup&gt;, Le développement neuronal et la fonction<sup&gt; 4</sup&gt;, Signalisation intracellulaire<sup&gt; 5</sup&gt;, La réglementation et la longévité<sup&gt; 6</sup&gt;. Notre compréhension de ces processus biologiques complexes contrôlés par les mitochondries s&#39;appuie sur des méthodes robustes pour évaluer leur morphologie, leurs protéines et la composition lipidique, de l&#39;intégrité de leur ADN, et leurs nombreuses fonctions vitales. La levure bourgeonnante<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Un eucaryote génétiquement et biochimiquement manipulable avec des unicellulaires génome annoté et bien définies protéome, est un précieux modèle pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans des fonctions biologiques essentielles des mitochondries. Pour ces types d&#39;études, il est crucial d&#39;avoir des mitochondries très pure. Nous présentons ici une description détaillée d&#39;une méthode rapide et efficace pour la purification des mitochondries de levure. Cette méthode permet l&#39;isolement des mitochondries très pures qui sont essentiellement exempt de contamination par d&#39;autres organites et conservent leur intégrité structurale et fonctionnelle après leur purification. Les mitochondries purifiées par cette méthode sont adaptés à la cellule sans reconstitution des processus essentiels mitochondriale et peut être utilisé pour l&#39;analyse de la structure et les fonctions mitochondriales, mitochondriale protéome et lipidome, et l&#39;ADN mitochondrial.

Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour la purification des mitochondries de la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Cette méthode permet l&#39;isolement à haut rendement des mitochondries pures qui sont essentiellement exempt de contamination par d&#39;autres organites et conservent leur intégrité structurale et fonctionnelle après leur purification.

Purification des mitochondries de cellules de levure

Les mitochondries sont le site principal de production d'ATP lors du métabolisme aérobie dans les cellules eucaryotes non photosynthétiques1. Ces organites complexes jouent également...

