Name: Combinant QD-FRET et la microfluidique pour surveiller Nanocomplex ADN auto-assemblage en temps réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Découvrez la combinaison QD-FRET et microfluidique pour surveiller l'auto-assemblage de nanocomplexes ADN en temps réel. Cette méthode améliore la synthèse de polyplexes pour la thérapie génique.

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Le soutien financier fourni par le NIH HL89764, subventions de la NSF 0546012, 0730503 et 0725528.

A. Biotinylation de l&#39;ADN L&#39;ADN plasmidique ont été biotinylées covalente avec des étiquettes biotine guanine spécifiques telles que décrites par le fabricant (Mirus Bio, Madison, WI), mais à l&#39;échelle d&#39;avoir ~ 1-2 étiquettes biotine par l&#39;ADN. L&#39;ADN plasmidique (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) a été marqué dans ce protocole. <ol><li> Dissoudre la quantité désirée de ADNp en tampon TE de DNase et de RNase (biologie moléculaire une qualité) d&#39;eau pour faire une solution d&#39;ADN 1μg/μL. </li><li> Effectuer la réaction de marquage utilisant des mélanges de réaction suivante. Ajouter l&#39;étiquette, il dernier réactif. </li></ol> Pour la réaction d&#39;ADN 100 ug: <table border="1"><tbody><tr><td> DNase et RNase-free de l&#39;eau </td><td> 75 ul </td></tr><tr><td> Un tampon de marquage 10X </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> 1μg/μL l&#39;ADN </td><td> 100 uL </td></tr><tr><td> Étiquette, il réactifs </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 200 uL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Purifier l&#39;échantillon marqué par l&#39;éthanol ou l&#39;isopropanol précipitations suivant des protocoles standard. </li></ol> Remarque: les colonnes de filtration à base de gel peut conduire à absorbance UV haute ou fond de fluorescence, qui peut affecter la quantification de l&#39;ADN ou la caractérisation de fluorescence. Remarque: Le niveau de biotinylation peut être déterminée par HABA tests basés. B. Étiquetage des polymères cationiques Cy5- Chitosan (390 kDa, 83,5% désacétylé, Vanson, Redmond, WA) a été utilisé comme modèle d&#39;un polymère cationique dans cette étude. Les amines primaires gratuits sur l&#39;épine dorsale polymère de chitosane ont été marquées avec Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). <ol><li> Afin de faciliter la conjugaison complète de Cy5 colorant, calculer la quantité nécessaire de Cy5-NHS tels que le rapport molaire de Cy5: amines primaires est de 1: 200. </li><li> Ajuster le pH de la solution de chitosan (dans le tampon acétate 25 mM) à ~ 6,5 par addition de NaOH. Notez que la réaction du NHS est plus efficace à pH basique, mais la solubilité du chitosane ici les limites de la gamme de pH de travail. </li><li> Tout en remuant, ajouter lentement le montant calculé de Cy5-NHS (1 mg / ml de DMSO) à la solution de chitosane dans une manière goutte-à-goutte. </li><li> Agiter le mélange dans le noir à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Pour purifier, dialyser avec 10k MWCO Slide-A-Lyzer (Pierce) pendant 2 heures contre du tampon acétate de 1% à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Remplacer tampon et dialyser une autre 2 h à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Remplacer tampon et dialyser nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Boutique purifiée étiquetés polymère à -20 ° C. </li></ol> Remarque: Dans cette étude, une courbe standard est construite en mesurant l&#39;intensité d&#39;émission de Cy5-NHS ester à 670 nm. Caractériser la densité de marquage en mesurant l&#39;émission à 670 nm obtenue à partir Cy5-étiquetés chitosane dans la courbe standard. Absorbance peut également être utilisé pour déterminer l&#39;efficacité d&#39;étiquetage, mais n&#39;a pas été effectué ici. C. Préparation des QD-ADN marqué et Cy5-Polymère Le rapport molaire de ADNp au QD a été maintenu en excès (ADNp: QD ≈ 1: 2) pour assurer la conjugaison complète des QDs à ADNp. Le nombre de boîtes quantiques étiquetés sur chaque ADNp peut être estimée grâce à l&#39;imagerie TEM ou d&#39;autres installations équivalentes. Dans notre étude, le nombre de boîtes quantiques par ADNp est estimé à ~ 1-3 par TEM et spectroscopie molécule unique. Utilisez une Millipore eau Milli-Q gradient (&gt; 18,0 MW, 0.2um filtrée) pendant la préparation. <ol><li> Calculer la quantité requise de chitosane pour 10 pg ADNp fonction désirée rapport N / P, le ratio théorique d&#39;amines protonées dans la solution de chitosane à l&#39;phosphates négatifs dans la solution d&#39;ADN. </li><li> Ajouter streptavidine-fonctionnalisés 605QDs (ITK Qdot 605, Invitrogen, Carlsbad, CA) dans la solution biotinylé ADNp. </li><li> Incuber la solution à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 15 min. </li><li> Ajouter le QD-ADN marqué en 50 mM solution de sulfate de sodium pour rendre le volume final 200 pl. </li><li> Diluer Cy5-chitosane, selon désiré rapport N / P, avec eau Milli-Q pour rendre le volume final 200 pl. </li></ol> Remarque: Conservez la réaction dans l&#39;obscurité pour éviter photoblanchiment possible. Important: Soyez prudent d&#39;utiliser le Qdot 605 ITK ™ streptavidine conjugué (la série ITK), que les points quantiques dans ce catalogue sont conçus dans le but de FRET. La série Qdot réguliers sont conjugués avec une couche de PEG pour empêcher la liaison non spécifique, en particulier pour l&#39;étiquetage cellulaire. Cependant, ce revêtement supplémentaire élargit la distance donneur-accepteur, résultant en réduite l&#39;efficacité du transfert