Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Cette procédure commence par aligner des embryons de zebrafish monocellulaires dans une plaque de microinjection. Micro-injecter une solution de dextrine fluorescente dans le vitellus. Juste sous la cellule, les embryons injectés sont vos donneurs pour la greffe.

Coater les embryons donneurs et hôtes et les faire croître jusqu'au stade bouclier ; charger deux embryons injectés avec de la dextrine revêtue de DEC côte à côte dans un puits d'une plaque de greffe. Répéter sous chaque paire de donneurs. Ajouter un embryon hôte par puits afin de diriger les cellules greffées vers le diencéphale du cerveau antérieur ; transplanter les cellules depuis et vers la ligne médiane.

À mi-chemin entre le pôle animal et le bouclier. Transplanter les cellules du gasa donneur dans le Gasa hôte. Cultiver jusqu'à 30 heures puis fixer.

Effectuez une immunochimie si nécessaire, montez et imagez. Sinon, montez l'hôte vivant et réalisez un enregistrement en lapso-temporel. Bonjour, je m'appelle Elizabeth De Shane, du laboratoire du Dr Michael ESI, du département des sciences biologiques du Smith College à Northampton, dans le Massachusetts.

Et je suis le chercheur principal du laboratoire, le Dr Michael Besi. Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment créer des embryons chimériques en réalisant des transplantations cellulaires à l'étape de la gastrulation en utilisant le système modèle du poisson zèbre. Nous utilisons cette procédure dans mon laboratoire pour étudier la fonction de gènes spécifiques dans le développement de la commissure antérieure ainsi que le processus des interactions axone-gliale durant la formation de la commissure.

Commençons. Pour commencer, préparez des moules en rigoles pour les plaques de microinjection en cassant soigneusement en deux trois capillaires non filamenteux d'un millimètre de diamètre et de quatre pouces de longueur. À l'aide de colle super glue, fixez deux des moitiés de capillaires côte à côte sur une surface plane.

Le troisième capillaire, placé au-dessus de ces deux-là, s'emboîte dans la rainure pour former une pyramide. À l'aide des trois capillaires, laissez sécher le moule. Vous devez fabriquer environ trois à cinq moules pour chaque plaque d'injection.

Ensuite, préparez les plaques d'injection en versant 20 à 25 millilitres d'agarose fondue à 1,5 % dans du milieu embryonnaire dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Placez immédiatement trois à cinq moules en rigoles préparés au fond de la plaque, en veillant à ce que le côté plat du moule touche le fond de la boîte de Pétri et soit entièrement recouvert d'agarose. Une fois l'agarose solidifiée, retirez les moules en rigoles en découpant un grand carré d'agarose qui les contient.

Retirez délicatement l'agar sur la périphérie du carré découpé et jetez-le. Retournez le morceau carré d'agar et, à l'aide de pinces fines, retirez complètement les moules en forme de rigole. Versez de l'agar fondu autour du carré dans la boîte de Pétri afin de maintenir fermement en place les nouveaux puits ainsi formés.

Laisser prendre. Les boîtes peuvent être scellées avec du paraform et conservées pendant plusieurs semaines à quatre degrés Celsius. Elles doivent être jetées s'il y a des signes de croissance dans l'agar.

Enfin, pour préparer les aiguilles d'injection, utilisez un tireur de capillaires pour micro-pipettes afin de fabriquer les aiguilles à partir de capillaires en verre d'un millimètre de diamètre, de quatre pouces de long, munis de filaments internes, une fois la plaque d'injection et les aiguilles préparées. Examinons maintenant la collecte des embryons et la mise en place de l'appareil de microinjection. Les œufs fécondés sont collectés immédiatement après leur ponte et conservés dans une boîte de Pétri remplie de milieu pour embryons.

À l’aide d’une pipette en verre à embout large, expulser les embryons dans les puits d’une plaque d’injection maintenue à température ambiante et remplie de milieu pour embryons. Utiliser une pince fine émoussée pour insérer délicatement les embryons au fond des rigoles ; les embryons dont le chorion ou le vitellus ont été endommagés doivent être écartés.

Ensuite, chargez l'aiguille d'injection avec un à deux microlitres de solution de dextrine fluorescente Alexa 594 diluée. Laissez la dextrine s'écouler jusqu'à l'extrémité de l'aiguille d'injection par action capillaire. Fixez l'aiguille d'injection au porte-capillaire d'un micromanipulateur stéréotaxique et ajustez initialement la pression sur l'appareil d'injection microscopique.

