Obtention d'ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Cette procédure commence par la coupe de blocs de tissu congelés à la vapeur d'azote liquide de huit micromètres sur un cryostat réglé à moins 17 degrés Celsius, déposés sur des lames de verre planes non chargées. Ensuite, les sections sont colorées avec le kit de coloration histo gene. Après identification des neurones pyramidaux, environ 500 cellules sont capturées au laser sur le capuchon de capture HS.

Le capuchon contenant les cellules est placé dans un tube de microcentrifugeuse contenant 50 microlitres de tampon d'extraction, retourné et mis dans un tube Falcon préalablement positionné en Irak, immergé dans un bain-marie réglé à 42 degrés Celsius. Après une courte étape de centrifugation, le capuchon est retiré. La solution restante est ensuite prête pour l'isolement de l'ARN.

Bonjour, je suis Charmaine Peterson du laboratoire de Wilson Wu, du Département de neurosciences structurales et moléculaires de l'hôpital McLean. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure de capture au laser de neurones paramédians à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l'expression différentielle des gènes dans le gyrus supérieur et le gyrus pauvre de sujets atteints de schizophrénie, à l'aide de la technologie des puces à ADN.

Commençons. Les tissus cérébraux ont été obtenus auprès du Harvard Brain Tissue Resource Center sous forme de blocs congelés dans la vapeur d'azote liquide avant la sectionnement du tissu. Il est important de réduire au minimum la contamination par les ARN sur toutes les surfaces ; ainsi, la zone de travail, la lame de sectionnement et les lames porte-objets sont traitées avec une solution de décontamination de l'ARN, telle que l'ARN SAP, puis essuyées avec de l'éthanol à 100 %.

Cette procédure commence par la coupe de blocs de tissu congelés par vapeur d'azote liquide sur un cryostat réglé à moins 17 degrés Celsius, directement sur des lames en verre ordinaires non chargées. Les coupes de tissu sont désormais prêtes pour l'identification des neurones pyramidaux à l'aide du kit de coloration rapide histo gene. Préparez la série de déshydratation à l'éthanol en aliquotant 25 millilitres des concentrations d'éthanol appropriées et d'eau sans ARN dans les bocaux de coloration fournis avec le kit histo gene.

Placer tous les bocaux dans un seau à glace, sauf un bocal contenant de l'éthanol à 75 %. Placer ce bocal d'éthanol à 75 % dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparer la solution de coloration en ajoutant un microlitre d'inhibiteur d'ARN par 100 microlitres de solution de coloration.

Étant donné que nous allons colorer quatre sections tissulaires sur deux lames, quatre microlitres d'inhibiteur d'ARN sont ajoutés à 400 microlitres de la solution de coloration dans un tube microcentrifuge. Conservez la solution de coloration sur de la glace. Sous une hotte aspirante.

Ajoutez des tamis moléculaires dans le bocal de xylène pour éliminer l'excès d'eau, qui pourrait compromettre le soulèvement des tissus. Allumez le bain-marie et réglez la température à 42 degrés Celsius, puis placez un tube Falcon de 50 millilitres, maintenu par un support, dans le bain-marie. Sortez deux lames du congélateur à moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler sur une lingette Kim.

Pendant environ 30 secondes, ou juste jusqu'à ce que les coins des lames commencent à dégeler, fixer brièvement le tissu dans de l'éthanol à 75 % pendant 30 secondes dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide de pinces sans ARN, transférer les lames dans de l’eau sans nucléase pour un rinçage de 32 secondes. Après le rinçage des lames, délimiter les sections à l’aide d’un stylo hydrofuge (PAP pen) afin de concentrer la solution de coloration sur la section. Colorer les quatre sections avec la solution de coloration histo gene pendant 20 secondes. À raison de 97 microlitres du colorant/slash inhibiteur d'ARN par section, déshydrater les sections dans l’éthanol préparé au préalable et placé sur de la glace, pendant 30 secondes par étape.

L'étape finale avec de l'éthanol à 100 % doit être prolongée à trois minutes afin d'obtenir une déshydratation suffisante pour un bon soulèvement du tissu. Enfin, immergez les lames dans le xylène pendant cinq minutes, puis laissez-les sécher à l'air libre complètement avant de passer à la microdissection par capture laser ; les neurones pyramidaux doivent être prélevés immédiatement après la coloration, dans le cadre de la procédure de capture laser monocellulaire. La MICRODISSECTION ou LCM nécessite un bain-marie à 42 degrés Celsius contenant un tube Falcon de 50 millilitres maintenu par un support, préalablement mis en place.

La microdissection laser assistée par cellule unique est réalisée à l’aide du système et du logiciel de capture laser ARCTURUS XT. Pour commencer cette procédure, chargez les lames et les capuchons sur l’appareil arcturus XT. Utilisez les capuchons de capture HS, mais conservez le paramètre du programme sur macro.