d&#39;énergie. D. La fabrication de la SU-8 Maîtrise en utilisant la photolithographie standard <ol><li> Plaquette de Si est piranha nettoyé et cuit à 200 ° C pendant 5 min. </li><li> Pour l&#39;épaisseur de 25 um maître désigné, manteau tourner la résine photosensible négative (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) sur la plaquette de Si à 2000 rpm pendant 30 sec. </li><li> Cuire la galette molle sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 ° C / hr à 95 ° C. </li><li> Exposer à la lumière UV (365nm) pour 250mJ/cm 2 à travers un film masque (CAO / Art Services, Bandon, OR) contenant de la conception de microcanaux. </li><li> Post-exposition cuire la galette sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 ° C / hr à 95 ° C. </li><li> Développer la plaquette en utilisant SU-8 développeur résine photosensible. </li><li> La plaquette est difficile à motifs cuite sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 ° C / h à 200 ° C. Maintenir la plaquette à 200 ° C pendant au moins 5 heures, puis refroidir progressivement la plaquette à température ambiante. </li></ol> Important: montée en puissance progressive lors de la SU-8 cuisson maître est nécessaire, sinon le SU-8 structure peut détacher de la plaquette de silicium ou de fissures sur la structure de SU-8 peut être induite par le stress à la libération. E. Replica moulage de PDMS par les maîtres et collage sur le verre Couvercle <ol><li> Le maître SU-8 est placé dans un bateau pesant. </li><li> Mix de silicone élastomère et de durcisseur (poly (diméthylsiloxane), le PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) en 10: 1 ratio. </li><li> Verser le mélange PDMS sur le SU-8 maître et quitter le bateau pesant dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bulles. </li><li> Guérissez les PDMS à 65 ° C pendant 1-2 heures. </li><li> Peler la bande PDMS de la moule maître de silicium. </li><li> Poinçon entrées et sorties de canal de l&#39;appareil fluidiques. </li><li> Nettoyez la bande de PDMS et couvercle en verre avec de l&#39;éthanol et ensuite sécher à l&#39;air. </li><li> Traiter le PDMS nettoyé bande de verre et couvrir avec un plasma d&#39;oxygène (20W pendant 1min). </li><li> Immédiatement coller la bande PDMS avec couvercle en verre. </li><li> Laisser la puce microfluidique collé dans le four à 95 ° C pour la nuit. </li></ol> Important: le traitement du plasma et la cuisson pendant la nuit sont essentiels à la force d&#39;adhérence accrue. F. Surveiller la formation de l&#39;ADN nanocomplexes dans le dispositif microfluidique <ol><li> Remplissez le canal microfluidique avec de l&#39;eau (pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas de bulles dans le canal microfluidique), avant le chargement des réactifs pour assurer la fluidité lors de l&#39;expérience. </li><li> Chargez l&#39;ADN QD-étiquetés et Cy5-étiquetés solutions chitosane en deux seringues en verre individuel, au travers du tube décrit dans la vidéo. </li><li> Connectez le tube avec les deux entrées de dispositifs microfluidiques. Soyez prudent de ne pas introduire de l&#39;air pendant le processus. Régler le débit à 20nL/min (PHD-2000 pompe seringue, Holliston, MA), dans des conditions d&#39;écoulement laminaire. </li><li> Vérifiez les microcanaux sous le microscope. </li><li> Lorsque le débit est stable (~ 15 à 20 minutes), QD-FRET médiation devrait être observé dans le centre du chenal. </li><li> Prenez des photos de fluorescence (CCD refroidie, QImaging, BC, Canada) à différents endroits le long du canal. </li><li> Analyser les images de fluorescence avec ImageJ et OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. QD-FRET fournit une indication sensible de l&#39;apparition de l&#39;ADN nanocomplexes auto-assemblage <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-médiée Fluorescence Resonance Energy Transfer (QD-FRET) peut fournir une indication quantitative et très sensible de la stabilité dans les deux environnements Polyplex extra-ou intra-cellulaires, permettant de détecter sans ambiguïté de l&#39;apparition d&#39;interactions entre l&#39;ADN et le porteur du gène. La paire FRET, 605QD et Cy5, a été choisie en fonction de la maximisation chevauchement spectral entre le donneur et l&#39;accepteur et de minimiser le potentiel diaphonie. Pour ce couple, la distance Forster est 69.4Å 3. </li><li> Auto-assemblage de l&#39;ADN nanocomplexes QD-FRET. Anioniques ADN plasmidique (ADNp) et le porteur du gène cationiques ont été marqués avec QD (donneur d&#39;énergie) et Cy5 (énergie accepteur), respectivement. QD-FRET nanocomplexes ont été formées par coacervation complexe électrostatique. Lors d&#39;excitation à 488 nm, QD-FRET médiée Cy5 émission indiquées formation d&#39;un nanocomplex compacte et intacte. Le temps de séjour (t R) peut être calculée en fonction de la distance (x) qui mesure où les deux courants se rencontrent pour la position de la réaction de l&#39;enquête, et la vitesse moyenne d&#39;écoulement (v). En raison de la nature de l&#39;écoulement laminaire, le mélange a lieu seulement à l&#39;interface (centre de chaque image), permettant un calcul précis du transport de masse en fonction de t R. La résolution temporelle peut être ajustée en faisant varier la appliedébits d. (En médaillon) FRET médiée signal a été observée immédiatement à l&#39;interface lorsque les deux ruisseaux réunis, indiquant que la liaison a été rapide, survenant en quelques millisecondes en fonction des débits appliqués. Barre d&#39;échelle: 100 microns. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

