Name: Isolement dARN à partir de synthèse dADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser lexpression génique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Découvrez l'isolation d'ARN et la synthèse d'ADNc à partir d'embryons de zebrafish pour l'analyse d'expression génique. Cette méthode fournit un ARN total de haute qualité pour les études en biologie moléculaire.

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Partie 1: Extraction des ARN totaux à l&#39;aide du réactif Trizol Lorsque vous travaillez avec de l&#39;ARN, il est très important de travailler dans un environnement qui est exempt de RNases. Des précautions simples, comme avoir des pipettes réservées à un usage uniquement avec les procédures de l&#39;ARN et la pulvérisation de la zone de travail avec un réactif décontaminant (par exemple, RNase Away) avant le début de la procédure sont très utiles. <ol><li> Pour atteindre une quantité suffisante d&#39;embryons de poisson zèbre pool d&#39;ARN 50 dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation et retirer autant d&#39;eau que possible avec une pipette. </li><li> Immédiatement ajouter 250 ul de réactif TRIzol 1 au tube de centrifugeuse contenant les embryons. Réactif Trizol contient du phénol et ne doit être utilisée sous une hotte. </li><li> Lyse et homogénéiser les embryons avec un pilon à granulés (environ 20 coups) jusqu&#39;à ce que le tissu est suffisamment perturbé. </li><li> Lorsque les cellules sont suffisamment homogénéisé, ajouter 750 ul réactif TRIzol pour égaler un volume total de 1 ml. </li><li> Afin de permettre la dissociation complète des complexes nucléoprotéiques, incuber des échantillons homogénéisés pendant 5 minutes à température ambiante. A ce stade, l&#39;échantillon peut être éclair congelés dans l&#39;azote liquide et conservés à -80 ° C ou le protocole peut être poursuivi. </li><li> Pour continuer à ajouter 0,2 ml de chloroforme et le rock le tube pendant 15 secondes pour mélanger. </li><li> Incuber l&#39;échantillon pendant 2 minutes à température ambiante, puis centrifuger à 12 000 xg pendant 15 minutes à 4 ° C. </li><li> Le mélange va se séparer en bas d&#39;un rouge de phénol-chloroforme phase, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. La phase aqueuse supérieure contenant l&#39;ARN. La couche supérieure doit comporter d&#39;environ 60% du volume initial de TRIzol (environ 0,6 ml). Transfert de la couche aqueuse supérieure dans un tube de centrifugeuse nouvelle aide d&#39;une pipette de 1 ml en faisant attention à ne pas transférer de la couche d&#39;interphase. </li><li> Pour précipiter les ARN ajoutez 0,5 ml d&#39;isopropanol. </li><li> Laisser l&#39;échantillon reposer à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C. ARN formeront une pastille de gel-like sur le fond du tube. </li><li> Sans perturber le culot, éliminer le surnageant avec une pipette et laver le culot dans 1 ml d&#39;éthanol à 75%. Mélanger l&#39;échantillon en retournant délicatement et centrifuger à 7500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer l&#39;éthanol avec une pipette et permettre échantillon à sec tout inversé pendant 10 minutes. </li><li> Reprendre le culot en ajoutant 100 pi d&#39;eau sans RNase et incuber l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 10 minutes. Il est recommandé aux doigts de vortex fréquemment pendant l&#39;incubation à l&#39;aide de réhydratation ARN. En option, vous pouvez vérifier la qualité et la quantité d&#39;échantillon en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre ou directement à l&#39;étape suivante. </li></ol> Partie 2: Nettoyage ARN utilisant le kit Qiagen RNeasy Mini Le kit Qiagen RNeasy Mini 2 est utile pour éliminer les contaminants et les impuretés d&#39;un échantillon d&#39;ARN isolé à partir d&#39;autres méthodes. Pour cette procédure, β-mercaptoéthanol, l&#39;éthanol et eau sans nucléase sont nécessaires en plus des composants inclus dans le kit. Un traitement optionnel DNAse est recommandé pendant cette procédure. <ol><li> Dès la première utilisation