Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Cette procédure débute avec de l'ADNc synthétisé à partir d'un modèle d'ARN de haute qualité. L'ADNc est d'abord marqué avec le colorant fluorescent SI three. Une fois la réaction de marquage terminée, l'ADNc marqué est purifié, isolé et la qualité de la réaction de marquage est évaluée.

L'ADNc marqué est ensuite hybridé sur une puces à ADN. Après hybridation, les puces sont analysées afin de déterminer les niveaux relatifs d'expression génique dans les échantillons. Bonjour, je m'appelle Sam Peterson, du laboratoire de Dr.Jennifer Freeman à l'École des Sciences de la Santé de l'Université Purdue.

Auparavant, nous vous avons montré comment extraire l'ARN d'embryons de poisson zèbre et transformer cet ARN en ADNc. Aujourd'hui, nous allons vous présenter la procédure d'étiquetage et d'hybridation de cet ADNc sur une plateforme de puces à ADN oligonucléotidiques de poisson zèbre afin d'étudier les profils d'expression génique globaux. En général, nous utilisons cette procédure pour étudier l'expression différentielle des gènes en réponse à une exposition à une toxine.

Commençons donc. L'expérience de microarray nécessite un environnement lumineux minimal afin d'éviter la dégradation photochimique du colorant fluorescent SI three utilisé pour le marquage. Pour commencer le marquage de l'ADNc avec SI three haw, préparez les composants suivants du système de marquage génomique bio prime array CGH : tampon d'amorces aléatoires 2,5 x, mélange 10 X-D-C-T-P et eau sans nuclease. En outre, décongelez le stock de DCTP marqué SI three à une concentration de un millimolaire. Après décongélation, centrifugez brièvement les réactifs dans un tube épais de 0,6 millilitre et combinez-les.

500 nanogrammes de cDNA, 40 microlitres, 2,5 x tampon d'amorces aléatoires et de l'eau sans nuclease pour obtenir un volume total de 86 microlitres. Bien mélanger et centrifuger brièvement, puis incuber la réaction à cent degrés Celsius dans un thermocycleur pendant cinq minutes. À la fin de l'incubation, transférer immédiatement la réaction dans un bain de glace pendant 10 minutes.

Ensuite, sortez l'ADN polymérase exo du congélateur et placez-la sur de la glace. Puis ajoutez dans le tube de réaction 10 microlitres du mélange 10 X-D-C-T-P, 2 microlitres du SI 3D CTP à 1 millimolaire et 2 microlitres de l'ADN polymérase XO cleanout. Mélangez bien et centrifugez brièvement. Incubez enfin la réaction à 37 degrés Celsius pendant 16 heures dans un thermocycleur lorsque le marquage est terminé.

Passez à la purification et à la précipitation de l'ADNc marqué. Pour commencer la purification de l'ADNc marqué, placez une colonne MicroCon dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajouter 300 microlitres de 0,1 XSSC sur la colonne, puis ajouter la réaction de marquage. Centrifuger la colonne à 16 100 ×g pendant 10 minutes à 4 °C. Remarquer que l'écoulement peut être légèrement rose.

Jetez l'écoulement et ajoutez 300 microlitres supplémentaires de nought 0,1 XSSE sur la colonne. Répétez ensuite la centrifugation à 16 100 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez à nouveau l'écoulement et ajoutez maintenant 300 microlitres supplémentaires de T 0,1 XSSC sur la colonne, puis centrifugez à 16 100 ×g pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius après ce dernier lavage.

Le flux sortant doit être clair et l'ADNc marqué en rose doit être visible sur la colonne. Encore une fois, jetez le flux sortant de ce dernier lavage afin d'éviter l'ADNc marqué. Ajoutez 100 microlitres d'eau sans nucléase sur la colonne. Retirez la colonne du tube de microcentrifugeuse et retournez-la, à l'envers, dans un nouveau tube.