<ul><li> Importance de notre travail: <ol><li> C&#39;est la première tentative pour contrôler l&#39;ADN polymérique nanocomplex auto-assemblage cinétiques en temps réel (milliseconde résolution) grâce QD-FRET réponses dans une puce microfluidique simples. </li><li> QD-médiée FRET fournit une indication très sensible et quantitative de l&#39;apparition des interactions moléculaires et tout au long du processus d&#39;auto-assemblage, alors que la microfluidique offre un microenvironnement bien contrôlée spatialement analyser le processus lors de la synthèse nanocomplex ADN. </li><li> L&#39;intégration de la microfluidique et la nanophotonique suggère une approche nouvelle et intéressante pour enquêter sur tout type de réactions de complexation. </li><li> Le résultat QD-FRET nanocomplexes ADN polymères pourrait être facilement appliquée pour l&#39;établissement de relations structure-fonction. 1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>ADN plasmidique</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4,9 kb, MM = 3,3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Labeling Kit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>Le protocole standard donne une efficacité de marquage d’environ un marqueur tous les 20-60 pb d’ADN double brin ; la densité de marquage a été ajustée dans ce travail.</td></tr><tr><td>Streptavidine 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Conjugate</td><td></td></tr><tr><td>Esther de Cy5-NHS</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Chitosane</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>Désacétylée à 83,5 %</td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1 ; Taille : 40 x 22 mm</td></tr><tr><td>Seringue en verre étanche</td><td>Hamilton Co</td><td>Série TLL</td><td>50&amp;#x03BC;L à 500&amp;#x03BC;L selon le volume d'échantillon</td></tr><tr><td>Tuyau Tygon</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0,02 ID, 100 pi</td><td>Tuyaux Tygon Microbore, 0,02 ID, 100 pi</td></tr><tr><td>Connecteur</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Personnalisé en longueur de 0,750&quot;</td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Refroidi intensifié Retiga</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>Lampe à arc au mercure de 100 W</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Version étudiante</td><td></td></tr><tr><td>Jeux de filtres pour microscope</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Filtre d'excitation dans les deux canaux</td></tr><tr><td>Jeux de filtres pour microscope</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Filtre d'émission dans le canal 605QD</td></tr><tr><td>Jeux de filtres pour microscope</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Filtre d'émission dans le canal QD-FRET</td></tr><tr><td>Jeux de filtres pour microscope</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Filtre dichroïque passe-haut dans le canal 605QD</td></tr><tr><td>Jeux de filtres pour microscope</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Filtre dichroïque passe-haut dans le canal QD-FRET</td></tr></tbody></table>

