Name: Lisolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Découvrez l'isolation et la culture de cardiomyocytes adultes de rat pour la biologie cardiaque. Cette méthode utilise le transfert de gènes adénoviral et la microscopie confocale pour visualiser les structures cellulaires et étudier la physiologie cardiaque.

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation allemande (DFG) et par l&#39;Institut fédéral pour l&#39;évaluation des risques (BfR, Allemagne).

<ol><li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Molecular+Imaging+II%22">Molecular Imaging II</a>. Licha, K., Lin, C. P. Vol. 7370, SPIE. Bellingham. 737008-737008 (2009).</li>
<li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li>
<li>Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22">Imaging Cellular and Molecular Biological Functions</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. 289-289 (2007).</li>
<li>Kaestner, L., Lipp, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaestner%2C+L+%22Optics+in+Life+Science%22">Optics in Life Science</a>. Popp, J., von Bally, G. Vol. 6633, SPIE. Munich. 66330K-66330K (2007).</li>
<li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+%28shRNA%29+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li>
</ol>

La procédure décrite à l&#39;isolement des cardiomyocytes de rat peut être adapté à d&#39;autres espèces, par exemple la souris 4, si nécessaire. Un paramètre qui doit l&#39;adaptation est le mélange d&#39;enzymes pour la digestion (voir ci-dessous) et aussi la durée de la digestion. Soyez conscient que les cellules de certaines espèces (souris, par exemple) pourrait être plus fragiles que d&#39;autres (chez le rat, par exemple). Le choix de la collagénase est probablement l&#39;é...