de la trousse, tampon RPE devra être préparé par addition de 4 volumes d&#39;éthanol à 100% à 1 volume de tampon RPE. </li><li> Le jour de la procédure, tampon RLT devront être préparés frais. Calculez le montant total de tampon RLT qui sera nécessaire. Un volume de 350 ul est nécessaire par échantillon. Pour préparer le tampon RLT, ajouter 10 l de β-mercaptoéthanol pour chaque 1 ml de tampon. Cela devrait être fait sous la hotte. </li><li> Pour chaque échantillon ajouter 350 ul du tampon RLT et 250 ul d&#39;éthanol à 100%. Mélangez bien par aspiration et refoulement à plusieurs reprises. </li><li> Transférer l&#39;échantillon, ce qui devrait être d&#39;environ 700 ul, dans une colonne RNeasy qui est placé dans un tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation, éliminer le flux à travers et ajouter 700 ul de tampon RW1 à une colonne RNeasy. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante, puis jetez le débit à travers. </li><li> Traitement à la DNase avec QIAGEN kit RNase-Free DNase: DNAse traitement est facultative mais fortement recommandée pour les échantillons de haute qualité. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Lorsque vous recevez le kit de traitement à la DNase, vous aurez besoin pour préparer la solution de DNase I en ajoutant 550 ul eau sans nucléase de la DNAse. Mélanger doucement en inversant et ne vortex. Aliquoter dans des flacons à usage unique contenant 10 ul de la solution stock. Vous pouvez stocker la solution stock à -20 ° C jusqu&#39;à 9 mois. Les aliquots décongelés peuvent être conservés à 4 ° C pendant 6 semaines si nécessaire, mais ne pas recongeler les aliquots après décongélation. </li><li> Pour préparer le mélange incubation de DNase I ajouter 70 ul de tampon RDD à 10 ul DNAse I ssolution tac par échantillon. Mélanger par inversion douce et tube à centrifuger brièvement pour ramasser résiduelle sous forme liquide sur les côtés du tube. Ajouter 80 ul mélange incubation de DNase I directement à la colonne RNeasy. Incuber le traitement DNAse pendant 30 minutes à température ambiante. </li></ol></li><li> Après le traitement DNAse ajouter 350 pi de tampon RW1 à la colonne et centrifuger à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation jetez le débit à travers et ajouter 500 ul tampon RPE à la colonne spin. Incuber l&#39;échantillon pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 8000 xg pendant 1 minute à température ambiante et jeter le débit à travers. </li><li> Après centrifugation ajouter 500 ul d&#39;éthanol de 75% à la colonne. </li><li> Répétez centrifugation à 8000 xg, mais pour 2 minutes à température ambiante. </li><li> Après centrifugation jetez le débit à travers la colonne et permettre de sécher pendant 5 minutes. </li><li> Immédiatement centrifuger à 8000 xg pendant 5 minutes à température ambiante pour enlever tout à gauche sur les traces de l&#39;éthanol. </li><li> Après centrifugation est un transfert complet de la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml et ajouter 10 ul eau sans nucléase. Incuber pendant 1 minute, puis centrifuger à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante. L&#39;ARN sera dans le flux à travers. </li><li> Ajouter un autre ul 10 de eau sans nucléase à la colonne de spin et incuber à température ambiante pendant 1 minute. Centrifuger l&#39;échantillon à 10 000 xg pendant 1 minute à température ambiante. </li><li> Après centrifugation retirez et jetez la colonne. L&#39;ARN sera dans le flux à travers. </li><li> Vérifiez la quantité et la qualité de l&#39;ARN en utilisant une NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant. </li><li> En outre, d&#39;exécuter un gel dénaturant ou d&#39;utiliser un bioanalyseur Agilent 2100 pour vérifier l&#39;intégrité de l&#39;ARN. </li><li> Les échantillons doivent être conservés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la synthèse d&#39;ADNc peut être effectuée. </li></ol> Partie 3: Synthèse d&#39;ADNc en utilisant l&#39;Invitrogen SuperScript premier brin système L&#39;ARN est facilement sujette au