combinant qd-fret et la microfluidique pour surveiller nanocomplex adn auto-assemblage en temps réel

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Les progrès de la génomique continuent d&#39;alimenter le développement de thérapies qui peuvent cibler la pathogenèse au niveau cellulaire et moléculaire. Typiquement fonctionnels à l&#39;intérieur de la cellule, base d&#39;acides nucléiques thérapeutiques nécessitent un système de livraison efficace intracellulaire. Une approche largement adoptée est de l&#39;ADN complexe avec un porteur du gène pour former nanocomplexes via l&#39;auto-assemblage électrostatique, ce qui facilite l&#39;absorption cellulaire de l&#39;ADN tout en le protégeant contre la dégradation. Le défi réside dans la conception rationnelle de porteurs du gène efficace, car prématurée dissociation ou trop contraignantes stables serait préjudiciable à l&#39;absorption cellulaire et l&#39;efficacité thérapeutique. Nanocomplexes synthétisés par mélange en vrac a montré une grande diversité de comportements et le trafic intracellulaire de déballage, qui a été attribuée à l&#39;hétérogénéité de la taille et la stabilité de nanocomplexes. Cette hétérogénéité nuit à l&#39;évaluation précise de la cinétique de l&#39;auto-assemblage et ajoute à la difficulté de corréler leurs propriétés physiques à l&#39;efficacité de la transfection ou bioactivités. Nous présentons une convergence roman de nanophotonique (c.-QD-FRET) et de la microfluidique afin de caractériser les cinétiques en temps réel de l&#39;auto-assemblage nanocomplex sous flux laminaire. QD-FRET fournit une indication très sensible de l&#39;apparition des interactions moléculaires et mesure quantitative tout au long du processus de synthèse, alors que la microfluidique offre un microenvironnement bien contrôlée spatialement analyser le processus avec une résolution temporelle élevée (~ millisecondes). Pour le système modèle de nanocomplexes polymères, deux phases distinctes dans le processus d&#39;auto-assemblage ont été capturés par cette plate-forme analytique. L&#39;aspect cinétique du processus d&#39;auto-assemblage obtenu à l&#39;échelle microscopique serait particulièrement précieuse pour microréacteur basée sur des réactions qui sont pertinentes pour de nombreuses applications micro-et nano-échelle. En outre, nanocomplexes peut être personnalisé grâce à une conception appropriée des appareils microfludic, et le résultat QD-FRET nanocomplexes ADN polymères pourrait être facilement appliquée pour l&#39;établissement de relations structure-fonction.

Nous présentons une intégration novatrice et puissante de la nanophotonique (QD-FRET) et de la microfluidique pour étudier la formation des polyplexes polyélectrolyte, qui est censé fournir un meilleur contrôle et une synthèse des polyplexes uniforme et personnalisables pour base d&#39;acide nucléiques thérapeutiques futures.

Combinant QD-FRET et la microfluidique pour surveiller Nanocomplex ADN auto-assemblage en temps réel

Les progrès de la génomique continuent d'alimenter le développement de thérapies capables de cibler la pathogenèse aux niveaux cellulaire et moléculaire. Généralement...

