Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Dans cette vidéo, nous démontrerons l'efficacité d'un protocole de coloration kumasi modifié pour la détection de plusieurs nanogrammes de protéine dans des gels de polyacrylamide. À l'aide de l'exemple de l'électrophorèse sur gel bidimensionnel avant la séparation en première dimension, les bandes à gradient de pH immobilisé sont réhydratées dans des conditions de tampon dénaturant.

Après le re gonflement nocturne des bandes, les échantillons protéiques sont appliqués par chargement dans une cupule anodique. Au cours du processus de focalisation, les protéines sont séparées selon leurs points isoélectriques. La séparation en seconde dimension est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE.

Le gel est ensuite transféré dans une boîte de coloration et les protéines sont détectées par coloration au bleu de Kumasi colloïdal. Bonjour, je suis Nadine de Bala du laboratoire de Sabina Meka au centre de recherche biomédicale de l'Université d'Olor. Aujourd'hui, je vais attirer votre attention sur une procédure peu connue selon les collègues de Kangan : le Cy Brilliant Blue est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines après des séparations électrophorétiques, mais on suppose souvent qu'il est moins adapté à la protéomique comparative.

Cependant, la coloration colloïdale présente des avantages supérieurs en termes de sensibilité, de coûts et de praticité. Nous utilisons le protocole de coloration K dans notre laboratoire pour presque toutes les applications basées sur des gels moyens, mais particulièrement en protéomique analytique afin de déterminer les variations d'expression des protéines myocardiques. Je vais démontrer l'utilisation de cette méthode pour détecter les protéines myocardiques dans la plage de pH alcalin des gels d'électrophorèse bidimensionnelle.

Commençons. Voici. La première dimension de l'électrophorèse en gel bidimensionnel est la focalisation isoélectrique ou IEF, et des bandes à gradient de pH immobilisé, ou bandes IPG, sont utilisées pour cette analyse.

Avant l'IEF, quatre bandes IPG sont réhydratées individuellement dans 125 microlitres de solution de réhydratation à l'aide du plateau de gonflement sec IM Mobilly pendant au moins 10 heures, période au terme de laquelle les bandes IPG sont réhydratées et prêtes à recevoir les échantillons protéiques. Des échantillons protéiques précipités par l'acide trichloroacétique provenant de quatre préparations cardiaques différentes sont dissous dans du tampon d'échantillonnage pour l'IEF à une concentration de 100 microgrammes de protéine par 100 microlitres. La solubilisation des échantillons protéiques nécessitera au moins 30 minutes à température ambiante sous agitation vortex.

Entre-temps, préparez les composants supplémentaires du kit sec IM Molene pour réaliser l'IEF dans l'unité d'électrophorèse multi-quatre. Réglez d'abord la température de l'unité de refroidissement à 20 degrés Celsius, pipetez trois à quatre millilitres de liquide de couverture sur la plaque de refroidissement et placez le plateau pour bandelettes sèches Immobilien dessus, avec la connexion d'électrode rouge orientée vers l'anode. Versez environ 10 millilitres d'huile de couverture dans le plateau pour bandelettes sèches Immobilien et placez le guide pour bandelettes sèches Immobilien, côté rainure vers le haut, sur le plateau recouvert d'huile.

Ensuite, retirez la bande réhydratée du plateau de gonflement et transférez-la, côté gel vers le haut, dans les rainures de l'aligneur. L'extrémité acide de la bande doit être orientée vers l'anode. À la fin, toutes les bandes doivent être alignées avec leurs bords anodiques.

Placer latéralement des bandes d'électrodes saturées en eau distillée aux extrémités des bandes de gel, en veillant à ce que les bandes d'électrodes entrent au moins partiellement en contact avec la surface du gel. Enfin, positionner les électrodes sur les bandes d'électrodes de manière à ce que la marque colorée soit orientée vers le contact électronique correspondant. Placer la barre porte-cuvettes près de l'anode sur le plateau pour bandes sèches immobilies et positionner une cuvette d'échantillon au-dessus de chaque bande IPG.

Appuyez doucement sur les cupules d'échantillon pour assurer un bon contact avec la bande IPG. Versez 70 à 80 millilitres d'huile de recouvrement dans le plateau afin de recouvrir les bandes IPG. Aucune huile ne doit s'infiltrer dans les cupules d'échantillon.

Si de l'huile s'écoule dans la coupelle, retirez-la à l'aide d'une pipette et réajustez les coupelles. Enfin, ajoutez environ 150 millilitres d'huile de recouvrement pour recouvrir complètement les coupelles d'échantillons. Appliquez maintenant les échantillons de protéines dans les coupelles d'échantillons en pipetant sous la surface du liquide de recouvrement.

Le volume de la cupule est de 100 microlitres. Une fois tous les échantillons protéiques appliqués, reliez toutes les connexions. Branchez l'unité multi-quatre à l'alimentation électrique et effectuez la focalisation isoélectrique pendant 11,1 kilovolt-heures en mode gradient. Après la FIE, les bandes IPG sont placées dans un bac, côté gel vers le haut, puis soumises à une réduction et une alkylation pendant l'équilibration.