clivage par ARNases conduisant à la dégradation. En conséquence de nombreux protocoles d&#39;expression génique ont été développés pour utiliser un produit plus stable d&#39;ADNc qui a été directement synthétisés à partir de l&#39;ARN. Voici la synthèse des détails que nous premier brin d&#39;ADNc en utilisant le système d&#39;Invitrogen SuperScript Synthèse du premier volet 3. Chaque réaction de synthèse d&#39;ADNc peut accueillir jusqu&#39;à 5 ug d&#39;ARN. <ol><li> Avant de commencer le mélange procédure et centrifuger brièvement chaque composante. </li><li> Préparer ARN / mélange de primer dans un tube de micro stérile de 0,5 ml comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 65 ° C pendant 5 minutes. </li><li> Immédiatement le transfert de l&#39;échantillon à coulis de glace pendant 10 minutes. </li><li> Alors que l&#39;échantillon est de refroidissement préparer un master mix avec les composants décrits dans le tableau 2. Les volumes sont répertoriés par une réaction. Ajustez le volume en conséquence pour le nombre total de réactions. </li><li> Après refroidissement, ajouter 9 ul du mélange maître préparé à l&#39;étape 5 pour chaque ARN / mélange d&#39;amorces. Mélanger délicatement et recueillir par centrifugation brève. Le volume total de chaque échantillon doit être de 19 pi. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à 42 ° C pendant 2 minutes dans un thermocycleur. </li><li> Ajouter 1 ul (50 unités) de SuperScript II RT dans chaque tube, mélanger et incuber à 42 ° C pendant 60 minutes dans un thermocycleur. </li><li> Terminer la réaction à 70 ° C pendant 15 minutes, puis réfrigérer l&#39;échantillon à 4 ° C. Un thermocycleur peut être programmé pour des étapes 8 et 9. </li><li> Après l&#39;échantillon a atteint 4 ° C, le transfert de la réaction d&#39;un bain de glace. </li><li> Sur la glace ajouter 1 l de RNAse H pour chaque tube et incuber pendant 20 minutes à 37 ° C. Le volume total est maintenant de 21 pi. Ajout de la RNAse H pour votre échantillon va dégrader la matrice ARN et ne laisser que le produit seul brin d&#39;ADNc. </li></ol> Partie 4: Isolement d&#39;ADNc et des précipitations <ol><li> Une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube sera utilisé dans l&#39;isolation du produit d&#39;ADNc. Préparer une phase de 1,5 ml de gel de verrouillage du tube par centrifugation à 12000 xg pendant 2 minutes. Le gel devraient tous être au fond du tube. </li><li> Ajouter 81,5 ul de phénol (Tris-saturés, tamponné à pH 8,0), 81,5 l de chloroforme alcool isoamylique 24:1, et l&#39;échantillon (21 ul) dans le tube de gel à verrouillage de phase. Mélanger plusieurs fois par inversion douce. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> L&#39;ADNc doit être dans la phase aqueuse supérieure. Transférer la phase supérieure dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 ml. Le volume total devrait être d&#39;environ 20 pl. </li><li> Ajouter 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 et mélanger doucement. Par exemple, si le volume de la phase aqueuse supérieure est égale à 20 pl, vous aurez besoin d&#39;ajouter 2 pi de NaOAc 3 M, pH 5,2. </li><li> Ajouter 7 l de 5 mg / ml de glycogène et mélanger délicatement. </li><li> Ajouter 1X volume d&#39;isopropanol et mélanger doucement. En général, cela se situe autour de 30 ul d&#39;isopropanol. </li><li> Laisser l&#39;échantillon à incuber à températur ambiantee pendant 10 minutes et puis centrifuger à 12 000 xg pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Une petite pastille d&#39;ADNc devraient former sur le fond du tube. Retirer délicatement le surnageant avec une pipette. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 70% et mélanger par retournement. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 12 000 xg pendant 5 minutes. </li><li> Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette et répéter le lavage à l&#39;éthanol 70% et de centrifugation (étapes 10 et 11). </li><li> Après centrifugation éliminer le surnageant avec une pipette. S&#39;il ya du liquide restant sur les parois du tube, il peut être recueilli par une brève filature le tube. Retirez tout excès de liquide et de permettre le culot sécher à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 20 ul d&#39;eau sans nucléase pour réhydrater la pastille. Placer l&#39;échantillon à 55 ° C pendant 5 minutes pour la réhydratation de la pastille. </li><li> La quantité et la qualité du produit d&#39;ADNc est ensuite vérifiée en utilisant un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre en suivant les instructions du fabricant. L&#39;ADNc peut être conservé à -20 ° C. </li></ol> Les résultats représentatifs Après le nettoyage d&#39;ARN, d&#39;environ 15 ug de haute qualité de l&#39;ARN total peut être attendu de 50 embryons de poissons zèbres. Pour évaluer la qualité totale ARN, un spectrophotomètre, électrophorèse sur gel, et un bioanalyseur Agilent 2100 peut être utilisé. A ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre peut être utilisé pour évaluer l&#39;absorption à 260 nm en comparaison de l&#39;absorbance à 280 nm (figure 1). L&#39;A 260 / A 280 peut révéler la présence de contaminants et de donner des preuves de la dégradation possible. Un A 260 / A 280 de 1,9 à ​​2,0 est considéré comme acceptable. En outre, il est fortement recommandé que la dénaturation d&#39;un gel d&#39;ARN être exécuté pour évaluer l&#39;intégrité des ARN. Brins d&#39;ARN sera séparé sur base de leur taille, avec de petits brins migrent plus loin dans le gel. Un échantillon non dégradé apparaîtra comme un frottis avec deux bandes fortes. Le frottis est un résultat d&#39;une population de différents brins d&#39;ARNm de taille et les bandes correspondent aux ARNr 28S et 18S. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S (figure 2). Alternativement, une totale intégrité ARN peut être évaluée en utilisant une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics distincts représentant l&#39;ARNr 28S et 18S est attendue (figure 3). Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l&#39;aire sous les pics d&#39;environ 2:1, respectivement. Deux pics distincts ne sera pas observée dans les échantillons dégradés. Les échantillons d&#39;ARN présentant la dégradation ne doit pas être réalisée grâce à des procédures expérimentales ultérieures. Analyse spectrophotométrique peut être utilisé pour évaluer la qualité du produit d&#39;ADNc (figure 4). L&#39;A 260 / A 280 devrait être d&#39;environ 1,8. réactions d&#39;ADNc avec une entrée de 5 ug d&#39;ARN total systématiquement le rendement mg ​​1-2 de produit d&#39;ADNc dans notre laboratoire. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Un spectre d&#39;échantillon d&#39;ARN NanoDrop. Après le nettoyage d&#39;ARN, la quantité d&#39;ARN et de la qualité peut être évaluée en utilisant un ND-1000 NanoDrop spectrophotomètre. Environ 15 pg d&#39;ARN total élevé de qualité est systématiquement donné de 50 embryons de poissons zèbres avec un A 260 / A 280 autour de 1,9 à ​​2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Un gel dénaturation ARN. Afin d&#39;évaluer l&#39;intégrité de l&#39;isolement d&#39;ARN total, un gel dénaturation ARN peut être couru. Un frottis avec deux bandes brillantes correspondant à l&#39;ARNr 28S et 18S est attendue. Le groupe 28S doit être environ deux fois plus intense que la bande 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Une trace d&#39;un échantillon d&#39;ARN à partir d&#39;un bioanalyseur. Afin d&#39;évaluer l&#39;intégrité de l&#39;isolement d&#39;ARN total, les échantillons peuvent aussi être analysés sur une bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics, correspondant à l&#39;ARNr 28S et 18S, devrait être visible. Le pic 28S doit être plus grand que le pic de 18S avec l&#39;aire sous les pics d&#39;environ 2:1, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un spectre NanoDrop d&#39;un échantillon d&#39;ADNc. Analyse spectrophotométrique avec un NanoDrop ND-1000 peut être utilisé pour évaluer la quantité et la qualité du produit d&#39;ADNc. L&#39;A 260 / A 280 devrait être d&#39;environ 1,8. réactions d&#39;ADNc avec une entrée de 5 ug d&#39;ARN total régulièrement le rendement de 1 à 2 ug d&#39;ADNc dans notre laboratoire. Tableau 1. Composants à ajouter pour l&#39;ARN / mélanges amorce à l&#39;étape 2 de la synthèse de l&#39;ADNc. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> L&#39;ARN total (jusqu&#39;à 5 ug) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Mélange de dNTP 10 mM </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> DEPC eau traitée </td><td> ul n </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Mélange de réaction Tableau 2. Pour l&#39;étape 5 de la synthèse de l&#39;ADNc. Les volumes indiqués sont par réaction. Augmenter le volume de chaque composant pour le nombre total de réactions. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Composante </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 10X tampon RT </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> 25 mM de MgCl2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM de DTT </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

La fragilité de la molécule d&#39;ARN est le facteur le plus critique qui devrait se rappeler tout au long de ce protocole. Matériel stérile qui est RNAse free devrait toujours être utilisé dans une zone de RNAse free du laboratoire. Il est utile de réserver une partie du laboratoire pour être utilisés pour les procédures d&#39;ARN seulement. Cette zone doit être fréquemment pulvérisés avec un produit RNAse enlever, comme RNAse Away. Les échantillons d&#39;ARN devraient toujours être manipulés avec des gants et conservé...

<table><tbody><tr><td>Glycogène (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pestlets pour microcentrifugeuse avec tube</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Phénol, saturé au Tris</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>Kit d'ADNase sans RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNEasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Système de synthèse de premier brin SuperScript&amp;#174; pour RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement d&#39;arn à partir de synthèse d&#39;adnc embryonnaires zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Beaucoup de procédures de laboratoire importants et complexes nécessitent une entrée de haute qualité, l&#39;ARN intact. Un échantillon de dégradé ou de la présence d&#39;impuretés peuvent conduire à des résultats désastreux en aval des applications expérimentales. Il est donc primordial d&#39;utiliser des techniques solides avec de nombreuses garanties et des contrôles de qualité afin d&#39;assurer un échantillon de qualité supérieure. Ici, nous détaillons un protocole pour isoler l&#39;ARN total à partir d&#39;embryons de poisson zèbre entier en utilisant un dénaturant chimiques disponibles dans le commerce et le nettoyage subséquent pour enlever les traces de l&#39;ADN et les impuretés à l&#39;aide d&#39;un kit d&#39;isolation commerciale ARN. Comme l&#39;ARN est relativement instable et facilement sujettes au clivage par RNases, la plupart des protocoles d&#39;expression génique dosage en utilisant un produit d&#39;ADNc qui est directement synthétisée à partir d&#39;une matrice d&#39;ARN. Nous détaillons une procédure pour convertir l&#39;ARN dans le produit plus stable d&#39;ADNc en utilisant un kit disponible dans le commerce. Tout au long de ces procédures il ya de nombreux contrôles de qualité afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon n&#39;est pas dégradés ou contaminés. Le produit final de ces protocoles est d&#39;ADNc qui est approprié pour biopuces d&#39;analyse, la RT-PCR ou stockage à long terme.

L&#39;isolement de haute qualité, intacte ARN est une étape essentielle dans de nombreux protocoles de laboratoire. Ici, nous démontrons l&#39;extraction d&#39;ARN à partir d&#39;embryons de poisson zèbre ensemble et synthèse de l&#39;ADNc pour l&#39;application ultérieure dans diverses procédures expérimentales, y compris l&#39;analyse des microréseaux d&#39;expression génique.

