Name: Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Apprenez un protocole de coloration au Coomassie G-250 colloïdal modifié pour détecter des nanogrammes de protéines dans des gels de polyacrylamide par électrophorèse bidimensionnelle. Cette méthode rapide et sensible améliore l'analyse en protéomique.

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Nous remercions le Dr Nicola Wiethölter de la préparation et la coloration de 1 D-gels. Ce travail a été financé par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 à ND et SM) et soutenu par une bourse de recherche de l&#39;Manchot Jürgen Stiftung à ND.

Partie 1: l&#39;électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-D) à l&#39;aide de la Coupe de chargement <ol><li> IPG-bande de la réhydratation et la focalisation isoélectrique (IEF) <ul><li> Réhydrater les gels DryStrip Immobiline, pH 6-11 (7 cm) dans 125 ul solution de réhydratation [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 4%, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] à partir du bac DryStrip Immobiline Reswelling pour au moins 10 heures. </li><li> Dissoudre l&#39;échantillon de protéines précipités dans le tampon d&#39;échantillon IEF [7 M urée, 2 M thiourée, CHAPS 2%, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide et 2% IPG 6-11 pH Tampon] correspondant à 60-100 pg de protéine par 100 ul . </li><li> Après solubilisation (au moins 30 minutes à température ambiante), appliquer échantillon de protéine par l&#39;intermédiaire anodique tasse de chargement en utilisant des tasses échantillon. Le volume de la coupe est de 100 ul (tasses collecteur permettre jusqu&#39;à 150 pl.) Remarque: vous pouvez charger des quantités plus grandes de l&#39;échantillon si vous insérez une étape à basse tension au début du protocole de concentrer et de remplir les tasses pendant qu&#39;il est encore un film de liquide dans la tasse! </li><li> Effectuer isoélectrofocalisation pour 11,1 KVH en mode dégradé dans l&#39;unité d&#39;électrophorèse Multiphor II. </li></ul></li><li> Equilibration et SDS-PAGE <ul><li> Après l&#39;IEF, les bandes IPG ont été soumis à une réduction et d&#39;alkylation, à chaque fois 15 minutes sur un agitateur, en utilisant le dithiothréitol 1% et 2,5% respectivement iodoacétamide dans une solution d&#39;équilibration [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M d&#39;urée, glycérol 30% et 2% de SDS]. </li><li> Rincez les bandes équilibrée avec H 2 O et les effacera sur papier Whatman pour enlever l&#39;excès de tampon d&#39;équilibration. Ensuite tremper les bandes en SDS-Tampon (1X). </li><li> La seconde dimension est réalisée par SDS-PAGE sur un système d&#39;électrophorèse verticale avec une concentration d&#39;acrylamide total de 12%. Les bandes IPG équilibrée ont été placés sur le haut de la séparation et des gels d&#39;agarose fixe avec solution chaude [agarose à 0,5% dans la gestion de tampon contenant bleu de bromophénol]. </li><li> Les protéines ont été séparées pendant 2,5 h, à partir de 80 V pendant 15 minutes suivie par 120 V jusqu&#39;à ce que le front atteint le fond de la cassette de gel. </li></ul></li></ol> Partie 2: coloration de Coomassie colloïdal avec CBB G-250 1. Solutions de coloration Remarque: pour la préparation des solutions de coloration, utiliser des produits chimiques de haute qualité tels que la qualité analytique (PA) et d&#39;eau de grande pureté que vous obtenez à partir de systèmes Millipore (eau Milli-Q). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Solution de Coomassie: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (p / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (p / v) </td><td> sulfate d&#39;aluminium (14-18)-hydrate </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> l&#39;éthanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> l&#39;acide orthophosphorique (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Remarque: pour la préparation de la solution de coloration, l&#39;addition séquentielle des composants dans l&#39;ordre suivant doit être maintenu: <ol><li> première dissolution du sulfate d&#39;aluminium en eau Milli-Q </li><li> puis ajouter de l&#39;éthanol, homogénéiser et mélanger CBB G-250 à la solution </li><li> aussi récemment que la solution soit complètement dissoute, ajouter de l&#39;acide phosphorique (l&#39;incorporation de l&#39;acide pour les médias alcoolisées permet de molécules Coomassie globale dans leur état colloïdal) </li><li> Enfin remplir avec eau Milli-Q </li></ol> Remarque: la solution de coloration finale a une couleur vert foncé-bleu apparence et est plein de particules nageant autour: <ul><li> Ne pas filtrat cette solution! </li><li> Si vous avez modifié l&#39;ordre de préparation, vous obtiendrez une solution plus violet bleuté qui est moins sensible. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Décoloration solution: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> l&#39;éthanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> l&#39;acide orthophosphorique (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Procédure de coloration <ul><li> Après la séparation deuxième dimension, retirez soigneusement les gels des plaques de verre et de les transférer dans un plat rempli de taches eau Milli-Q. </li><li> Lavez les gels à trois reprises avec eau Milli-Q pendant 10 minutes sur un agitateur horizontal (lavage insuffisant entraîne une mauvaise sensibilité parce que le reste sur les gels SDS perturbe la délimitation de la teinture à la protéine). </li><li> Agiter la solution avant de l&#39;utiliser de Coomassie pour disperser les particules colloïdales uniformément. </li><li> Incuber les gels bien couvert avec la solution de Coomassie par l&#39;agitation sur un agitateur pour 2-12 heures. Cette coloration de fond génère marginale sorte que vous pouvez observer la progression coloration entre les deux. Remarque: après 10 minutes, vous pouvez voir des taches de protéines première apparition, dans les 2 heures d&#39;incubation d&#39;environ 80% de coloration pour elleniveau maximum s est terminée. Depuis près de 100% coloration, une nuit d&#39;incubation est recommandée. Dans certains cas, lorsque la quantité de protéines à teindre est énorme et la solution se transforme en un bleu vif, un rafraîchissement de la solution de coloration est nécessaire. </li><li> Après la procédure de coloration éliminer la solution de Coomassie et rincer deux fois avec les gels eau Milli-Q. Remarque: vous pouvez réutiliser la solution de coloration aussi longtemps que les particules sont encore en suspens, sinon jetez-le (n&#39;oubliez pas que votre laboratoire peut avoir des règlements spéciaux pour l&#39;élimination des déchets). </li><li> Retirer coller des particules de colorant de l&#39;antenne avec une coloration non pelucheux serviette en papier et Décolorer pendant 10 - 60 minutes. Note: Vous pouvez aussi laver les gels juste avec eau Milli-Q, mais cela nous recommandons que pour la chromatographie préparative gels car il y aura une dernière irrégulière, film faibles Coomassie sur les gels qui se poseront pendant la procédure de numérisation. </li><li> Enfin rincez les gels à deux reprises avec eau Milli-Q: les gels atteindront leur épaisseur d&#39;origine (les médias l&#39;alcool-acide fait du rétrécissement des gels) et de neutralisation dans l&#39;eau augmente l&#39;intensité des couleurs de plus de Coomassie. </li></ul> Partie 3: Les résultats représentatifs Si vous suivez le protocole décrit ci-dessus, vous obtiendrez sur votre 2-D de gel distinctifs résolus et bien teinté foncé spots protéiques bleu. Même par rapport à un gel 2-D taché avec de l&#39;argent en fonction de Shevchenko et al. 5, un protocole affirmant une bonne sensibilité et une compatibilité avec la spectrométrie de masse, nous obtenons des résultats coloration égale. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Résultat final de l&#39;expérimentation décrite ci-dessus. Kang Coomassie protocole (A) effectue vivement, comme la coloration d&#39;argent conformément à Shevchenko et al. (B) dans la détection des protéines après 2-D électrophorèse sur gel. Partie 4: Trucs et astuces <ul><li> Effectuez quelques colorations test avant le traitement vos propres échantillons. Pour des raisons inexplicables, nous avons signalé que, parfois une protéine d&#39;intérêt ne pouvait pas être détecté avec succès, même lorsque milligrammes ont été appliquées. Dans ce cas nous vous conseillons de préparer quelques séries de dilution de tester la sensibilité. </li><li> Si vous avez peu de gel de détection de la protéine (s) en général, le transfert échoue de l&#39;empilement au gel de séparation au cours de SDS-PAGE sera peut-être la raison. Vous pouvez vérifier ces protéines collantes par coloration du gel complet incluant la zone d&#39;empilage. </li><li> Pour une vérification rapide de vos résultats axés isoélectrique, vous pouvez directement tacher les bandes IPG-sans aucune séparation seconde dimension supplémentaire. </li><li> Parfois leur tour, les gels pendant la procédure de coloration afin qu&#39;ils soient uniformément teinté des deux côtés (si vous gardez les gels impassible, le colorant se lie à un seul côté du gel). </li><li> Nous avons connu que le stockage de la solution de coloration dans une bouteille sombre augmente sa durée de vie (dans des bouteilles transparentes jusqu&#39;à 4 mois). </li><li> Après coloration et la documentation que vous pouvez garder les gels dans le réfrigérateur pendant plusieurs années (si vous ajoutez une solution acide, vous éviter les contaminations par des champignons). </li><li> Décoloration de bouchons de gel pour une digestion trypsique peut être accéléré par le réchauffement dans un chauffe-bloc. </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

