Combinant QD-FRET et la microfluidique pour surveiller Nanocomplex ADN auto-assemblage en temps réel

Cette procédure commence par le marquage de l’ADN et du polymère pour générer des points quantiques ou QD fret pear plasma ADN est conjugué avec des points quantiques. Le donneur d’énergie et le polymère onique sont marqués avec une flore organique quatre sci cinq. L’accepteur d’énergie.

Lors du mélange de frettes QD, des nanocomplexes sont formés par auto-assemblage électrostatique et le signal de frette médié par QD peut ensuite être suivi pendant que l’interaction a lieu. Ce système de frettes QD est introduit dans un canal microfluidique où les composants n’interagiront que par diffusion sur l’interface de mélange. L’auto-assemblage du nanocomplexe d’ADN peut ensuite être surveillé par la combinaison de la frette QD et de la microfluidique.

Bonjour, je m’appelle Megan Ho et je travaille au laboratoire de Bios et de dynamique des molécules uniques du Département de génie mécanique de l’Université Johns Hopkins. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de combiner la menace quantique et la microfluidique pour surveiller l’auto-assemblage de l’ADN des ongles en temps réel. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette procédure pour étudier les complexes DNNL pour la localisation de la thérapie génique.

Alors commençons. Un kit de marquage à la biotine de MIRIs bio est utilisé pour covalent l’ADN plasmatique de biotine avec des marqueurs de biotine spécifiques à la guanine, mais mis à l’échelle pour avoir environ un à deux marqueurs de biotine par ADN. Pour commencer, dissolvez la quantité souhaitée d’ADN plasmatique dans le tampon TE pour obtenir une solution d’ADN d’un microgramme par microlitre.

Configurez la réaction de marquage en mélangeant l’eau plasmatique libre D-N-A-D-N-A et l’eau libre d’ARN 10 x tampon de marquage A et le réactif de marquage it. L’étiquette est ajoutée en dernier. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation d’une heure, purifier l’échantillon étiqueté par précipitation à l’éthanol. Suivant les protocoles standard. Conservez l’ADN marqué à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation.

L’étape suivante consiste à étiqueter le polymère onique. Dans cette démonstration, nous allons utiliser le chitosane comme polymère onique modèle et étiqueter les amines primaires libres sur le squelette du polymère de chitosane avec le NHS de science-fiction, calculer d’abord la quantité requise de NHS de science-fiction de sorte que le rapport molaire de la science-fiction aux moyennes primaires soit de un à 200. Cela facilitera la conjugaison complète du colorant de science-fiction.

Ajoutez de l’hydroxyde de sodium à la solution de chitosane dans un tampon d’acétate de 25 millimolaires pour ajuster son pH à environ 6,5 tout en remuant lentement, ajoutez la quantité calculée de NHS de science-fiction à la solution de chitosane goutte à goutte. Couvrez le flacon de papier d’aluminium pour garder le mélange dans l’obscurité et agitez à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, purifier le mélange par dialyse à l’aide d’une lame de 10 K-M-W-C-O à partir du perçage contre un tampon d’acétate à 1 % dialysé pendant deux heures à température ambiante dans l’obscurité.

Après deux heures, remplacez le tampon d’acétate à 1 % et dialysez pendant deux heures supplémentaires. À température ambiante dans l’obscurité, remplacez à nouveau le tampon et dialysez pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain, retirez le polymère purifié de la cassette de dialyse.

Le chitosane marqué SCI five est ensuite collecté dans un microtube de centrifugation et stocké à moins 20 degrés Celsius. Ajouter 6 0 5 points fonctionnalisés par la streptavidine dans la solution d’ADN plasma biotinylé. Assurez-vous d’utiliser la série ITK Q dot stripped have in conjuguate par opposition à la série régulière de points Q, car les points quantiques de la série ITK sont conçus à des fins de frette.

Incuber la solution à température ambiante pendant 15 minutes. Gardez la réaction d’étiquetage QD dans l’obscurité pour éviter un éventuel photoblanchiment. Après 15 minutes, ajoutez l’ADN marqué QD dans une solution de sulfate de sodium de 50 millimolaires pour obtenir un volume final de 200 microlitres.