Isolement d&#39;ARN à partir de synthèse d&#39;ADNc embryonnaires Zebrafish et pour analyser l&#39;expression génique

De nombreuses procédures de laboratoire importantes et complexes nécessitent l'utilisation d'ARN intact et de haute qualité. Un échantillon dégradé ou la présence d'impuretés peuvent conduire...

Pour commencer l'isolement de l'ARN et obtenir des rendements suffisants, 50 embryons de poisson zèbre sont transférés dans un mortier microfusé. L'ARN est d'abord extrait à l'aide de triol, de réactif et de chloroforme après une homogénéisation complète. L'ARN est ensuite nettoyé et purifié à l'aide du minikit Qiagen RNEZ afin d'obtenir un ARN total de haute qualité, non dégradé, destiné à des applications futures et à une conservation à long terme.L'ARN est synthétisé en un produit ADNc plus stable. L'ADNc est purifié pour éliminer le brin matrice d'ARN d'origine. Bonjour, je m'appelle Sam Peterson du laboratoire de la Dre Jennifer Freeman du Département des sciences de la santé de l'Université Purdue.Aujourd'hui, nous allons vous montrer comment extraire de l'ARN de haute qualité à partir d'embryons entiers de poisson zèbre et le convertir en produit d'ADNc. Généralement, nous utilisons cette procédure pour étudier les profils d'expression génique. Commençons donc.Lorsque vous travaillez avec de l'ARN, il est très important de travailler dans un environnement exempt de RNases. Prenez des précautions simples, comme utiliser des pipettes réservées exclusivement aux manipulations d'ARN et vaporiser la zone de travail avec un désinfectant anti-RNase avant de commencer l'extraction d'ARN total. Commencez l'extraction dans une hotte, prélassez 50 embryons de poisson zèbre dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et retirez autant d'eau que possible. Ajoutez immédiatement 250 microlitres de réactif TRIzol, qui contient du phénol.Utilisez un pilon en pastille pour lyser et homogénéiser les embryons pendant environ 20 mouvements, jusqu'à ce que les tissus soient suffisamment désagrégés. Ajoutez ensuite 750 microlitres de réactif au triazole et incubez pendant cinq minutes à température ambiante afin de permettre la dissociation complète des complexes protéiques nucléaires. Une fois les cinq minutes écoulées, ajoutez 0,2 millilitre de chloroforme, mélangez en agitant doucement le tube pendant 15 secondes, puis incubez l'échantillon pendant deux minutes à température ambiante. Centrifugez ensuite à 12 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Le mélange se séparera en une phase inférieure rouge de phénol-chloroforme, une phase intermédiaire et une phase aqueuse supérieure incolore. La couche supérieure mesure environ 0,6 millimètres et contient l'ARN ; transférez toute la couche aqueuse supérieure, d'environ 0,6 millimètres, dans un nouveau tube micro FUZE, en prenant soin de ne pas transférer la moindre partie de la phase intermédiaire. Ensuite, pour précipiter l'ARN, ajoutez 0,5 millilitre d'isopropanol et mélangez.Et laissons à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifugeons l'échantillon à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. L'ARN devrait former un culot de consistance gélatineuse. Éliminons le surnageant sans perturber le culot et lavons en ajoutant un millilitre d'éthanol à 75 %, puis en mélangeant par retournement doux et en centrifugeant à 7 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après la centrifugation, éliminer l'éthanol et retourner le tube pour le faire sécher pendant 10 minutes. Resuspendre le culot en ajoutant 100 microlitres d'eau exempte d'ARN et en incubant à 55 degrés Celsius pendant 10 minutes. Vortexer fréquemment avec les doigts pour favoriser la réhydratation des ARN.