Pour la réduction, utilisez 2,5 millilitres de solution d'équilibrage contenant 1 % de DTT par bande. Agitez ensuite pendant 15 minutes, puis remplacez complètement la solution de DTT et alkylez les bandes dans une solution d'équilibrage contenant 2,5 % d'iodoacétamide, en agitant pendant 15 minutes supplémentaires. Rincez les bandes équilibrées une fois dans un bécher rempli d'eau et déposez-les sur du papier filtre pour éliminer l'excès de tampon d'équilibrage.

Ensuite, transférez les bandes dans un tampon de migration XSDS. Les protéines contenues dans les bandes sont désormais prêtes pour la seconde dimension de l'électrophorèse sur gel 2D. La seconde dimension est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE sur un système vertical d'électrophorèse.

Un nombre approprié de gels d'acrylamide à 12 % d'une épaisseur de un millimètre est préparé un jour avant l'utilisation et conservé recouvert de papier humide. À température ambiante, les bandes IPG équilibrées sont placées sur le dessus des gels de séparation et fixées avec une solution d'agarose chaude ; les protéines sont ensuite séparées pendant 2,5 heures, en commençant à 80 volts pendant 15 minutes, puis à 120 volts jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le bas de la cassette du gel.

Pendant que les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE, préparez les solutions pour la coloration colloïdale au Kumasi du gel. Lors de la préparation de la solution de coloration, il est très important de respecter l'ordre séquentiel d'ajout des composants suivant. Dissolvez d'abord 100 grammes de sulfate d'aluminium dans environ 1,5 litre d'eau Milli-Q dans un bécher et mélangez. Une fois le sulfate d'aluminium dissous, ajoutez 200 millilitres d'éthanol, puis incorporez 0,4 gramme de CBG 250 à la solution.

Dès que le CBB G deux 50 est complètement dissous, ajoutez 47 millilitres d'acide orthophosphorique. Cette étape permet aux molécules de kamasi de s'agréger sous forme colloïdale. Enfin, ajoutez de l'eau milli Q jusqu'à un volume final de deux litres.

La solution finale en suspension contiendra des particules en suspension. Ne pas filtrer cette solution. La solution de coloration peut également être préparée à l'avance et conservée à l'abri de la lumière jusqu'à son utilisation.

Lorsque le gel SDS est terminé, retirer soigneusement le gel des plaques de verre et le transférer dans un récipient de coloration rempli d'eau Milli Q. Placer le récipient avec le gel sur un agitateur horizontal et agiter pendant 10 minutes.

Répétez le lavage deux fois supplémentaires pendant environ cinq à dix minutes. À l’aide d’eau milli Q fraîche, il est important de bien laver le gel, car la présence résiduelle de SDS sur le gel peut perturber la liaison du colorant aux protéines et entraîner une faible sensibilité. À la fin du troisième lavage, versez l’eau hors de la boîte.

Le gel est maintenant prêt à être coloré. Agitez d'abord la solution de Kumasi pour répartir uniformément les particules colloïdales. Ensuite, ajoutez suffisamment de solution pour recouvrir le gel.

Placer la boîte contenant la solution Kumasi en la couvrant. Faire gélifier sur un agitateur rotatif pendant deux à douze heures. Après 10 minutes, vous verrez apparaître les premières taches protéiques.

De 80 à cent pour cent de la coloration peuvent être obtenus en deux heures d'incubation. Toutefois, nous recommandons une incubation nocturne pour atteindre une coloration proche de 100 %. Une fois la coloration terminée, retirez la solution Kamasi et rincez le gel deux fois avec de l'eau Milli Q.

Après avoir rincé le gel, retirez les particules de colorant adhérentes à la boîte de coloration à l’aide d’un chiffon sans peluches. Ajoutez la solution de décoloration au gel et laissez agir de 10 à 60 minutes sur agitateur. Enfin, rincez le gel deux fois avec de l’eau Milli Q.

Le gel retrouvera son épaisseur initiale et l'intensité de la coloration au kumasi sera également améliorée. Si vous suivez ce protocole, votre gel 2D devrait présenter une résolution nette et être bien coloré avec des taches protéiques bleu foncé. Le résultat de notre coloration au kumasi des gels 2D est comparable à celui de la coloration argentique.

Selon le protocole de Chef Chenko et al., qui est décrit comme étant très sensible et compatible avec la spectrométrie de masse. À l'aide de l'exemple de l'électrophorèse sur gel bidimensionnel, nous venons de vous montrer à quel point le kangs cooma sustaining est rapide, simple et sensible. La détection des protéines dans des gels d'acrylamide po peut être réalisée en moins de deux heures.

La procédure elle-même nécessite peu de travail. Et last but not least, vous pourriez être en mesure de détecter aussi peu qu'un nanogramme de protéine. Ce protocole constitue donc certainement une bonne alternative aux méthodes d'analyse protéomique basées sur le gel sans marquage.

Lorsque vous utilisez la procédure de maintien, il est important de vous rappeler d'utiliser des produits chimiques de qualité analytique et de l'eau de la pureté la plus élevée. En outre, l'ajout séquentiel des composants à la solution de coloration est une étape cruciale de la préparation. Enfin, n'oubliez pas de laver efficacement les résidus de SDES des gels après la séparation électrophorétique.

Sinon, vous ne verrez rien sur vos gels. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.