Ce protocole commence par la conversion des cellules de levure en sphéroplastes par la digestion de la paroi cellulaire à l’aide de simulase ; les sphéroplastes sont ensuite homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur en verre et téflon. L’homogénat obtenu est soumis deux fois à une centrifugation afin de former un culot contenant les cellules non rompues, les noyaux et les gros débris. Ensuite, le surnageant obtenu est centrifugé pendant 15 minutes à 12 000 G pour faire sédimenter les mitochondries.Enfin, la fraction mitochondriale brute, qui contient encore d'autres organites, est soumise à une centrifugation de 60 minutes à 134 000 g dans un gradient de densité de saccharose ; les mitochondries pures, dépourvues de contamination par d'autres organites, sont récupérées à l'interface entre les solutions de saccharose à 60 % poids/volume et à 32 % poids/volume. Bonjour, je suis le Dr Christopher Greg du laboratoire du Dr Vladimir Tko, du département de biologie de l'Université Concordia. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment isoler des mitochondries à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae.Nous faisons cela pour étudier la dynamique et les modifications liées à l'âge qui se produisent dans les mitochondries. Au fur et à mesure que les cellules vieillissent, nous allons examiner les changements dans le protéome, le lipidome et l'ADN des mitochondries. Commençons donc.Commencez ce protocole en cultivant la souche de levure dans dix flacons de deux cent cinquante millilitres, chacun contenant 50 millilitres de milieu YP, à 30 degrés Celsius avec agitation rotative pendant 48 heures. Ensuite, versez la culture dans des tubes à centrifuger Nalgene de 500 millilitres.Récupérez les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante, décantez le surnageant et resuspendez les cellules en culot dans 250 millilitres d'eau distillée. Centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante. Répétez cette étape : resuspendez les cellules en culot dans 250 millilitres d'eau distillée et centrifugez pendant cinq minutes.À 3000 Gs à température ambiante, peser le culot cellulaire humide obtenu, puis resuspendre les cellules en culot dans un tampon DTT et transférer la suspension cellulaire dans un flacon de 250 millilitres. Faire tourner le flacon à 70 tr/min à 30 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après les 20 minutes, récolter les cellules par centrifugation pendant cinq minutes à 3000 Gs à température ambiante, puis resuspendre les cellules en culot dans un tampon Xs sans Xs et centrifuger pendant cinq minutes.À 3000 Gs et à température ambiante, resuspendre les cellules en culot dans du tampon Zy sans Xs, puis transférer la suspension cellulaire dans un flacon en verre. Ajouter la poudre de zy lyase 100 T à la suspension cellulaire et agiter par rotation à 70 tr/min dans un agitateur à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes ; la zy lyase 100 T digérera les parois cellulaires pour former des sphéroplastes. Toutes les étapes suivant la digestion X précédemment décrite doivent être effectuées à quatre degrés Celsius ou sur de la glace.Les suspensions de splats doivent être manipulées délicatement à l’aide de pipettes à embouts coupés afin d’éviter de rompre les organites. Une fois la digestion XMO de 30 minutes terminée, transférez les splats Sphero dans des tubes à centrifuger en plastique de 50 millilitres, centrifugez pendant huit minutes à 2200 G et à quatre degrés Celsius, puis resuspendez le culot de splats S dans un tampon d’homogénéisation glacé. Centrifugez à nouveau les splats S pendant huit minutes à 2200 G et à quatre degrés Celsius.Resuspendre le culot de sphéroplastes dans de la glace. Ajouter du tampon d'homogénéisation froid et transférer les cellules dans un homogénéisateur en verre prérefroidi. À l’aide d’un pilon ajusté, homogénéiser les cellules en effectuant 15 mouvements de va-et-vient du pilon.Ajoutez un volume égal de tampon d'homogénéisation glacé aux éclaboussures homogénéisées de S, puis transférez-les dans des tubes à centrifuger en plastique de 50 millilitres. Centrifugez les éclaboussures homogénéisées pendant cinq minutes à 1500 G à quatre degrés Celsius afin de former un culot contenant les cellules non rompues, les noyaux et les gros débris. Versez le surnageant obtenu dans de nouveaux tubes et centrifugez pendant cinq minutes.À 3000 ×g à quatre degrés Celsius. Après cette centrifugation, centrifuger le surnageant obtenu pendant 15 minutes à 12 000 ×g à quatre degrés Celsius, décantez le surnageant et resuspendez le culot dans du tampon d'homogénéisation glacé.Resuspendre le culot pendant cinq minutes à 3000 G à quatre degrés Celsius. Finalement, centrifuger le surnageant obtenu pendant 15 minutes à 12 000 G à quatre degrés Celsius, décanté le surnageant et resuspendre le culot dans trois millilitres de froid glacial. tampon SEM. Cette suspension correspond à la fraction mitochondriale brute. Bien qu'elle soit enrichie en mitochondries, elle contient également d'autres organites tels que le réticulum endoplasmique ou les microsomes GOGI et VAs afin d'obtenir des mitochondries pures.La suspension sera soumise à une fractionnement supplémentaire comme décrit dans la section suivante. Pour commencer le fractionnement de la suspension mitochondriale brute afin d'obtenir des mitochondries pures, placer 1,5 millilitre de saccharose à 60 % poids par volume, froid sur glace, dans du tampon em dans un tube de centrifugeuse Beckman UltraClear.Ensuite, recouvrir délicatement le saccharose à 60 % avec quatre millilitres de saccharose à 32 %, 1,5 millilitre de saccharose à 23 % et 1,5 millilitre de saccharose à 15 %, tous exprimés en poids par volume dans le tampon SEM. Placer trois millilitres de la fraction mitochondriale brute dans le tampon SEM au-dessus du saccharose à 15 % poids par volume. Effectuer la centrifugation dans un rotor Beckman SW 41 TI à godets pivotants pendant une heure à 134 000 g ou 33 000 tr/min à 4 °C.Après centrifugation, les mitochondries intactes formeront une bande brune à l'interface entre le saccharose à 60 % et celui à 32 %. Retirez soigneusement le saccharose jusqu'à atteindre la bande mitochondriale à l'aide d'une pipette à embout coupé, prélèvez la bande mitochondriale et placez-la dans un tube à centrifuger Beckman. Pour un rotor MLS five, remplissez le tube avec le tampon SEM, puis récupérez les mitochondries pures par centrifugation dans un rotor MLS five à 10 000 ×g ou 31 000 tr/min pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis décantez le surnageant.Ces mitochondries pures peuvent désormais être utilisées pour l'analyse des fonctions mitochondriales, du protéome mitochondrial et de l'ADN mitochondrial. La fraction mitochondriale brute des voies de gauche et les mitochondries purifiées par centrifugation sur gradient de densité de saccharose des voies de droite ont été soumises à une électrophorèse SDS-PAGE et à un immunoblotting à l'aide d'anticorps dirigés contre des marqueurs protéiques de divers organites. La présence de mitochondries dans les deux préparations a été confirmée par l'immunoréactivité de PO1P et de COX1P. L'immunoblotting a révélé la présence de DPM1P, de FO13P et de VPS10P, représentant respectivement les protéines du réticulum endoplasmique, des endosomes et de l'appareil de Golgi, dans la fraction mitochondriale brute.En revanche, ces protéines marqueurs n'ont pas été détectées dans les mitochondries purifiées, ce qui confirme que le protocole a permis d'obtenir des mitochondries exemptes de contamination par d'autres organites. Nous venons donc de vous montrer comment isoler des mitochondries de la levure sace visier. N'oubliez pas, lorsque vous réalisez cette expérience, de ne pas laisser les cellules s'incuber dans le zy lys 100 T plus de trente minutes, car vous risqueriez de dégrader vos protéines membranaires ou les protéines d'organites qui pourraient être présentes dans les cellules.Cela pourrait être dû aux protéases présentes dans le réactif. De plus, lorsque vous vous apprêtez à isoler les mitochondries et le gradient de saccharose, vous pouvez congeler ces mitochondries à moins 20 degrés avant cette étape, puis les décongeler avant de procéder réellement à la centrifugation. Voilà tout.Bonne chance avec vos expériences.