À présent que l'ARN a été extrait des embryons, passez au nettoyage de l'ARN et au traitement par l'ADNse. Pour purifier l'ARN, utilisez un kit Rogen RN easy mini. Lors de la première utilisation, ajoutez quatre volumes d'éthanol à 100 % à un volume du tampon RPE, en travaillant sous la hotte.Ajouter 10 microlitres de bêta-mercaptoéthanol pour chaque millilitre de tampon RLT. Ensuite, ajouter 350 microlitres de tampon RLT et 250 microlitres d'éthanol à 100 % au prélèvement en mélangeant plusieurs fois par aspiration et expulsion à l’aide d’une pipette, puis transférer l’intégralité du prélèvement sur une colonne RNeasy placée dans un tube de collecte de deux millilitres. Centrifuger à 8 000 ×g pendant une minute à température ambiante ; après la centrifugation, jeter l’écoulat et ajouter 700 microlitres de tampon RW1 sur la colonne. Centrifuger à nouveau à 8 000 G pendant une minute et éliminer l'écoulement afin de retirer l'AD du prélèvement. Procéder ensuite au traitement de l'ADN à l'aide du kit d'ADN sans ARN. Dès réception du kit, ajouter 550 microlitres d'eau sans nucléase aux ADN et mélanger délicatement par retournement, puis conserver la solution mère divisée en aliquots de 10 microlitres et congeler à moins 20 degrés Celsius.Ajoutez 70 microlitres de tampon RDD à 10 microlitres de la solution mère d'ADN, mélangez par inversion douce, centrifugez brièvement, puis ajoutez directement sur la colonne R et easy spin A. Incubez le traitement de l'ADN pendant 30 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite 350 microlitres de tampon RW1 à la colonne spin, centrifugez à 8 000 ×g pendant une minute à température ambiante, jetez l'écoulement et ajoutez 500 microlitres de tampon RPE à la colonne spin. Incubez l'échantillon pendant cinq minutes à température ambiante.Centrifuger à nouveau à 8 000 G pendant une minute à température ambiante, éliminer l’écoulement et ajouter 500 microlitres d’éthanol à 75 % sur la colonne de centrifugation. Répéter la centrifugation à 8 000 G, mais pendant deux minutes à température ambiante ; après la centrifugation, éliminer l’écoulement et laisser sécher la colonne pendant cinq minutes immédiatement. Centrifuger à 8 000 G pendant cinq minutes à température ambiante pour éliminer toute trace résiduelle d’éthanol.Transférez maintenant la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajoutez 10 microlitres d'eau sans nucléase. Incubez pendant une minute afin d'éluer l'ARN, puis centrifugez à 10 000 ×g pendant une minute. À température ambiante, l'ARN se retrouvera dans l'écoulement. Répétez l'élution avec 10 microlitres supplémentaires d'eau.Vérifiez la quantité et la qualité de l'ARN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop ND 1000 en suivant les instructions du fabricant. En outre, réalisez une électrophorèse sur gel dénaturant ou utilisez un bioanalyseur Agilent 2100 pour vérifier l'intégrité de l'ARN. Si la qualité et la quantité de l'ARN sont satisfaisantes, passez à la synthèse d'ADNc.Enfin, conserver l'ARN à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que la synthèse d'ADNc puisse être réalisée. Commencer la synthèse d'ADNc en mélangeant et en centrifugeant brièvement chaque composant de l'amorce d'ARN. Mélanger les dNTPs, l'ARN et l'oligo dT.Ajouter chaque composant à un tube stérile naut de 0,5 millilitre microfusionné pour un volume total de 10 microlitres. Pour les volumes spécifiques, consulter le protocole écrit joint. Incuber ensuite l'échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes.Transférez immédiatement l'échantillon dans un mélange glacé pendant 10 minutes. Pendant que l'échantillon refroidit, préparez un mélange tampon maître jusqu'à un volume total de neuf microlitres, comme indiqué dans le protocole écrit joint. Après refroidissement, combinez le mélange tampon maître avec le mélange d'amorces ARN en mélangeant doucement, puis rassemblez par une brève centrifugation. Ensuite, placez l'échantillon combiné en incubation dans le thermocycleur à 42 degrés Celsius pendant deux minutes.Pour démarrer la transcription inverse, ajouter un microlitre de superscript two RT au tube et mélanger. Poursuivre l'incubation à 42 degrés Celsius pendant une heure. Arrêter la réaction à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes.Ensuite, refroidissez