Obtention d'ARN de haute qualité provenant des populations cellule unique de tissus post-mortem du cerveau de l'homme

Nous décrivons un processus utilisant le laser capture microdissection d'isoler et d'extraire l'ARN à partir d'une population cellulaire homogène, les neurones pyramidaux, dans la couche III du gyrus temporal supérieur dans les cerveaux post-mortem humain. Nous avons ensuite linéairement amplifier (T7-based) ARNm, et s'hybrident l'échantillon à la puce Affymetrix humaines X3P.

Cette procédure commence par la coupe de blocs de tissus congelés à la vapeur d’azote liquide de huit micromètres sur un cryostat réglé à moins 17 degrés Celsius sur des lames de verre non chargées. Ensuite, les sections sont colorées avec le kit de coloration du gène histo. Après avoir identifié les neurones pyramidaux, environ 500 cellules sont capturées au laser sur le capuchon de capture HS.

Le capuchon avec cellules est placé dans un micro-tube de centrifugation contenant 50 microlitres de tampon d’extraction retourné et placé dans un tube Falcon précédemment positionné en Irak, assis dans un bain-marie réglé à 42 degrés Celsius. Après une courte étape de centrifugation, le capuchon est retiré. La solution restante est alors prête pour l’isolement de l’ARN.

Bonjour, je m’appelle Charmaine Peterson et je travaille dans le laboratoire de Wilson Wu au Département de neurosciences structurelles et moléculaires de l’Hôpital McLean. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure de capture laser de neurones paramétalliques à partir de tissus cérébraux humains post-mortem. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier l’expression différentielle des gènes dans le gyrus supérieur et le gyrus inférieur de sujets schizophrènes à l’aide de la technologie des microréseaux.

Alors commençons. Des tissus cérébraux ont été obtenus du Harvard Brain Tissue Resource Center sous forme de blocs congelés de vapeur d’azote liquide avant la section des tissus. Il est important de réduire la contamination par les ARN : toutes les surfaces, y compris la zone de travail, la lame de sectionnement et les lames, sont traitées avec une solution de décontamination à l’ARN, telle que l’ARN SAP, et essuyées avec de l’éthanol à 100 %.

Cette procédure commence par la section de blocs de tissus congelés à la vapeur d’azote liquide sur un cryostat réglé à moins 17 degrés Celsius sur des lames de verre non chargées. Les coupes de tissus sont maintenant prêtes pour l’identification des neurones pyramidaux à l’aide du kit de coloration rapide du gène histo. Préparez la série de déshydratation à l’éthanol en aliquote 25 millilitres des concentrations d’éthanol appropriées et de l’eau sans ARN dans les bocaux de coloration fournis avec le kit de gène histo.

Placez tous les bocaux dans un seau à glace à l’exception d’un bocal à 75 % d’éthanol. Placez cet éthanol à 75 % dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparez la solution de coloration en ajoutant un microlitre d’inhibiteur d’ARN pour 100 microlitres de solution de coloration.

Comme nous allons colorer quatre sections de tissu sur deux lames, quatre microlitres d’inhibiteur d’ARN sont ajoutés à 400 microlitres de solution de coloration dans un microtube à centrifuger. Gardez la solution de coloration sur de la glace. Sous une hotte.

Ajoutez des tamis moléculaires dans le pot de xylène pour éliminer l’excès d’eau, ce qui pourrait compromettre le soulèvement des tissus. Allumez le bain-marie avec la température réglée sur 42 degrés Celsius et placez un tube Falcon de 50 millilitres soutenu par une grille dans le bain-marie. Retirez deux lames du congélateur à moins 80 degrés Celsius et décongelez-les sur une lingette Kim

Pendant environ 30 secondes ou jusqu’à ce que les coins des lames commencent à décongeler, fixez brièvement le mouchoir dans l’éthanol à 75 % pendant 30 secondes dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide d’une pince sans ARN, transférez les lames dans de l’eau sans nucléase pour un 32e lavage Après que les lames ont été lavées, tracez les sections avec un stylo barrière PAP pour concentrer la solution de coloration sur la section colorez les quatre sections avec la solution de coloration du gène histo pendant 20 secondes. Avec 97 microlitres d’inhibiteur d’ARN de coloration par section, déshydratez les sections dans l’éthanol préalablement préparé sur de la glace pendant 30 secondes par étape.

L’étape finale à 100 % éthanol doit être prolongée à trois minutes pour obtenir une déshydratation suffisante pour un lifting adéquat des tissus. Enfin, plongez les lames dans du xylène pendant cinq minutes, en laissant les lames sécher complètement à l’air libre avant de procéder à la microdissection par capture laser, les neurones pyramidaux doivent être immédiatement retirés après la coloration de la procédure de capture laser de cellule unique. La MICRODISSECTION ou LCM nécessite un bain-marie à 42 degrés Celsius contenant un tube Falcon de 50 millilitres soutenu par un tube mis en place précédemment.