Cette procédure commence par le marquage de l'ADN et du polymère afin de générer un plasma ADN de type « QD fret pear » où l'ADN est conjugué avec des points quantiques, le donneur d'énergie, et le polymère ionique est marqué avec un colorant organique flora quatre sci cinq, l'accepteur d'énergie.Lors du mélange des QD pour le transfert d'énergie par résonance (FRET), des nano-complexes se forment par auto-assemblage électrostatique, et le signal de FRET médié par les QD peut ensuite être suivi au fur et à mesure que l'interaction se produit. Ce système de FRET utilisant des QD est introduit dans un canal microfluidique où les composants n'interagiront entre eux que par diffusion à l'interface de mélange. L'auto-assemblage du nano-complexe d'ADN peut alors être surveillé grâce à la combinaison du FRET par QD et de la microfluidique.Bonjour, je suis Megan Ho du laboratoire de bios et de dynamique des molécules uniques du Département de génie mécanique de l'Université Johns Hopkins. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de combiner la menace quantique et la microfluidique afin de surveiller l'auto-assemblage de l'ADN en temps réel. Dans notre laboratoire, nous utilisons cette procédure pour étudier les complexes d'ADNL en vue de leur utilisation en thérapie génique.Commençons. Un kit de marquage par la biotine de MIRIs bio est utilisé pour marquer de façon covalente l'ADN plasmatique avec des étiquettes de biotine spécifiques de la guanine, mais à une échelle permettant d'obtenir environ une à deux étiquettes de biotine par molécule d'ADN. Pour commencer, dissoudre la quantité souhaitée d'ADN plasmatique dans un tampon TE afin d'obtenir une solution d'ADN à un microgramme par microlitre.Préparer la réaction de marquage en mélangeant l'ADN plasmatique libre d'ADN et d'ARN, l'eau, le tampon de marquage 10 x A et le réactif de marquage. Le réactif de marquage est ajouté en dernier. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après une heure d'incubation, purifiez l'échantillon marqué par précipitation à l'éthanol. Suivez les protocoles standard. Conservez l'ADN marqué à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation.L'étape suivante consiste à marquer le polymère ionique. Dans cette démonstration, nous utiliserons le chitosane comme polymère ionique modèle et marquerons les amines primaires libres sur l'armature du polymère de chitosane avec sci-fi NHS. Calculez d'abord la quantité nécessaire de scifi NHS de sorte que le rapport molaire de scifi par rapport aux amines primaires soit de un à 200. Cela permettra une conjugaison complète du colorant scifi.Ajouter de l'hydroxyde de sodium à la solution de chitosane dans un tampon acétate 25 millimolaire afin d'ajuster son pH à environ 6,5. Sous agitation lente, ajouter la quantité calculée de sci-fi NHS à la solution de chitosane, goutte à goutte. Couvrir le flacon avec du papier d'aluminium pour maintenir le mélange à l'abri de la lumière et agiter à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, purifier le mélange par dialyse à l’aide d’une membrane de 10 K-M-W-C-O de Pierce, contre un tampon acétate à 1 %, pendant deux heures à température ambiante et à l’abri de la lumière.Après deux heures, remplacer le tampon acétate à 1 % et dialyser pendant deux heures supplémentaires. À température ambiante et à l'abri de la lumière, remplacer à nouveau le tampon et dialyser toute la nuit à quatre degrés Celsius, à l'abri de la lumière. Le lendemain, retirer le polymère marqué purifié de la cassette de dialyse.Le chitosane marqué SCI cinq est ensuite recueilli dans un tube de microcentrifugeuse et conservé à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez les points quantiques fonctionnalisés à la streptavidine 6 0 5 à la solution d'ADN plasmatique biotinylé. Assurez-vous d'utiliser la série ITK de points quantiques décapés destinés à la conjugaison, plutôt que la série ordinaire de points quantiques, car les points quantiques de la série ITK sont conçus pour l'utilisation en transfert d'énergie par résonance (fret).Incuber la solution à température ambiante pendant 15 minutes. Maintenir la réaction de marquage avec les points quantiques à l'abri de la lumière pour éviter un éventuel photoblanchiment. Après 15 minutes, ajouter l'ADN marqué avec des points quantiques à une solution de sulfate de sodium 50 millimolaire afin d'obtenir un volume final de 200 microlitres.Pour préparer le polymère sci-fi, calculez la quantité nécessaire de chitosane pour 10 microgrammes d'ADN plasmatique selon le rapport NP souhaité, qui correspond au rapport théorique entre les groupes amines protonés dans la solution de chitosane et les groupes phosphates négatifs dans la solution d'ADN. Diluez le chitosane sci-fi selon le rapport NP souhaité avec