Cliquez sur la case « load with overview » pour obtenir une image d'ensemble de chaque lame. Ajustez la netteté et la luminosité à un grossissement de deux fois pour déterminer la section optimale pour la capture laser. Évitez les sections de tissu présentant des plis excessifs, mais choisissez celles qui sont intactes, lisses et colorées.

Placez un capuchon au-dessus de la zone générale où vous effectuerez la capture, en veillant à inclure la zone à capturer dans notre cas, la couche III du cortex. Assurez-vous que les rails du capuchon ne reposent sur aucun pli, car cela inclinerait le capuchon et entraînerait des tailles de points variables.

Ensuite, confirmez manuellement la position du point du laser infrarouge avec un grossissement de 40 x. La croix bleue doit être centrée dans le point du laser infrarouge. Sinon, ajustez sa position en cliquant avec le bouton droit sur le point et en sélectionnant « Localiser le point IR ».

Avec un grossissement de 40 x, identifier les neurones pyramidaux selon les critères suivants : premièrement, les cellules doivent présenter une forme pyramidale ; deuxièmement, la portion proximale des dendrites apicales et/ou basales doit être identifiable. Enregistrez la position du capillaire en cliquant sur le signe plus dans la fonction de position. Ainsi, si le capillaire est déplacé, il reviendra toujours exactement au même emplacement pour lequel vous avez ajusté la taille du spot.

Saisissez ces valeurs dans la boîte de contrôle : 70 pour la puissance et 16 pour la durée. Étant donné que ces paramètres sont spécifiques à notre tissu, nous vous recommandons de tester et d'ajuster ces variables en fonction de votre échantillon de tissu particulier avant de commencer. Lors de la capture laser de cellules individuelles, désactivez l'option de déplacement automatique de la platine et assurez-vous que le symbole de la bonne taille correspond au symbole sur le panneau de droite.

Sélectionnez l'option cercle en bas à droite pour choisir un neurone dont vous souhaitez tester la capture. Après avoir aligné la croix bleue avec le cercle, activez le laser en cliquant sur le point infrarouge de test. La tache produite par le laser doit d'abord présenter un anneau sombre net autour de l'objet capturé.

Veillez à ce que l'anneau soit suffisamment grand pour englober la cellule, mais assez petit pour ne pas inclure de tissu indésirable ou d'autres cellules. Si cet anneau est trop clair, la cellule n’a pas été capturée. S’il y a un point sombre au centre de l’anneau foncé, alors l’intensité ou la durée du laser est trop élevée.

Répétez ce processus sur différentes parties du tissu dans la couche que vous souhaitez capturer. Ajustez en conséquence pour vérifier que la taille du spot ne varie pas selon l'emplacement. Identifiez les neurones pyramidaux à capturer, environ 500 cellules.

Appuyez sur le bouton de capture laser pour capturer les cellules. Déplacez le capot vers la station de contrôle qualité. Assurez-vous qu'au moins 90 % des neurones ont été retirés.

Sinon, capturez davantage de cellules dans la zone où la majorité des cellules ont été capturées. Placez le bouchon dans un tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre contenant 50 microlitres de tampon d'extraction. Le bouchon a été conçu pour s'ajuster parfaitement afin d'empêcher toute fuite du tampon.

Retournez l'ensemble, en veillant à ce que le tampon d'extraction recouvre entièrement le bouchon, puis placez-le au fond d'un tube Falcon de 50 millilitres dans un bain-marie réglé à 42 degrés Celsius. Incubez les neurones pendant 30 minutes afin de détacher le tissu du bouchon ; après l'incubation, centrifugez l'ensemble tube et bouchon pendant deux minutes à 800 gs. Après la centrifugation, retirez le bouchon.

Si l'isolement de l'ARN doit être effectué ultérieurement uniquement, conserver l'extrait cellulaire restant à moins 80 degrés Celsius. Sinon, procéder à l'isolement de l'ARN à partir de l'extrait cellulaire comme indiqué dans la section suivante. L'isolement de l'ARN est réalisé à l'aide du kit d'isolement PICO pure, conçu pour isoler de petits nombres de cellules à partir d'échantillons de MAC et pour conserver les ARNm peu abondants.

Pour commencer cette procédure, ajouter l'éthanol à 70 % fourni avec le kit à l'extrait cellulaire et centrifuger sur une colonne de purification préparée. Afin de lier l'ARN au filtre de la colonne après lavage, traiter l'ARN avec de la D Ns pour éliminer le risque d'interférence par l'ADN. Cette étape est particulièrement importante dans les applications en aval telles que la R-T-P-C-R en temps réel.

Après la digestion de l'ADN, ajouter 40 microlitres du tampon de lavage un et centrifuger la colonne de purification pendant 15 secondes à 8 000 G. Ensuite, poursuivre les lavages conformément au protocole fourni avec le kit, mais prolonger l'étape finale de lavage avec le tampon de lavage deux de deux à deux minutes et demie afin de s'assurer qu'aucun résidu de tampon de lavage ne demeure dans la colonne, ce qui pourrait réduire le rendement en ARN. Transférer la colonne dans un autre tube de microcentrifugeuse. Ajouter le tampon d'élution et incuber sur le filtre dans la colonne pendant une minute, puis centrifuger la colonne pour éluer l'ARN.