Le LCM à cellule unique est réalisé à l’aide du système et du logiciel de capture laser ARCTURUS XT. Pour commencer cette procédure, chargez les lames et les capuchons sur l’appareil arcturus XT. Utilisez les capuchons HS de capture, mais gardez le paramètre du programme sur macro.

Cliquez sur la boîte de chargement avec vue d’ensemble pour obtenir une photo d’ensemble de chaque diapositive. Ajustez la mise au point de la luminosité à un grossissement de deux x pour déterminer la section optimale pour la capture laser. Évitez les sections de tissus avec un pliage excessif, mais choisissez des sections intactes, lisses et tachées.

Placez un capuchon sur la zone générale où vous allez capturer, en vous assurant d’inclure la zone à capturer dans notre cas. Couche trois du cortex. Assurez-vous que les rails du capuchon ne reposent sur aucun pli, car cela inclinerait le capuchon, ce qui entraînerait des tailles de spot variables.

Ensuite, confirmez manuellement l’emplacement du point laser IR à un grossissement de 40 x. La croix bleue doit être centrée dans le spot laser IR. Si ce n’est pas le cas, ajustez son emplacement en faisant un clic droit sur l’endroit et en sélectionnant le point IR localisé.

À un grossissement de 40 x, identifiez les neurones pyramidaux selon les critères suivants, l’un qui cellule notre forme pyramidale et l’autre, la partie proximale des dendrites apicales et/ou basales sont identifiables. Enregistrez la position du capuchon en cliquant sur le signe plus dans la fonction de position. De cette façon, si le capuchon est déplacé, il reviendra toujours exactement au même endroit pour lequel vous avez ajusté la taille du spot.

Entrez ces valeurs dans le boîtier de commande : 70 dans la puissance et 16 dans la durée. Comme ces paramètres sont spécifiques à nos tissus, nous vous recommandons de tester et d’ajuster ces variables en fonction de votre échantillon de tissu spécifique avant de commencer. Avec la capture laser de cellules individuelles, décochez l’option de déplacement automatique de la scène et assurez-vous que le symbole de la bonne taille correspond au symbole sur le panneau de droite.

Sélectionnez l’option cercle en bas à droite pour sélectionner un neurone dont vous souhaitez tester la capture. Et après avoir aligné la croix bleue avec le cercle, activez le laser en cliquant sur tester le point IR. Le point créé par le laser doit d’abord avoir un anneau sombre net autour de l’objet capturé.

Assurez-vous que l’anneau est assez grand pour englober la cellule, mais assez petit pour ne pas inclure de tissus indésirables ou d’autres cellules. Si cet anneau est trop léger, la cellule n’a pas été capturée. S’il y a une tache sombre au milieu de l’anneau sombre, la durée de la barre oblique du laser est trop importante.

Répétez ce processus sur différentes parties du tissu à l’intérieur de la couche que vous souhaitez capturer. Pour vérifier que la taille du spot ne diffère pas selon l’emplacement, ajustez en conséquence. Identifier les neurones pyramidaux pour capturer environ 500 cellules.

Appuyez sur le bouton de capture laser pour capturer les cellules. Déplacez le capuchon vers la station de contrôle qualité. Assurez-vous qu’au moins 90 % des neurones ont été retirés.

Si ce n’est pas le cas, capturez plus de cellules dans la zone où la plupart des cellules ont été capturées. Placez le capuchon dans un microtube à centrifuger de 0,5 millilitre contenant 50 microlitres de tampon d’extraction. Le capuchon a été conçu pour s’adapter parfaitement afin d’éviter les fuites du tampon.

Retournez l’ensemble en vous assurant que le tampon d’extraction recouvre tout le capuchon et placez-le au fond du tube Falcon de 50 millilitres dans le bain-marie réglé à 42 degrés Celsius. Incuber les neurones pendant 30 minutes pour retirer le tissu de la coiffe après l’incubation, centrifuger l’ensemble tube et capuchon pendant deux minutes à 800 g. Après la centrifugation, retirez le bouchon.

Si l’isolement de l’ARN ne sera effectué que plus tard. Conservez l’extrait cellulaire restant à moins 80 degrés Celsius. Sinon, procédez à l’isolement de l’ARN à partir de l’extrait cellulaire comme indiqué dans la section suivante, l’isolement de l’ARN est effectué à l’aide du kit d’isolement pur PICO, qui est conçu pour isoler un petit nombre de cellules à partir d’échantillons de LCM et pour conserver l’ARNm de faible abondance.

Pour commencer cette procédure, ajoutez 70 % d’éthanol fourni avec le kit à l’extrait de cellule et centrifugez-le sur une colonne de purification préconditionnée. Afin de lier l’ARN au filtre de la colonne après le lavage, traitez l’ARN avec des D Ns pour éliminer le risque d’interférence de l’ADN. Cette étape est particulièrement importante dans les applications en aval telles que le R-T-P-C-R en temps réel.