Ensuite, centrifuger la colonne inversée à 2 300 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Le cDNA marqué est dissous dans l'eau au fond du tube. Vérifier le cDNA obtenu à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop ND 1000 selon les instructions du fabricant.

Calculez la concentration d'ADN et évaluez l'incorporation du colorant comme décrit dans le protocole écrit joint. Si l'ADNc est suffisamment marqué, placez six microgrammes dans un nouveau tube pour précipiter le mélange d'ADNc marqué dans un volume de 0,1 x de trois molar acétate de sodium à pH 5,2 et un volume égal d'isopropanol, en incubant à l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.

En gardant à l'esprit que toutes les étapes précédentes ont été réalisées dans un environnement lumineux minimal, centrifuger l'échantillon à 16 100 G pendant 20 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer soigneusement le surnageant sans perturber le culot d'ADN, qui est rose.

Finalement, laver en ajoutant 500 microlitres d'éthanol à 70 % et mélanger par retournement doux, puis centrifuger à 16 100 ×g pendant cinq minutes. À température ambiante, retirer le surnageant, retourner le tube et laisser sécher le culot pendant cinq minutes. Le cDNA marqué est prêt pour l'hybridation.

Avant de commencer l'hybridation, allumez le système d'hybridation Nimble Gen et laissez-le s'équilibrer à 42 degrés Celsius. Commencez par dissoudre le culot d'ADN marqué dans cinq microlitres d'eau sans nucléase. Ajoutez les composants d'hybridation du kit d'hybridation Roche Nimble Gen — tampon d'hybridation, hybrid A et oligonucléotide d'alignement — jusqu'à un volume total de 18 microlitres, comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant.

Mélanger soigneusement et faire une courte centrifugation pour rassembler le contenu au fond du tube. Ensuite, dénaturer l'ADNc marqué en plaçant le tube à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer immédiatement le tube vers le système d'hybridation NimbleGen jusqu'à ce que les puces soient prêtes.

Remarquez que les puces à ADN nécessitent une manipulation et un stockage soigneux. Les puces Roche NimbleGen sont conservées à l'abri de la lumière, avec un agent desséchant, à température ambiante. Placez la puce dans l'outil d'alignement du mélangeur de précision.

Placer la charge de mixeur PMA T sur le PMA T et retirer la bande adhésive à l’aide de pinces. Une fois le dispositif et le mixeur chargés, fermer le PMA T de manière sécurisée. Ensuite, séparer le dispositif et le mixeur du PMA T en appliquant une pression sur le mixeur à travers le trou dans le PMA t.

Enfin, utilisez un rouleau encreur pour appliquer une pression autour de l'extérieur du mélangeur afin de s'assurer que la matrice est hermétiquement scellée et d'éliminer toute bulle d'air. Ensuite, placez l'ensemble matrice-mélangeur sur le système d'hybridation pour le réchauffer, puis chargez l'échantillon d'ADNc sur la matrice. Utilisez le dispositif de déplacement lentement et avec une pression constante.

Ajoutez 15 microlitres de l'échantillon marqué dans le trou de remplissage situé au centre du mélangeur. Essuyez tout excès d'échantillon sur les orifices et scellez-les avec des bandes adhésives. Fermez ensuite le loquet.

Démarrer maintenant le mélange de la solution d'hybridation en utilisant le programme B sur le système d'hybridation NimbleGen. Laisser l'hybridation se produire sur la puce à ADN pendant 16 à 20 heures. Après l'hybridation, la puce à ADN sera lavée et analysée lorsque l'hybridation sera presque terminée. Préparer le balayage en allumant le scanner d'array GenePicks 4 000 B et en le laissant chauffer pendant environ 15 minutes.

Ensuite, préparez les tampons de lavage un A, un B deux et trois comme indiqué dans le protocole écrit accompagnant. Préchauffez le tampon de lavage un A à 42 degrés Celsius, mais laissez les autres tampons à température ambiante. Une fois que le tampon de lavage un A est réchauffé, versez-le dans une boîte.