<table><tbody><tr><td>Solution d'anesthésie</td><td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td><td></td><td>Mélange de 1 ml d'Ursotamin (100 mg/ml de chlorhydrate de kétamine) et de 240 &amp;#x03BC;l de Rompun (2 % de chlorhydrate de xylazine)</td></tr><tr><td>Solution de citrate</td><td></td><td></td><td>117,64 mg de citrate de sodium dans 10 ml de solution de NaCl à 0,9 %</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1,2 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,2 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 10 mM HEPES, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement</td></tr><tr><td>Solution A+</td><td></td><td></td><td>Contenu de la solution A plus 0,2 mM EGTA, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement</td></tr><tr><td>Solution de libérase</td><td>F. Hoffmann&amp;#8208; La Roche Ltd.</td><td>11988476 001</td><td>500 &amp;#x03BC;l de solution mère dans 15 ml de solution A (solution mère : 10 mg/ml de Liberase Blendzyme 4 dans de l'eau distillée)</td></tr><tr><td>Solution B</td><td></td><td></td><td>Contenu de la solution A plus 200 &amp;#x03BC;M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; et 0,1 % de solution de DNase</td></tr><tr><td>Solution B&lt;sub&gt;1/2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Mélange 1:1 de la solution A et de la solution B</td></tr><tr><td>Solution de DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>La désoxyribonucléase I, de type 2 provenant du pancréas de bovin, 40 KU (15 mg) est dissoute dans 5 ml de tampon Tris&amp;#8208;HCl 10 mM, ajusté à pH = 7,35, composition supplémentaire : 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM dithio&amp;#8211;thréitol ; cette solution est mélangée avec 5 ml de glycérol</td></tr><tr><td>Solution de protéine de matrice extracellulaire (ECM)</td><td>Solution de protéine de matrice extracellulaire (ECM)</td><td>E1270</td><td>1 ml de solution mère tel qu'acheté est dilué avec 6 ml de milieu M199</td></tr><tr><td>Milieu de culture M199</td><td>PAA Laboratories</td><td>E15&amp;#8208;834</td><td>Milieu M199 supplémenté avec 1 &amp;#x03BC;l/ml de solution ITS et 20 &amp;#x03BC;l/ml de solution de pénicilline&amp;#8208;streptomycine (5000 unités/ml)</td></tr><tr><td>Solution ITS</td><td></td><td></td><td>25 mg d'insuline, 25 mg de transferrine et 50 &amp;#x03BC;l de solution mère de sélénite sont dissous dans 5 ml d'eau distillée (solution mère : 0,5 mg/ml de sélénite de sodium dans de l'eau distillée). Ajouter quelques gouttes de HCl 1 M jusqu'à obtention d'une solution limpide. Des aliquotes peuvent être congelées.</td></tr><tr><td>Tyrode</td><td></td><td></td><td>135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH ajusté à 7,35 à l'aide de NaOH 10 M, filtrée stérilement</td></tr><tr><td>Mélange maître</td><td></td><td></td><td>5 &amp;#x03BC;l de tampon 10&amp;#215;PCR&amp;#8208;, 5 &amp;#x03BC;l de MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25 mM), 2 &amp;#x03BC;l d'amorce sens, 2 &amp;#x03BC;l d'amorce antisens, 1 &amp;#x03BC;l de dNTP&amp;#180;s (10 mM chacun), 33 &amp;#x03BC;l de H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 &amp;#x03BC;l de DMSO, 1 &amp;#x03BC;l de polymérase Taq&amp;#8208;ADN par échantillon</td></tr><tr><td>Milieu LB&amp;#8208;</td><td></td><td></td><td>10 g/l de tryptone, 5 g/l d'extrait de levure, 5 g/l de NaCl (et 15 g/l d'agar si utilisé comme milieu solide), pH 7,0</td></tr><tr><td>Pac I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td>Préparation : 50 &amp;#x03BC;g d'ADN, 5 &amp;#x03BC;l de tampon 10&amp;#215;, 0,5 &amp;#x03BC;l de BSA 100&amp;#215;, 0,75 &amp;#x03BC;l de Pac I, compléter avec de l'H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O jusqu'à un volume final de 50&amp;#x03BC;l</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Myocytes cardiaques isolés de cœur adulte sont largement acceptés comme un modèle, quelque part à mi-chemin entre les cellules musculaires embryonnaires et néonatales d&#39;un côté et un cœur travaille sur l&#39;autre. Ainsi, les cardiomyocytes servir de bons modèles pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, des enquêtes pharmaceutique ainsi que pour l&#39;exploration de modèles animaux transgéniques. Nous décrivons ici une méthode d&#39;isoler les cellules du cœur. En outre, nous montrons comment une manipulation génétique sur les myocytes cardiaques peuvent être effectuées sans l&#39;élevage d&#39;un animal transgénique: C&#39;est la combinaison de la culture à long terme (1 semaine) et le transfert de gènes adénoviraux. Ce dernier est décrit par la construction du virus de la transduction des cellules. Il peut être utilisé pour l&#39;expression de biocapteurs génétiquement codés (ADB), protéines de fusion fluorescentes, mais aussi pour la protéine sur l&#39;expression et la régulation négative, par exemple en utilisant l&#39;ARNi. Ici, nous fournir un exemple pour l&#39;expression d&#39;une protéine de fusion coloration d&#39;une structure subcellulaire (Golgi). L&#39;expression des protéines peuvent être visualisées par l&#39;imagerie confocale de z-piles pour une reconstruction 3D des structures subcellulaires. Le protocole comprend l&#39;état de l&#39;art dans la culture cellulaire, biologie moléculaire et de biophysique et fournit ainsi une méthode pour explorer de nouveaux horizons en cardiologie cellulaire.

Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d&#39;animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d&#39;enquêtes cellulaires par microscopie confocale.

L&#39;isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

Les myocytes cardiaques isolés à partir de cœurs adultes sont largement acceptés comme un modèle se situant à mi-chemin entre, d'une part, les cellules musculaires embryonnaires et néonatales et, d'autre part...