l'échantillon à quatre degrés Celsius et transférez-le dans un bain de glace. Ajoutez un microlitre de RNAs H à l'échantillon et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. L'enzyme RNAs H dégrade alors le brin d'ARN, ne laissant que le produit d'ADN complémentaire (cDNA) simple brin. La synthèse du cDNA est désormais terminée, ne nécessitant plus qu'une étape supplémentaire de purification et de concentration. Pour isoler le produit d'ADN complémentaire (cDNA), préparez un tube de gel de verrouillage de phase de 1,5 millilitre par centrifugation à 12 000 ×g pendant deux minutes.Tous les gels doivent se trouver au fond du tube. Ajouter 81,5 µL de phénol saturé au tris tamponné à un pH de 8,0, 81,5 µL de chloroforme : isoamyl alcool 24:1 et l'échantillon dans un tube contenant un gel de verrouillage de phase, mélanger plusieurs fois par retournement doux, puis centrifuger l'échantillon à 12 000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. L'ADNc doit se trouver dans la phase aqueuse supérieure.Transférez la phase supérieure, qui doit être d’environ 20 microlitres, dans un tube micro propre de 1,5 millilitre. Pour précipiter l’ADNc, ajoutez deux microlitres d’acétate de sodium à trois molaire à pH 5,2 et mélangez délicatement. Ajoutez sept microlitres de glycogène à cinq milligrammes par millilitre et mélangez délicatement.Ensuite, ajouter 30 microlitres d'isopropanol et mélanger doucement. Laisser l'échantillon s'incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Puis centrifuger à 12 000 ×g pendant 20 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, un petit culot d'ADNc apparaît au fond du tube.Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’un pipeteur. Lavez le culot en ajoutant 500 microlitres d’éthanol à 70 % et mélangez par retournement. Centrifugez l’échantillon à 12 000 ×g pendant cinq minutes. Après la centrifugation, retirez le surnageant à l’aide d’un APE.Répétez le lavage, ajoutez de l'éthanol, centrifugez et éliminez le surnageant SUP. Après le deuxième lavage, effectuez une brève centrifugation pour rassembler tout liquide restant. Éliminez tout excès de liquide et laissez le culot sécher à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, ajoutez 20 microlitres d'eau sans nucléase pour réhydrater le culot. Incubez l'échantillon à 55 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour la réhydratation, l'ADN peut être stocké à moins 20 degrés Celsius.Enfin, vérifiez la quantité et la qualité du produit ADNc à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 en suivant les instructions du fabricant. L'extraction et la purification de l'ARN à partir de 50 embryons de poisson zèbre donne habituellement environ 15 microgrammes d'ARN total de haute qualité, tel qu'évalué à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop ND-1000 ; le rapport d'absorbance entre 60 et 80 est d'environ 1,9 à 2,0. L'intégrité de l'ARN extrait est évaluée à l'aide d'un gel d'ARN dénaturant. L'ARN apparaît sous forme d'une traînée avec deux bandes intenses correspondant aux ARN ribosomiques 18S et 28S.La bande 28 S doit avoir une intensité d'environ deux fois celle de la bande 18 S. Alternativement, l'intégrité de l'ARN est évaluée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100. Deux pics nets correspondant aux ARN ribosomiques 18 S et 28 S sont visibles.Le pic de 28 s doit être plus grand que le pic de 18 s. La rétrotranscription de cinq microgrammes d'ARN total donne habituellement un à deux microgrammes d'ADNc, comme évalué à l'aide d'un NanoDrop ND 1000. Le rapport d'absorbance entre 60 et 80 de l'ADNc est d'environ 1,8.Nous venons de vous montrer comment isoler l'ARN total à partir d'embryons entiers de poisson zèbre et convertir cet ARN en produit ADNc. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de vous rappeler de maintenir un environnement exempt de RNases. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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