40 à 50 PSI et une durée d'impulsion de 500 millisecondes. Utilisez une pince pour effleurer ou couper délicatement l'extrémité de l'aiguille d'injection afin de rompre le sceau. Idéalement, le diamètre doit être compris entre 0,05 et 0,15 millimètre.

Pour étalonner l'aiguille, utilisez un microscope stéréo et expulsez la dextrine sur un micromètre recouvert d'huile minérale. Modifiez la taille du bolus en ajustant la durée de la pression d'air de l'impulsion et la taille de l'aiguille. Astuce. Une taille de bolus équivalente à un volume de 0,8 à un nanolitre doit être maintenue tout au long des injections.

Nous pouvons maintenant commencer la microinjection de dextrine en utilisant un grossissement d’environ 3,2 x sur un microscope stéréo. Commencez les injections dans les embryons à partir d'une extrémité de la rigole en perçant délicatement le chorion et la membrane cellulaire des embryons pour pénétrer dans le vitellus. Injectez la solution de dextrine juste sous la cellule.

Veillez à retirer l'aiguille d'injection avec le même mouvement régulier utilisé pour pénétrer dans l'embryon. Déplacez la boîte de Pétri afin de positionner l'embryon suivant en ligne et continuez les injections le long de la longueur de la rigole. Vérifiez périodiquement la pression et la taille du bolus.

Utilisez maintenant des pinces pour pousser délicatement les embryons hors des sillons. Transférez-les dans une boîte de Pétri remplie de milieu pour embryons contenant un antibiotique. Incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius et surveillez-les afin de détecter les œufs non fécondés ou les décès.

Les embryons sont désormais prêts pour de futures transplantations. Avant l'achèvement d'un poli lors de la ration de gaz, des parties du vitellus restent exposées. Le vitellus est extrêmement fragile et adhère facilement, se déchirant aisément sur le plastique de la boîte de Pétri.

Par conséquent, les embryons doivent être déposés sur des boîtes préalablement enrobées un jour avant la réalisation des greffes. Préparez ces boîtes de décoration en versant cinq à dix millilitres d'aros fondu dans une boîte de Pétri de 100 millimètres. Une fine couche d'aros, d'environ deux à trois millimètres d'épaisseur, suffit pour amortir les embryons durant la décoration.

Laissez refroidir les boîtes. Ensuite, préparez des boîtes de transplantation séparées en versant 30 millilitres de solution d'aros à 1,5 % dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et insérez un moule à puits de transplantation. Le moule doit contenir 104 encoches triangulaires, chacune composée de trois côtés à 90 degrés et d'un côté incliné à 45 degrés.

Les puits sont conçus pour accueillir deux embryons côte à côte. Veillez à ne pas emprisonner de bulles d'air sous le moule et laissez durcir l'agarose. Le retrait du moule révèle une zone en creux contenant les puits carrés dotés d'un bord en pente.

Pour préparer les embryons donneurs et hôtes en vue d'une transplantation, il est nécessaire de surveiller leur développement afin de maintenir des appariements proches en âge. À cette fin, les embryons peuvent être élevés à des températures variables comprises entre 23 et 31 degrés Celsius afin de ralentir ou d'accélérer leur développement. Les embryons donneurs et hôtes doivent être manipulés manuellement et déposés sur une plaque recouverte d’un revêtement une heure avant l'âge souhaité.

Dans le cas de greffes au stade gastrique, cette étape devrait être réalisée cinq heures après la fécondation (HPF) au plus tard, avant le stade du bouclier à 5,5 HPF. Utilisez une pipette en verre pour charger les embryons hôtes et donneurs dans une plaque de greffe remplie de milieu embryonnaire antibiotique. La première rangée est remplie d'embryons donneurs, avec deux embryons par puits, tandis que les deux rangées suivantes contiennent un unique embryon hôte par puits.