Innovants ou tout simplement un autre protocole de Coomassie? À l&#39;heure actuelle, il existe plusieurs protocoles pour les procédures de coloration de Coomassie Brilliant Blue. La plupart d&#39;entre eux résultent de modifications mineures ou majeures de l&#39;un des protocoles les plus couramment utilisés par les Neuhoff et ses collègues 2. Aussi le protocole Kang est basé sur la formule de Neuhoff. Mais est-ce vraiment une méthode de coloration au bleu de Coomassie alternativ...

<table border="1" ><tr><td> Nom du produit </td><td> Société </td><td> No de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Pour l&#39;IEF et SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip gels </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Peut même être utilisé 2 ans après la date d&#39;expiration. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Plateau </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Ne pas nettoyer avec des solvants organiques. Conçu pour les 7-18 cm IPG-bandes. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Comprend un plateau électrodes, porte-électrodes, anode et cathode, aligneur et le bar de la Coupe de l&#39;échantillon et des coupes de l&#39;échantillon. </td></tr><tr><td> EPS 3501 Alimentation XL </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fournitures de tension jusqu&#39;à 3500 V. </td></tr><tr><td> Unité Multiphor électrophorèse II </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Électrodes mobiles permettent l&#39;IEF dans les bandes IPG de toute longueur (7-24 cm IPG strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel de système Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE en 10x10 cm mini-gel format. Gel chambre comprend un système de refroidissement. </td></tr><tr><td> Pour colloïdale Coomassie G-250 de coloration: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coloration des plats avec des couvercles </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Convient pour les mini-gels. Empilable sur agitateur. </td></tr><tr><td> sulfate d&#39;aluminium-18-hydrate </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Nous avons fait une meilleure expérience avec Merck. Juste disponible en 5 kg emballage. </td></tr><tr><td> l&#39;acide orthophosphorique </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Vendu en bouteilles de verre. </td></tr></table>