de l'eau Milli Q afin d'obtenir un volume final de 200 microlitres. Les solutions d'ADN marqué aux QD et de chitosane sci-fi sont désormais prêtes à être chargées dans le dispositif microfluidique, comme cela sera démontré dans la section six. La plaquette de silicium est préparée au préalable par un nettoyage au piranha et une étape de séchage au four afin d'éliminer l'humidité présente sur la plaquette pour l'épaisseur maîtresse désignée de 25 micromètres. Appliquez par rotation le photo-résist négatif sur la plaquette de silicium à 2000 tr/min pendant 30 secondes.Faire une cuisson douce de la plaquette sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure jusqu'à 95 degrés Celsius. Cela permettra d'évaporer le solvant dans la résine photosensible SU-8 et de la solidifier avant l'exposition à la lumière UV.Après le pré-cuisson, appliquer un film masque contenant le motif des microcanaux sur la tranche de silicium exposée à la lumière UV à 365 nanomètres pour une dose de 250 millijoules par centimètre carré après l'exposition. Cuire la tranche sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure jusqu'à 95 degrés Celsius. Développer la tranche à l'aide d'un révélateur de résine photosensible SU-8 pour vérifier un développement complet.Immerger la plaquette dans de l'alcool isopropylique. L'alcool isopropylique ne doit pas devenir laiteux. Enfin, pour renforcer la structure en SU-8, effectuer une cuisson durcissante de la plaquette structurée sur une plaque chauffante avec une rampe de 65 degrés Celsius par heure jusqu'à 200 degrés Celsius.Conserver la plaquette à 200 degrés Celsius pendant au moins cinq heures. Ensuite, refroidir progressivement la plaquette jusqu'à la température ambiante. Placer le moule SU huit dans un creuset de pesée.Mélangez l'élastomère de silicone et l'agent de réticulation poly(diméthylsiloxane) ou PDMS dans un rapport de 10 à 1. Versez le mélange de PDMS sur le moule SU-8 et laissez le récipient de pesée dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bulles. Réticulez le PDMS à 65 degrés Celsius pendant une à deux heures.Une fois que le PDMS est polymérisé, décollez la bande de PDMS du moule mère en silicone à l’aide d’un poinçon circulaire, comportant deux entrées de canal et une sortie de canal pour le dispositif fluidique. Nettoyez la bande de PDMS et le verre de couverture avec de l’éthanol, puis laissez sécher à l’air. Traitez la bande de PDMS et le verre de couverture nettoyés avec du plasma d’oxygène à 20 watts.D'abord, liez immédiatement la bande de PDMS avec le couvre-objet. Laissez la puce microfluidique liée dans l'étuve à 95 degrés Celsius pendant la nuit. Le traitement au plasma et la cuisson prolongée sont essentiels pour améliorer la résistance de l'assemblage.Avant de charger les réactifs, remplissez le canal microfluidique avec de l'eau afin de vous assurer qu'aucune bulle n'est présente à l'intérieur. Cela garantira un écoulement régulier. Pendant l'expérience, chargez les solutions de QD préparées précédemment, d'ADN marqué et de chitosane marqué sci-fi dans deux seringues en verre individuelles à travers le tube.Reliez le tube aux deux entrées du dispositif microfluidique. Veillez à ne pas introduire d'air pendant le processus. Réglez le débit à 20 nanolitres par minute en conditions d'écoulement laminaire.Examinez les microcanaux au microscope lorsque l'écoulement est stable, environ 15 à 20 minutes. Le transfert d'énergie par résonance à base de points quantiques (QD) doit être observé au centre du canal. Acquérez des images fluorescentes à différents endroits le long du canal à l'aide d'une caméra CCD refroidie.Analyser ces images avec ImageJ et OriginLab. Le signal médié par la FRET est surveillé à différentes positions axiales le long du canal. Le temps de séjour est calculé à partir du débit appliqué en utilisant cette formule, où la barre TISA correspond au temps de séjour.Le temps X correspond à la distance entre l'endroit où les deux flux se rejoignent et la position de la réaction étudiée. Et V est la vitesse moyenne d'écoulement. Les profils d'intensité en coupe transversale des signaux sci-fi médiés par fret peuvent ensuite être analysés dans notre système.Les profils mesurés expérimentalement présentent une distribution gaussienne. Nous venons de vous montrer comment surveiller les complexes d'ADN en forme de clou par fil quantique interposé dans un simple canal microfluidique. Lors de la réalisation de ces procédures, il est important de se rappeler de concevoir un marqueur sur votre canal microfluidique afin que le temps de séjour puisse être déterminé directement à partir du débit appliqué et de la géométrie du canal.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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Biologie