Pour les greffes, nous utilisons un microscope stéréo fluorescent Zeiss luer doté d'un zoom et d'une manipulation de la mise au point entièrement automatisés, commandés par un joystick. Bien que ce microscope automatisé ne soit pas indispensable, il augmente considérablement la facilité et l'efficacité de ces greffes chirurgicales délicates, en particulier lorsque l'on souhaite réaliser un grand nombre de greffes. Pour installer l'appareil de greffe, placez le tramway pneumatique einor au milieu de son échelle, reliez le tube du tramway pneumatique au porte-capillaire et fixez fermement le porte-capillaire au micromanipulateur automatisé einor. Une fois les embryons et l'appareil de greffe préparés, nous pouvons désormais passer aux greffes cellulaires au stade gastrula.

La compétence la plus essentielle pour réaliser des greffes cellulaires à l'étape de gastrulation est la capacité à reconnaître l'anatomie cellulaire du blastoderme dorsal APO, également appelé le bouclier chez le poisson-zèbre. Nous présentons ici un film montrant la gastrula sous différents angles et mettant en évidence la localisation du bouclier dans cette vue latérale. Le bouclier ou le côté dorsal se trouve à droite, délimité par le contour rouge, afin de cibler les cellules destinées à être greffées dans le cerveau antérieur et à la ligne médiane.

Exactement à mi-chemin entre le pôle animal et le bouclier, nous allons commencer par faire pivoter l'embryon d'abord vers vous pour visualiser le pôle animal, en mettant en évidence le bouclier et le site de greffe en cours de route. Ensuite, l'embryon tourne sur son axe afin de positionner le bouclier en bas. Le gastroïde effectue ensuite une rotation vers le haut, vous offrant ainsi une vue dorsale directe.

L'embryon est maintenant ramené progressivement en vue latérale à six hpf. À l’aide du micromanipulateur, effleurer délicatement l’embryon avec l’extrémité de la capillarité pour le positionner de manière adéquate en vue d’une extraction cellulaire, de sorte que sa ligne médiane et son bouclier soient visibles et orientés face à l’extrémité de la capillarité. Les embryons donneurs sont facilement vérifiés en passant de l’éclairage en champ clair à l’illumination fluorescente. Ici, les cellules du gastro-derme émettent une fluorescence rouge. Aspirer une petite quantité de milieu embryonnaire dans la capillarité afin d’éliminer tout risque de contact des cellules avec l’interface air-eau, ce qui pourrait les endommager.

Percez délicatement l'ectoderme de l'embryon donneur au niveau de la ligne médiane, exactement entre le pôle animal et le bouclier. Dans le gasa, il n'y avait qu'environ 20 micromètres de cellules entre l'ectoderme superficiel et le vitellus sous-jacent. Veillez donc à ne pas transpercer le vitellus, car cela entraîne souvent la mort en quelques heures.

À l’aide du dispositif à air, aspirez lentement les cellules dans le capillaire. Veillez toujours à maintenir la ligne d’eau visible en agitant légèrement la pointe. Ce mouvement à l’intérieur du donneur aidera à relâcher les contacts entre cellules.

Environ 10 à 50 cellules doivent être extraites de l'embryon donneur. Ensuite, retirez la capillarité de l'embryon donneur. Orientez de manière similaire l'hôte, percez-le et expulsez les cellules à l'emplacement exact. Chez un embryon hôte, le passage de l'éclairage en champ clair à l'illumination fluorescente révèle le déplacement des cellules marquées à la dextrine dans l'aiguille capillaire vers l'embryon hôte.

Enfin, après la transplantation, retirez les embryons donneurs et hôtes des puits. Séparez-les et placez-les délicatement sur une boîte de Pétri revêtue d'A, remplie d'embryon antibiotique. Incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius une fois les transplantations terminées.

Commençons par la visualisation et l'imagerie. Les embryons sont d'abord fixés au stade approprié pour l'imagerie, en utilisant un conservateur validé pour l'immunochimie. Dans notre cas, la fixation s'effectue avec du formaldéhyde 4 % pendant deux heures à température ambiante ou toute une nuit à quatre degrés Celsius sous agitation rotative.

Procédez ensuite au rinçage des embryons fixés deux fois, puis lavez-les de trois à cinq minutes dans du PBS 0,1 M. Effectuez une immunomarquage approprié si nécessaire.

Placer les embryons dans du glycérol à 75 %, les faire couler à température ambiante et les conserver à quatre degrés Celsius. Préparer une lame en montant deux embryons en créant deux contours carrés en gelée de pétrole sur une lame, correspondant au diamètre intérieur d’un carré. Recouvrir chaque embryon d’une lamelle et effectuer toutes les dissections nécessaires pour obtenir une vue frontale du prosencéphale.