rapide et sensible colloïdal coomassie g-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et quantification élevée. Par ailleurs, il est totalement compatible avec l&#39;identification des protéines par spectrométrie de masse. Mais malgré ces avantages, CBB est considéré comme moins sensible que d&#39;argent ou de colorations fluorescence et donc rarement utilisés pour la détection des protéines dans les approches protéomiques analytiques à base de gel. Plusieurs améliorations de l&#39;original du protocole 1 de Coomassie ont été faits pour augmenter la sensibilité de la CBB. Deux modifications majeures ont été introduites pour améliorer la détection de protéines de faible abondance par la conversion des molécules de colorant dans les particules colloïdales: En 1988, Neuhoff et ses collègues ont utilisé 20% de méthanol et de plus fortes concentrations de sulfate d&#39;ammonium dans le CBB G-250 une solution de coloration basée 2, et en 2004, al Candiano et al. établie Blue Silver utilisant CBB G-250 avec de l&#39;acide phosphorique en présence de sulfate d&#39;ammonium et de méthanol 3. Néanmoins, toutes ces modifications permettent simplement une détection d&#39;environ 10 ng de protéines. Un protocole largement fameless pour Coomassie coloration colloïdale a été publié par Kang et al. En 2002 où ils ont modifié le protocole Neuhoff colloïdale coloration CBB concernant les substances complexantes. Au lieu de sulfate d&#39;ammonium ils ont utilisé du sulfate d&#39;aluminium et de méthanol a été remplacé par le 4 éthanol moins toxiques. La base d&#39;aluminium dans l&#39;étude de nouvelles taches de Kang a montré une sensibilité supérieure, qui détecte aussi bas que 1 ng / bande (phosphorylase b) avec une variation peu de sensibilité en fonction des protéines. Ici, nous démontrons l&#39;application du protocole de Kang rapide et sensible pour la coloration de Coomassie colloïdal de protéines à des fins analytiques. Nous allons illustrer le protocole rapide et facile en utilisant des gels bidimensionnels en routine dans notre groupe de travail.

Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Pour la détection de protéines moyenne 4 ng dans les gels. La coloration est terminé dans les 2 heures et sans aucun effort. Nous utilisons régulièrement le protocole de Kang des fins d&#39;analyse en gel à base de protéomique.

Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

Le bleu de Coomassie brillant (CBB) est un colorant couramment utilisé pour la visualisation de protéines séparées par SDS-PAGE, offrant une procédure de coloration simple et...