Droplet plates-formes basées microfluidiques sont des candidats prometteurs pour l'expérimentation à haut débit car ils sont capables de générer picolitres, auto-compartimentées vaisseaux moindre coût aux cadences kHz. Grâce à l'intégration rapide, sensible et haute résolution de fluorescence des méthodes spectroscopiques, les grandes quantités de données générées au sein de ces systèmes peut être efficacement extraite, exploité et utilisé.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

Cette vidéo décrit une méthode permettant de visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des molécules d’ADN à des loci spécifiques à l’aide de l’imagerie à molécule unique. Ces condensats sont formés en raison d’interactions LCD-LCD et LCD-DBD, qui permettent le recrutement de l’ARN polymérase II et l’amélioration de la transcription des gènes.

Imagerie d’une seule molécule pour visualiser l’assemblage de condensats de protéines de fusion sur des rideaux d’ADN

Nous décrivons ici l'instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d'ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

Nous présentons une biopuce microfluidique à base électrochimique-pour la détection d'hybridation d'ADN. Après ssADN sonde fonctionnalisation, la spécificité, la sensibilité et la limite de détection sont étudiées avec des objectifs de ssADN complémentaires et non complémentaires. Les résultats illustrent l'influence des événements d'hybridation d'ADN sur le système électrochimique, avec une limite de détection de 3,8 nM.

Une biopuce microfluidique électrochimique à base d&#39;analyse ADN hybridation Sans étiquette

Nous décrivons un test numérique final pour quantifier les acides nucléiques avec une lecture simplifiée (analogique). Nous mesurons la fluorescence massive de tests numériques basés sur des gouttelettes à l’aide d’une machine qPCR standard plutôt que d’une instrumentation spécialisée et confirmons nos résultats par microscopie.

Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

Nous proposons une technique simple d’auto-assemblage de nanoparticules colloïdales de silice pour créer une jonction nanofluidique entre deux microcanaux en polydiméthylsiloxane (PDMS). À l’aide de cette technique, une membrane de billes nanoporeuses avec une taille de pores allant jusqu’à ~45 nm a été construite à l’intérieur d’un microcanal et appliquée à la préconcentration électrocinétique d’échantillons d’ADN.

Création de sous-50 Nm nanofluidiques Jonctions en PDMS microfluidique Chip via processus d&#39;auto-assemblage des particules colloïdales

Unicellulaire séquençage révèle une hétérogénéité génotypique dans les systèmes biologiques, mais les technologies actuelles n’ont pas le débit nécessaire pour la détermination des caractéristiques profondes de la fonction et la composition de la communauté. Nous décrivons ici un "workflow" microfluidique pour séquençage &gt; 50 000 unicellulaires génomes de diverses populations de cellules.

Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

À l’aide de l’ADN marqué par des points quantiques et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, nous pouvons étudier le mécanisme de réaction des endonucléases de restriction tout en utilisant des protéines non marquées. Cette technique à molécule unique permet d’observer massivement multiplexée les interactions protéine-ADN individuelles, et les données peuvent être regroupées pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies.

Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Ici, nous décrivons l’utilisation de la méthode d’imagerie à molécule unique, les rideaux d’ADN, pour étudier le mécanisme biophysique des condensats EWS-FLI1 assemblés sur l’ADN.

Imagerie à molécule unique de condensats EWS-FLI1 assemblés sur de l’ADN

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Découvrez la combinaison QD-FRET et microfluidique pour surveiller l'auto-assemblage de nanocomplexes ADN en temps réel. Cette méthode améliore la synthèse de polyplexes pour la thérapie génique.

Combinant QD-FRET et la microfluidique pour surveiller Nanocomplex ADN auto-assemblage en temps réel

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