Enfin, vérifiez la qualité de l'ARN extrait en utilisant une puce Experian High Sense, qui fournit un gel virtuel et un électrophérogramme : pipetez 1,3 microlitre de l'échantillon dans un tube de 0,5 millilitre. Pour le contrôle qualité, congélez le reste de l'échantillon à moins 80 degrés Celsius. Une fois la qualité de l'ARN vérifiée, celui-ci peut être amplifié, marqué et hybridé.

Pour l'analyse de profilage de l'expression génique, deux cycles d'amplification linéaire seront effectués à l'aide du kit ribo amp HS plus, ce qui devrait produire environ 50 microgrammes d'ARN amplifié, quantité suffisante pour réaliser à la fois des expériences de puces à ADN et de Q-R-T-P-C-R. Le kit de marquage turbo biotine et le marquage provenant de molecular devices sont utilisés pour marquer l'ARN amplifié. Enfin, le profilage de l'expression génique sera réalisé à l'aide de la puce à gènes human X three P gene chip pro beret d'atrix.

La coupe des tissus doit produire deux lames, chacune portant deux sections, soit quatre sections au total par cas. Chaque section doit être lisse, avec un minimum de déchirures, de fissures ou de plis. Les neurones pyramidaux doivent être fortement colorés, mesurer environ 20 à 25 micromètres, présenter une forme pyramidale et posséder des dendrites apicales visibles.

Lors de la MLC, après que le laser a traversé le film thermoplastique, les cellules adhèrent au capuchon et ne se trouvent donc plus sur la lame, laissant les tissus environnants. Environ 85 à 100 % des neurones devraient adhérer au capuchon avec les capuchons de capture HS en réglage macro et un ajustement correct de la puissance et de l'intensité du laser. Pour chaque section, vous devriez obtenir environ 500 à 700 cellules par section, ce qui donne au moins 500 picogrammes d'ARN total par échantillon.

Après l'isolement de l'ARN total, la qualité de l'ARN est évaluée à l'aide d'un électrophérogramme et d'un gel virtuel à l'aide du BioRad Experian. Sur l'électrophérogramme, on doit observer deux pics distincts correspondant aux unités d'ARN ribosomique 18 s et 20 a s avec les tissus post-mortem. Toutefois, ce n'est pas toujours le cas, car le tissu peut être dégradé en raison de facteurs antérieurs à la section.

Vous observerez normalement une grande bosse indiquant une dégradation, avec un pic important vers 18 s et un pic plus petit à 28 s, comme indiqué par les flèches rouges. En revanche, un ARN de mauvaise qualité, trop dégradé, sera indiqué par un électrophérogramme présentant une grande surface sous la courbe. En complément d'un décalage vers le bas de la position de l'étalement pour tester la qualité de l'ARNm après deux cycles d'amplification linéaire, nous utilisons à la fois la puce standard BioRad Experian Sense lab et le spectrophotomètre NanoDrop.

La technologie traditionnelle de puces à ADN Atrics exige que l'amplicon d'ARNm ait une longueur d'au moins 600 nucléotides pour être détecté selon ce protocole. L'amplicon d'ARNm a atteint la plage des 1000 nucléotides, comme indiqué par l'électrophérogramme présentant de grands pics qui diminuent progressivement en fonction du temps. Ce résultat est également confirmé par le gel virtuel.

Si les longueurs des transcrits sont inférieures à 600 nucléotides, l'échantillon ne doit pas être inclus. Pour l'hybridation, les mesures réalisées avec le NanoDrop ont indiqué un rapport moyen de 260 sur 280, ou pureté, de 2,5 entre les échantillons. La concentration moyenne était de 1,7 microgrammes par microlitre, ce qui correspond à environ 50 microgrammes d'ARNm par échantillon, une quantité suffisante pour une analyse par puces à ADN et pour une validation ultérieure, nécessitant entre 15 et 20 microgrammes d'ARNm ainsi qu'une validation des résultats par RT-PCR quantitative. Nos résultats indiquent qu'avec ce protocole, la quantité et la qualité de l'ARN obtenu sont suffisantes pour étudier les différences d'expression génique à l'aide de la puce Atrix Human X3P.

Après hybridation à la puce Atrics Human X three P, nous avons obtenu des pourcentages d'appels en moyenne de 26,6 %, indiquant une hybridation adéquate et des intensités de sondes satisfaisantes. Nous venons de vous montrer comment capturer au laser des neurones paramétaux à partir de tissu cérébral humain post-mortem afin d'utiliser l'ARN obtenu à partir de ces cellules. Pour les études de profilage par microarray G, lors de cette procédure, il est important d'effectuer toutes les étapes dans un environnement exempt de RNAses et de les réaliser dans les délais appropriés afin de préserver l'intégrité de l'ARN.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.