Dans cette vidéo, nous démontrerons l'efficacité d'un protocole de coloration kumasi modifié pour la détection de plusieurs nanogrammes de protéine dans des gels de polyacrylamide. À l'aide de l'exemple de l'électrophorèse sur gel bidimensionnel avant la séparation en première dimension, les bandes à gradient de pH immobilisé sont réhydratées dans des conditions de tampon dénaturant.Après le re gonflement nocturne des bandes, les échantillons protéiques sont appliqués par chargement dans une cupule anodique. Au cours du processus de focalisation, les protéines sont séparées selon leurs points isoélectriques. La séparation en seconde dimension est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE.Le gel est ensuite transféré dans une boîte de coloration et les protéines sont détectées par coloration au bleu de Kumasi colloïdal. Bonjour, je suis Nadine de Bala du laboratoire de Sabina Meka au centre de recherche biomédicale de l'Université d'Olor. Aujourd'hui, je vais attirer votre attention sur une procédure peu connue selon les collègues de Kangan : le Cy Brilliant Blue est un colorant couramment utilisé pour la visualisation des protéines après des séparations électrophorétiques, mais on suppose souvent qu'il est moins adapté à la protéomique comparative.Cependant, la coloration colloïdale présente des avantages supérieurs en termes de sensibilité, de coûts et de praticité. Nous utilisons le protocole de coloration K dans notre laboratoire pour presque toutes les applications basées sur des gels moyens, mais particulièrement en protéomique analytique afin de déterminer les variations d'expression des protéines myocardiques. Je vais démontrer l'utilisation de cette méthode pour détecter les protéines myocardiques dans la plage de pH alcalin des gels d'électrophorèse bidimensionnelle.Commençons. Voici. La première dimension de l'électrophorèse en gel bidimensionnel est la focalisation isoélectrique ou IEF, et des bandes à gradient de pH immobilisé, ou bandes IPG, sont utilisées pour cette analyse.Avant l'IEF, quatre bandes IPG sont réhydratées individuellement dans 125 microlitres de solution de réhydratation à l'aide du plateau de gonflement sec IM Mobilly pendant au moins 10 heures, période au terme de laquelle les bandes IPG sont réhydratées et prêtes à recevoir les échantillons protéiques. Des échantillons protéiques précipités par l'acide trichloroacétique provenant de quatre préparations cardiaques différentes sont dissous dans du tampon d'échantillonnage pour l'IEF à une concentration de 100 microgrammes de protéine par 100 microlitres. La solubilisation des échantillons protéiques nécessitera au moins 30 minutes à température ambiante sous agitation vortex.Entre-temps, préparez les composants supplémentaires du kit sec IM Molene pour réaliser l'IEF dans l'unité d'électrophorèse multi-quatre. Réglez d'abord la température de l'unité de refroidissement à 20 degrés Celsius, pipetez trois à quatre millilitres de liquide de couverture sur la plaque de refroidissement et placez le plateau pour bandelettes sèches Immobilien dessus, avec la connexion d'électrode rouge orientée vers l'anode. Versez environ 10 millilitres d'huile de couverture dans le plateau pour bandelettes sèches Immobilien et placez le guide pour bandelettes sèches Immobilien, côté rainure vers le haut, sur le plateau recouvert d'huile.Ensuite, retirez la bande réhydratée du plateau de gonflement et transférez-la, côté gel vers le haut, dans les rainures de l'aligneur. L'extrémité acide de la bande doit être orientée vers l'anode. À la fin, toutes les bandes doivent être alignées avec leurs bords anodiques. Placer latéralement des bandes d'électrodes saturées en eau distillée aux extrémités des bandes de gel, en veillant à ce que les bandes d'électrodes entrent au moins partiellement en contact avec la surface du gel. Enfin, positionner les électrodes sur les bandes d'électrodes de manière à ce que la marque colorée soit orientée vers le contact électronique correspondant. Placer la barre porte-cuvettes près de l'anode sur le plateau pour bandes sèches immobilies et positionner une cuvette d'échantillon au-dessus de chaque bande IPG.Appuyez doucement sur les cupules d'échantillon pour assurer un bon contact avec la bande IPG. Versez 70 à 80 millilitres d'huile de recouvrement dans le plateau afin de recouvrir les bandes IPG. Aucune huile ne doit s'infiltrer dans les cupules d'échantillon.Si de l'huile s'écoule dans la coupelle, retirez-la à l'aide d'une pipette et réajustez les coupelles. Enfin, ajoutez environ 150 millilitres d'huile de recouvrement pour recouvrir complètement les coupelles d'échantillons. Appliquez maintenant les échantillons de protéines dans les coupelles d'échantillons en pipetant sous la surface du liquide de recouvrement.Le volume de la cupule est de 100 microlitres. Une fois tous les échantillons protéiques appliqués, reliez toutes les connexions. Branchez l'unité multi-quatre à l'alimentation électrique et effectuez la focalisation isoélectrique pendant 11,1 kilovolt-heures en mode gradient. Après la FIE, les bandes IPG sont placées dans un bac, côté gel vers le haut, puis soumises à une réduction et une alkylation pendant l'équilibration.Pour la réduction, utilisez 2,5 millilitres de solution d'équilibrage contenant 1 % de DTT par bande. Agitez ensuite pendant 15 minutes, puis remplacez complètement la solution de DTT et alkylez les bandes dans une