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La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l'aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.

Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

De nombreux ARNm codant pour des protéines mitochondriales sont associés à la membrane externe de la mitochondrie. Nous décrivons un procédé de fractionnement subcellulaire visant à l'isolement des mitochondries de levure avec ses ARNm et des ribosomes associés. Ce protocole peut être appliqué à des cellules cultivées dans des conditions diverses dans le but de révéler les mécanismes de localisation des ARNm et traduction localisée près des mitochondries.

Isolement des ARNm associés aux mitochondries de levure pour étudier les mécanismes de traduction localisée

Nous présentons ici un protocole visant à exprimer, solubiliser et purifier plusieurs transporteurs de borate eucaryotes avec une homologie avec la famille de transporteur SLC4 à l’aide de la levure. Nous décrivons également un test de réticulation chimique afin d’évaluer les protéines purifiées homomères multimériques l’Assemblée. Ces protocoles peuvent être adaptées pour d’autres protéines membranaires difficiles.

Expression, solubilisation et Purification des transporteurs de Borate eucaryotes

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Malgré les progrès récents, de nombreuses protéines mitochondriales de levure restent encore avec leurs fonctions complètement inconnues. Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour déterminer la localisation de la soumissionochondriale des protéines, ce qui a été fondamental pour l’élucidation de leurs fonctions moléculaires.

Évaluation de la localisation des protéines submitochondriales dans la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae

Nous présentons un protocole en deux étapes pour l’isolement de mitochondries de haute qualité qui est compatible avec la découverte et la quantification des protéines à l’échelle du protéome. Notre protocole ne nécessite pas de génie génétique et convient donc à l’étude des mitochondries de toutes les cellules et tissus primaires.

Isolement sans marquage en deux étapes des mitochondries pour améliorer la découverte et la quantification des protéines

Les sites de contact mitochondrial sont des complexes protéiques qui interagissent avec les protéines membranaires internes et externes mitochondriales. Ces sites sont essentiels pour la communication entre les membranes mitochondriales et, par conséquent, entre le cytosol et la matrice mitochondriale. Nous décrivons ici une méthode permettant d’identifier les candidats éligibles à cette classe spécifique de protéines.

Une méthode améliorée pour isoler les sites de contact mitochondrial

Ce travail explique comment transformer les mitochondries de levure à l’aide d’une méthode biolistique. Nous montrons également comment sélectionner et purifier les transformants et comment introduire la mutation souhaitée dans la position cible dans le génome mitochondrial.

Transformation mitochondriale chez Baker

La respiration mitochondriale dans les cellules entières de levure est un indicateur précieux de la bioénergétique cellulaire. Nous présentons ici un protocole pour quantifier ce phénotype applicable à différentes espèces de levures.

Quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules entières de levure

La levure à fission Schizosaccharomyces pombe apparaît comme un modèle attrayant pour l’étude des mitochondries. Nous décrivons ici un protocole d’analyse de l’abondance et de l’assemblage des complexes respiratoires mitochondriaux chez S. pombe. Cela permet de caractériser les nouvelles fonctions des gènes conservés dans la chaîne respiratoire mitochondriale.

Analyse de l’expression et de l’assemblage des complexes des protéines de la chaîne respiratoire mitochondriale chez la levure de fission Schizosaccharomyces pombe

Apprenez à purifier les mitochondries de Saccharomyces cerevisiae par homogénéisation et centrifugation sur gradient de saccharose. Cette méthode rapide assure une isolation à haut rendement sans contamination par d'autres organites.

Purification des mitochondries de cellules de levure

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