Après la digestion de l’ADN, ajoutez 40 microlitres de tampon de lavage un et centrifugez la colonne de purification pendant 15 secondes à 8 000 G.Ensuite, procédez aux lavages selon le protocole fourni avec le kit, mais prolongez l’étape finale de lavage avec le tampon de lavage deux de deux à deux minutes et demie pour vous assurer qu’aucun tampon de lavage ne reste dans la colonne, ce qui peut réduire votre rendement en ARN. Transférez la colonne dans un autre micro tube à centrifuger. Ajouter le tampon elucian et incuber sur le filtre dans la colonne pendant une minute, centrifuger la colonne pour éluer l’ARN.

Enfin, vérifiez la qualité de l’ARN extrait en exécutant une puce de laboratoire Experian High Sense, qui fournit une pipette virtuelle de gel et d’électrophérogramme de 1,3 microlitre de l’échantillon dans un tube de 0,5 millilitre. Pour le test de contrôle de la qualité, congelez le reste de l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Une fois que la qualité de l’ARN est vérifiée, il peut être amplifié, marqué et hybridé.

Pour l’analyse du profilage de l’expression génique, deux cycles d’amplification linéaire seront effectués avec le kit ribo amp HS plus, ce qui devrait donner environ 50 microgrammes d’ARN amplifié suffisant pour la performance des expériences de microréseau et de Q-R-T-P-C-R. Le kit de marquage à la biotine turbo et le marquage à partir de dispositifs moléculaires sont utilisés pour marquer l’ARN amplifié. Enfin, un profilage de l’expression génique à l’aide de la puce génétique humaine X three P pro beret d’atrix sera effectué.

La section tissulaire doit aboutir à deux lames avec deux sections par lame, quatre sections au total par cas. Chaque section doit être lisse avec un minimum de déchirures, de fissures ou de plis. Les neurones pyramidaux doivent être colorés en noir d’une taille d’environ 20 à 25 micromètres avec une forme pyramidale et des dendrites apicales visibles.

Pendant le LCM, après que le laser a pulsé à travers le film thermoplastique, les cellules adhèrent au capuchon et ne sont donc plus sur la lame, laissant les tissus environnants. Derrière, environ 85 à 100 % des neurones doivent adhérer à la coiffe avec les capuchons HS de capture aux paramètres macro et au réglage correct de la puissance et de la force du laser. Pour chaque section, vous devriez obtenir environ 500 à 700 cellules par section, ce qui donne au moins 500 picogrammes d’ARN total par cas.

Après l’isolement total de l’ARN, la qualité de l’ARN est évaluée au moyen d’un électrophégramme et d’un gel virtuel via le BioRad Experian. Dans l’électrophérogramme, vous devriez voir deux pics distincts correspondant aux unités d’ARN ribosomique 18 s et 20 a s avec du tissu post-mortem. Cependant, ce n’est pas toujours le cas car le tissu peut être dégradé en raison de facteurs antérieurs à la section.

Vous verrez normalement une grande bosse indiquant une dégradation avec un grand pic d’environ 18 s et un pic plus petit de 28 s, comme l’indiquent les flèches rouges. En revanche, un ARN de mauvaise qualité avec une dégradation trop importante sera indiqué par un électrophérogramme avec une grande surface sous sa courbe. En plus d’un décalage vers le bas dans l’emplacement de la propagation pour tester la qualité de l’ARNm après deux cycles d’amplification linéaire, nous utilisons à la fois la puce de laboratoire standard Sense de BioRad Experian et le spectrophotomètre NanoDrop.

La technologie traditionnelle des microréseaux Atrics exige que la propagation du transcrit de l’ARNm soit d’au moins 600 nucléotides pour être détectée avec ce protocole. La propagation de l’ARNm a atteint la gamme des 1000 nucléotides, comme l’indique l’électrophérogramme, avec de grands pics descendant lentement en fonction du temps. Ce résultat est également confirmé par le gel virtuel.

Si la longueur des transcrits est inférieure à 600 nucléotides, l’échantillon ne doit pas être inclus Pour l’hybridation, les lectures NanoDrop ont indiqué une moyenne de deux 60 sur un rapport de deux 80 ou une pureté de 2,5 dans tous les échantillons. La concentration moyenne était de 1,7 microgramme par microlitre, ce qui donne environ 50 microgrammes d’ARNm par échantillon, ce qui est suffisant pour l’analyse des microréseaux et la validation ultérieure, qui nécessite entre 15 et 20 microgrammes d’ARNm et une validation ultérieure des résultats avec QR TPCR. Nos résultats indiquent qu’avec ce protocole, la quantité et la qualité de l’ARN obtenu sont suffisamment bonnes pour étudier les différences d’expression génique via la puce X trois P de l’atrix humain.

Après hybridation avec la puce Atrics Human X three P, nous avons atteint un pourcentage d’appels d’une moyenne de 26,6 %, indiquant une hybridation et des intensités de sonde adéquates. Nous venons de vous montrer comment capturer au laser des neurones paramétalliques dans du tissu cérébral humain post-mortem afin d’utiliser l’ARN obtenu à partir de ces cellules. Pour les études de profilage G de microarrays, il est important d’effectuer toutes les étapes dans un environnement exempt d’ARN et de terminer les étapes en temps opportun afin de préserver l’intégrité de l’ARN.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.