solution d'équilibrage contenant 2,5 % d'iodoacétamide, en agitant pendant 15 minutes supplémentaires. Rincez les bandes équilibrées une fois dans un bécher rempli d'eau et déposez-les sur du papier filtre pour éliminer l'excès de tampon d'équilibrage.Ensuite, transférez les bandes dans un tampon de migration XSDS. Les protéines contenues dans les bandes sont désormais prêtes pour la seconde dimension de l'électrophorèse sur gel 2D. La seconde dimension est réalisée par électrophorèse SDS-PAGE sur un système vertical d'électrophorèse.Un nombre approprié de gels d'acrylamide à 12 % d'une épaisseur de un millimètre est préparé un jour avant l'utilisation et conservé recouvert de papier humide. À température ambiante, les bandes IPG équilibrées sont placées sur le dessus des gels de séparation et fixées avec une solution d'agarose chaude ; les protéines sont ensuite séparées pendant 2,5 heures, en commençant à 80 volts pendant 15 minutes, puis à 120 volts jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le bas de la cassette du gel.Pendant que les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE, préparez les solutions pour la coloration colloïdale au Kumasi du gel. Lors de la préparation de la solution de coloration, il est très important de respecter l'ordre séquentiel d'ajout des composants suivant. Dissolvez d'abord 100 grammes de sulfate d'aluminium dans environ 1,5 litre d'eau Milli-Q dans un bécher et mélangez. Une fois le sulfate d'aluminium dissous, ajoutez 200 millilitres d'éthanol, puis incorporez 0,4 gramme de CBG 250 à la solution.Dès que le CBB G deux 50 est complètement dissous, ajoutez 47 millilitres d'acide orthophosphorique. Cette étape permet aux molécules de kamasi de s'agréger sous forme colloïdale. Enfin, ajoutez de l'eau milli Q jusqu'à un volume final de deux litres.La solution finale en suspension contiendra des particules en suspension. Ne pas filtrer cette solution. La solution de coloration peut également être préparée à l'avance et conservée à l'abri de la lumière jusqu'à son utilisation.Lorsque le gel SDS est terminé, retirer soigneusement le gel des plaques de verre et le transférer dans un récipient de coloration rempli d'eau Milli Q. Placer le récipient avec le gel sur un agitateur horizontal et agiter pendant 10 minutes.Répétez le lavage deux fois supplémentaires pendant environ cinq à dix minutes. À l’aide d’eau milli Q fraîche, il est important de bien laver le gel, car la présence résiduelle de SDS sur le gel peut perturber la liaison du colorant aux protéines et entraîner une faible sensibilité. À la fin du troisième lavage, versez l’eau hors de la boîte. Le gel est maintenant prêt à être coloré. Agitez d'abord la solution de Kumasi pour répartir uniformément les particules colloïdales. Ensuite, ajoutez suffisamment de solution pour recouvrir le gel.Placer la boîte contenant la solution Kumasi en la couvrant. Faire gélifier sur un agitateur rotatif pendant deux à douze heures. Après 10 minutes, vous verrez apparaître les premières taches protéiques.De 80 à cent pour cent de la coloration peuvent être obtenus en deux heures d'incubation. Toutefois, nous recommandons une incubation nocturne pour atteindre une coloration proche de 100 %. Une fois la coloration terminée, retirez la solution Kamasi et rincez le gel deux fois avec de l'eau Milli Q.Après avoir rincé le gel, retirez les particules de colorant adhérentes à la boîte de coloration à l’aide d’un chiffon sans peluches. Ajoutez la solution de décoloration au gel et laissez agir de 10 à 60 minutes sur agitateur. Enfin, rincez le gel deux fois avec de l’eau Milli Q.Le gel retrouvera son épaisseur initiale et l'intensité de la coloration au kumasi sera également améliorée. Si vous suivez ce protocole, votre gel 2D devrait présenter une résolution nette et être bien coloré avec des taches protéiques bleu foncé. Le résultat de notre coloration au kumasi des gels 2D est comparable à celui de la coloration argentique.Selon le protocole de Chef Chenko et al., qui est décrit comme étant très sensible et compatible avec la spectrométrie de masse. À l'aide de l'exemple de l'électrophorèse sur gel bidimensionnel, nous venons de vous montrer à quel point le kangs cooma sustaining est rapide, simple et sensible. La détection des protéines dans des gels d'acrylamide po peut être réalisée en moins de deux heures.La procédure elle-même nécessite peu de travail. Et last but not least, vous pourriez être en mesure de détecter aussi peu qu'un nanogramme de protéine. Ce protocole constitue donc certainement une bonne alternative aux méthodes d'analyse protéomique basées sur le gel sans marquage.Lorsque vous utilisez la procédure de maintien, il est important de vous rappeler d'utiliser des produits chimiques de qualité analytique et de l'eau de la pureté la plus élevée. En outre, l'ajout séquentiel des composants à la solution de coloration est une étape cruciale de la préparation. Enfin, n'oubliez pas de laver efficacement les résidus de SDES des gels après la séparation électrophorétique.Sinon, vous ne verrez rien sur vos gels. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Après la séparation par des méthodes électrophorétiques des protéines dans un gel peut être détectée par des méthodes de coloration de plusieurs. Coloration des protéines au bleu de Coomassie, coloration à l'argent, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sont démontrées dans cette vidéo.