Pour préparer le polymère de science-fiction, calculez la quantité requise de chitosane pour 10 microgrammes d’ADN plasmatique en fonction du rapport NP souhaité, qui est le rapport théorique des immunes protonées dans la solution de chitosane par rapport aux phosphates négatifs dans la solution d’ADN diluez le chitosane de science-fiction selon le rapport NP souhaité avec de l’eau Milli Q pour faire le volume final 200 microlitres les solutions d’ADN marqué QD et de chitosane de science-fiction sont maintenant prêtes pour le chargement dans le dispositif microfluidique, comme nous le verrons à la section six. La plaquette de silicone est préparée au préalable par nettoyage et cuisson par piranha pour éliminer l’humidité sur la plaquette pour l’épaisseur principale désignée de 25 microns. Appliquez une couche de résine photosensible négative sur la plaquette de silicone à 2000 tr/min pendant 30 secondes.

Faites cuire doucement la gaufrette sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure à 95 degrés Celsius. Cela évaporera le solvant sur la photo SU huit. Résistez-le et solidifiez-le avant de l’exposer aux rayons UV.

Après la cuisson douce, appliquez un film de masque contenant le motif de micro-canaux sur la plaquette de silicium exposée à la lumière UV à 365 nanomètres pour 250 millijoules par centimètre carré après l’exposition. Faites cuire la gaufrette sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure à 95 degrés Celsius. Développez la plaquette à l’aide du développeur SU eight Photoresist pour vérifier que le développement est terminé.

Plongez la gaufrette dans de l’alcool isopropylique. L’alcool isopropylique ne doit pas devenir laiteux. Enfin, pour renforcer la structure SU huit, faites cuire la plaquette à motifs sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure à 200 degrés Celsius.

Maintenez la plaquette à 200 degrés Celsius pendant au moins cinq heures. Ensuite, refroidissez progressivement la gaufrette à température ambiante. Placez le SU eight master dans un bateau de pesée.

Mélangez l’élastomère de silicone et l’agent de durcissement poly diméthyl Sloane ou PDMS dans un rapport de 10 pour un. Versez le mélange PDMS sur le SU eight master et laissez le bateau de pesée dans un dessiccation sous vide pour éliminer les bulles. Faites durcir le PDMS à 65 degrés Celsius pendant une à deux heures.

Une fois le PDMS durci, décollez la bande PDMS du moule maître en silicone à l’aide d’un poinçon de poinçonnage entier, de deux entrées de canal et d’une sortie de canal pour le dispositif fluidique. Nettoyez la bande PDMS et le verre de couverture avec de l’éthanol, puis séchez-le à l’air. Traitez la bande PDMS nettoyée et le verre de couverture avec un plasma d’oxygène à 20 watts.

D’une part, collez immédiatement la bande PDMS avec le verre de protection. Laissez la puce microfluidique collée dans le four à 95 degrés Celsius pendant la nuit. Le traitement au plasma et la cuisson pendant la nuit sont essentiels pour améliorer la force de liaison.

Avant de charger les réactifs, remplissez le canal microfluidique avec de l’eau pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles à l’intérieur. Cela garantira un écoulement fluide. Au cours de l’expérience, chargez les solutions de QD, d’ADN marqué et de chitosane de science-fiction préalablement préparées dans deux seringues en verre individuelles à travers le tube.

Connectez le tube avec les deux entrées du dispositif microfluidique. Veillez à ne pas introduire d’air pendant le processus. Réglez le débit à 20 nanolitres par minute dans des conditions d’écoulement laminaire.

Vérifiez les micro-canaux au microscope lorsque le débit est stable, environ 15 à 20 minutes. La frette médiée par QD doit être observée au centre du canal. Acquérez des images fluorescentes à différents endroits le long du canal avec une caméra CCD refroidie.

Analysez ces images avec l’image J et origin lab. Le signal médié par les frettes est surveillé à différentes positions axiales le long du canal. Résidence. Le temps est calculé en fonction du débit appliqué à l’aide de cette formule où la barre TISA est la résidence.

Le temps X est la distance entre l’endroit où les deux flux se rencontrent et la position de la réaction étudiée. Et V est la vitesse moyenne d’écoulement. Les profils d’intensité de section transversale des signaux de science-fiction médiés par les frettes peuvent ensuite être analysés dans notre système.

Les profils mesurés expérimentalement présentent une distribution gaussienne. Nous venons de vous montrer comment surveiller les complexes d’ADN des ongles à travers un fil quantique dans un simple canal microfluide. Lors de ces procédures, il est important de ne pas oublier de concevoir un marqueur sur votre canal de microfluide afin que le temps des résidents puisse être droit en fonction du débit appliqué et de la géométrie du canal.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.