Disséquez le cerveau antérieur en coupant perpendiculairement à travers le mésencéphale. Placez ce tissu avec une quantité minimale de glycérine dans le pétrole. Orientez correctement le tissu dans la position appropriée et placez une lame couvre-objet sur l'échantillon.

Alternativement, pour les embryons vivants, montez-les dans une solution d'agar à 0,75 % sur une lame de verre. Avant que l'agar ne durcisse, utilisez une aiguille en tungstène pour manipuler l'embryon afin de l'orienter correctement pour l'acquisition d'images. Les hôtes fixes et vivants sont tous deux soumis à l'imagerie.

À l’aide du microscope confocal à balayage laser Leica SP cinq, des coupes ZS sont acquises et un traitement d’image en trois ou quatre dimensions est effectué à l’aide du logiciel Velocity afin de générer des embryons chimériques dans lesquels une partie de la population d’astroglies présente à l’intérieur de l’embryon diffère par génotype ou phénotype. Nous avons utilisé une approche multifactorielle combinant l’utilisation d’embryons transgéniques exprimant la GFP, qui marque spécifiquement les astroglies, avec une transplantation cellulaire à un stade gastrique précis afin de cibler spécifiquement nos clones vers le céphalon. Nous avons utilisé la carte de destin cellulaire gastrique du poisson zèbre pour extraire de manière sélective des cellules situées à la ligne médiane, à égale distance du pôle animal et du bouclier.

Ces cellules extraites ont ensuite été transplantées au même emplacement chez un hôte de type sauvage gasa, qui a ensuite été élevé jusqu'à 30 HPF et marqué immunologiquement pour tous les axones servant de repères de référence en anatomie du cerveau antérieur. Dans l'exemple présenté ici, l'imagerie confocale d'un embryon hôte révèle des cellules positives pour la GFP isolées réparties dans tout le céphalon et le céphalon. La morphologie complète de ces cellules positives pour la GFP peut être observée dans cet essai clonal, montrant que la majorité de ces cellules adoptent la morphologie caractéristique des cellules gliales radiaires, où le soma est situé adjacent à la zone ventriculaire et où un large pied terminal termine un prolongement radial à la surface péricentrale.

La reconstruction tridimensionnelle de ce Zack composé de ces tranches optiques recueillies montre clairement la position de ces cellules par rapport aux axones marqués. Une autre approche couramment utilisée pour visualiser les cellules transplantées consiste à injecter initialement par micro-injection un colorant fluorescent de lignage cellulaire dans le jaune d’un embryon sauvage ou transgénique GFP au stade d’une seule cellule. Dans cet exemple, nous avons injecté du dextran Alexa 594 dans des embryons de type sauvage.

Au stade uniloculaire, nous les avons laissés se développer jusqu'au stade bouclier gasa, puis réalisé quatre transplantations ciblant le cerveau comme mentionné ci-dessus. Toutefois, nous avons transplanté des hôtes gastrulaires transgéniques en réalisant un balayage laser de l'imagerie du céphalon dorsal. La microscopie confocale a révélé des agrégats fluorescents rouges de cellules donneuses parmi les noyaux positifs pour la GFP dans le prosencéphale.

Nous avons poursuivi l'analyse de cet hôte en collectant des Zacks toutes les trois minutes pendant deux heures à l'aide du microscope confocal à balayage laser. La reconstruction en quatre dimensions de ce laps de temps, réalisée à l'aide du logiciel de vélocimétrie fourni par IMP, révèle des mouvements cellulaires dynamiques des membranes des cellules en forme de bâtonnet et des noyaux positifs pour la GFP. Nous venons de vous montrer comment préparer tout l'appareillage et les réactifs nécessaires aux transplantations cellulaires chez les embryons de poisson zèbre.

Plus précisément, nous avons démontré la technique au stade gastrulaire. Toutefois, elle s'applique également aux greffes réalisées au stade de blastula. Lors de l'utilisation de cette procédure, il est important de corréler précisément l'emplacement final souhaité des cellules greffées avec l'emplacement correspondant sur la carte de destin embryonnaire de ces cellules au stade gastrulaire. Consultez l'étude détaillée du Dr. Scott Frazier datant de 1995, intitulée Fate Maps of the Zebrafish Embryo, pour obtenir des indications complémentaires.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.