Coloration protéines dans les gels

Un protocole court pour la coloration des protéines de Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 dans des gels de polyacrylamide est décrite sans utiliser de solvants organiques ou d'acide acétique comme dans les procédures de coloration classique avec CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

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Bleu d&#39;électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (BN-PAGE) pour l&#39;analyse des complexes multiprotéiques de lysats cellulaires

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Coloration fluorescente à l’argent : une technique pour visualiser les protéines totales dans les gels de polyacrylamide

Cette vidéo présente une technique de séparation dénaturante à base de polyacrylamide pour les protéines. Cette technique permet d’identifier avant tout les protéines en fonction de leur poids moléculaire.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium pour l’analyse des protéines : une technique pour séparer et visualiser les protéines en fonction de leur poids moléculaire

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’une méthode d’électrophorèse sur gel bidimensionnelle qui sépare des protéines individuelles d’un mélange complexe de protéines obtenues à partir de tissus tumoraux d’adénome hypophysaire non fonctionnel humain (NFPA). Les protéines sont séparées en fonction de leur charge électrique dans la première dimension et séparées en fonction des poids moléculaires dans la deuxième dimension.

Électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide : technique de séparation pour l’analyse des protéines dans un mélange complexe de protéines basé sur la charge et la masse moléculaire

Nous présentons ici une électrophorèse bidimensionnelle (2DE) couplée à la spectrométrie de masse (MS) pour séparer et identifier le protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine, qui présente un motif de 2DE bon et reproductible. Plusieurs protéines sont observées dans chaque endroit de 2DE lors de l’analyse complexe cancer proteome avec l’utilisation de MS de haute sensibilité.

Électrophorèse bidimensionnelle, couplée avec des méthodes de spectrométrie de masse pour l’analyse du protéome de tissus Adénome hypophysaire humaine

Nous rapportons ici un protocole qui nécessite seulement trois réactifs et 7 min de traitement et est adapté pour la Géneration rapide des données de SSR de qualité dans l’analyse génétique de coloration à l’argent simple et peu coûteuse.

Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

Nous décrivons ici un protocole détaillé décrivant un fluorescent nouvelle coloration pour la détection de protéines totales dans les gels de polyacrylamide. Le protocole utilise une sonde de turn-on argent ionique spécifique fluorescence, qui permet de détecter Ag+-complexes de protéine et élimine certaines limitations des taches argent chromogène traditionnels.

Fluorescent coloration à l’argent des protéines dans les Gels de Polyacrylamide

Pour surmonter les limites de la mutagénèse classique dirigée par site, des analogues de la proline avec des modifications spécifiques ont été incorporés dans plusieurs protéines fluorescentes. Nous montrons comment le remplacement de l’hydrogène par le fluor ou du simple par des liaisons doubles dans les résidus de proline (« chirurgie moléculaire ») affecte les propriétés fondamentales des protéines, y compris leur repliement et leur interaction avec la lumière.

Échange spécifique de résidus de proline par des analogues de proline dans des protéines fluorescentes: comment la « chirurgie moléculaire » de l’épine dorsale affecte le repliement et la stabilité

Ce protocole décrit une technique d’analyse des supercomplexes respiratoires lorsque seules de petites quantités d’échantillons sont disponibles.

Isolement des mitochondries pour l’analyse des supercomplexes mitochondriaux à partir de petits échantillons de tissus et de cultures cellulaires 

Apprenez un protocole de coloration au Coomassie G-250 colloïdal modifié pour détecter des nanogrammes de protéines dans des gels de polyacrylamide par électrophorèse bidimensionnelle. Cette méthode rapide et sensible améliore l'analyse en protéomique.

Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide

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