Immergez un porte-lame dans le tampon de lavage un B. Retirez ensuite le complexe du mélangeur de puces du système d'hybridation nimble gen et insérez-le dans le support. Commencez le lavage en immergeant l'ensemble dans le tampon de lavage un A préchauffé, puis retirez soigneusement le mélangeur en le décollant du porte-lame. Retirez ensuite la puce du support et agitez-la pendant 15 secondes dans le tampon de lavage un A. Transférez rapidement la puce dans un porte-lame immergé dans le tampon de lavage un B et agitez vigoureusement le porte-lame pendant deux minutes.

Ensuite, transférez la grille de lames dans le tampon de lavage deux et agitez pendant une minute. Enfin, transférez la grille de lames dans le tampon de lavage trois et agitez pendant 15 secondes. Terminez les lavages en transférant la matrice dans la centrifugeuse de séchage des lames et faites-la tourner deux minutes selon les conditions de centrifugation.

Numérisez immédiatement la lame car le D est sensible à la lumière et à l'ozone ; démarrez la numérisation en insérant la lame avec le code-barres orienté vers le bas dans le scanner d'arrays GenePix 4 000 B. Dans la boîte de dialogue des paramètres matériels, réglez le laser de 532 nanomètres sur une valeur PMT de 500, la puissance à 100 %, la taille des pixels à cinq microns, le nombre de lignes à moyenner à un et la position de mise au point à zéro micron. Une fois les réglages terminés, prévisualisez la lame.

Choisissez une zone à numériser, puis effectuez la numérisation. Une fois la numérisation terminée, vérifiez l'histogramme de l'image. Idéalement, une valeur normalisée de un E moins cinq devrait atteindre la limite de saturation de 65 000, ce qui signifie qu’environ 1 à 2 % des éléments sont saturés.

Si les comptages normalisés sont inférieurs à un E moins cinq, augmentez le gain du PMT et rescannez la lame. Si les comptages normalisés sont supérieurs à un E moins cinq, diminuez le gain du PMT, rescannez la lame, enregistrez l’image, puis utilisez un programme d’analyse de données pour la normalisation des données et le calcul des valeurs d’intensité. La réaction de marquage produit habituellement au moins 10 microgrammes d’ADNc marqué.

L'incorporation de colorant peut être calculée à l'aide d'un simple rapport de colorant de base, où le rapport entre le nucléotide et SI trois est égal au rapport A260 sur A550 multiplié par 23,15. Une bonne réaction donnera une valeur comprise entre 50 et 80. Une hybridation acceptable présentera de 1 à 2 % des éléments saturés, en donnant.

Un E moins cinq de comptes normalisés à la limite de saturation de 65 000. Une fois la valeur du PMT réglée, la qualité d'hybridation peut également être évaluée qualitativement en examinant l'image numérisée de la puces à ADN et en appréciant l'intensité des oligonucléotides alignés par rapport aux autres éléments présents sur la puce. L'image numérisée doit également être examinée afin de détecter toute tache particulière ou poussière située dans la zone de la puce.

Dans une analyse ultérieure, un graphique de dispersion peut être utilisé pour représenter visuellement vos données analysées afin de déterminer les niveaux relatifs d'expression génique dans les échantillons et d'identifier les gènes exprimés de manière différentielle. Les gènes exprimés de manière différentielle s'écarteront significativement de la droite de régression dans une procédure complémentaire. Nous vous avons montré comment extraire l'ARN d'embryons de poisson zèbre pour synthétiser de l'ADNc. Ici, nous venons de vous montrer comment marquer et hybridiser l'ADNc sur une plateforme de microréseaux d'oligonucléotides afin d'étudier les profils d'expression génique globaux.

Lorsque vous effectuez cette procédure, n'oubliez jamais d'utiliser de l'ADN de haute qualité et d'éviter d'exposer le colorant site three à une lumière directe. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.