La procédure commence par l'extraction du cœur de rats adultes. Le cœur est digéré et des cardiomyocytes individuels sont isolés. Les cellules isolées sont mises en culture.Le transfert génique par adénovirus conduit à l'expression de protéines de fusion fluorescentes ou de biosenseurs génétiquement codés. Les cardiomyocytes exprimant la protéine rapporteur sont visualisés par microscopie confocale et analysés ultérieurement. Bonjour, je suis Kain de l'Institut de biologie cellulaire moléculaire de la faculté de médecine de l'Université Sland. Je suis Lars, également de l'Institut de biologie cellulaire moléculaire, et je suis Uncle du même laboratoire.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'isolement de myocytes cardiaques, de transduction avec des protéines de fusion fluorescentes ou des biocapteurs génétiquement codés, ainsi que la procédure d'imagerie confocale précédente. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la physiologie, la physiopathologie et la pharmacologie cardiaques au niveau cellulaire. Commençons donc.Pour commencer cette procédure, préparez un dispositif de perfusion LOR, préparez et remplissez toutes les solutions, puis

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Nous décrivons ici l'isolement de cardiomyoctyes de souris adultes en utilisant un système de perfusion de Langendorff. Les cellules résultantes sont des ions Ca2 + à tolérance de repos électriquement et peuvent être cultivées et transfectées avec l'adénovirus ou de lentivirus de manipuler l'expression génique. Leur fonctionnalité peut également être analysé en utilisant le système MMSYS et techniques de patch-clamp.

Isolement, culture et caractérisation fonctionnelle des adultes Cardiomyoctyes souris

Des cardiomyocytes individuels de souris de type sauvage et mutantes peuvent être isolés du cœur afin d’étudier leur contractilité et leurs transitoires calciques. Cela permet de caractériser la contribution du dysfonctionnement cellulaire au dysfonctionnement cardiaque, quelle qu’en soit la cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.

Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrophie cardiaque

Dans les myocytes cardiaques, les structures membranaires tubulaires forment des réseaux intracellulaires. Nous décrivons les protocoles pour i) l'isolement des myocytes du cœur de souris, y compris le contrôle de qualité, ii) la coloration de cellules vivantes pour la microscopie de fluorescence état-of-the-art optimisé, et iii) l'analyse d'image directe de quantifier la complexité des composants et la plasticité de la membrane intracellulaire réseaux.

Analyse de la membrane tubulaire Networks cardiaque myocytes de oreillettes et les ventricules

Ce protocole décrit une méthode étape par étape pour l’isolement reproductible et la culture à long terme de cardiomyocytes de souris adultes avec un rendement, une pureté et une viabilité élevés.

L&#39;isolement, la culture et la transduction des adultes cardiomyocytes souris

Ce protocole est utilisé pour isoler les cardiomyocytes auriculaires simples du cœur adulte de souris en utilisant une approche de digestion de morceau. Cette approche est utilisée pour isoler les myocytes auriculaires de droite ou de gauche qui peuvent être utilisés pour caractériser l'électrophysiologie du myocyte auriculaire dans les études de patch-clamp.

Isolement des myocytes auriculaires des souris adultes

Nous présentons la méthodologie pour l'isolement des myocytes murines et comment obtenir des traces de tension ou de calcium simultanément avec des traces de raccourcissement sarcome à l'aide de la photométrie fluorescence avec des mesures numériques simultanées de géométrie cellulaire.

Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

Le but de ce travail est de développer une méthode pour isoler de façon reproductiblement les cardiomyocytes du cœur adulte et mesurer la teneur en ADN et la nucléation.

Isolement des cardiomyocytes des coeurs fixes pour l’immunocytochimie et l’analyse de ploy

Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

Ce protocole décrit les modifications de la méthode de Langendorff, y compris la profondeur de la canulation de l’aorte pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes.

Modifications de la méthode de Langendorff pour l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires de souris adultes

L’étalon-or en cardiologie pour les expériences fonctionnelles cellulaires et moléculaires sont les cardiomyocytes. Cet article décrit les adaptations à la technique non-Langendorff pour isoler les cardiomyocytes de souris.

Une méthode simple et efficace pour isoler systématiquement les cardiomyocytes de souris

Découvrez l'isolation et la culture de cardiomyocytes adultes de rat pour la biologie cardiaque. Cette méthode utilise le transfert de gènes adénoviral et la microscopie confocale pour visualiser les structures cellulaires et étudier la physiologie cardiaque.

L'isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale

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