Mondial Analyse expression génique utilisant une plateforme biopuces oligonucléotidiques Zebrafish

Cette procédure commence avec de l’ADNC qui a été synthétisé à partir d’un modèle d’ARN de haute qualité. Le CDNA est d’abord marqué avec le colorant fluorescent SI trois. Une fois la réaction de marquage terminée, l’ADNC marqué est purifié, isolé et la qualité de la réaction de marquage est évaluée.

L’ADNC marqué est ensuite hybridé sur une puce à ADN. Après l’hybridation, les puces sont analysées pour déterminer les niveaux relatifs d’expression génique dans les échantillons. Bonjour, je m’appelle Sam Peterson du laboratoire de la Dre Jennifer Freeman à l’École des sciences de la santé de l’Université Purdue.

Précédemment, nous vous avons montré comment extraire de l’ARN d’embryons de poisson-zèbre et transformer cet ARN en ADNC. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure de marquage et d’hybridation de cet ADNC sur une plateforme de microréseaux d’oligonucléotides de poisson-zèbre pour étudier les profils globaux d’expression génique. En règle générale, nous utilisons cette procédure pour étudier l’expression différentielle des gènes en réponse à une exposition à une toxine.

Alors commençons. L’expérience de la micropuce nécessite un environnement lumineux minimal pour empêcher la photodégradation du colorant fluorescent SI trois utilisé dans le marquage pour commencer à étiqueter le CD NA avec sci trois haw les composants suivants de la matrice bio prime CGH système de marquage génomique 2,5 x tampon d’amorce aléatoire, 10 X-D-C-T-P mélange et eau sans nucléases. De plus, décongelez le stock d’un millimolaire des trois DCTP marqués SI après décongélation, centrifugez brièvement ou les réactifs dans un tube à paroi de 0,6 millilitre d’épaisseur combiné.

500 nanogrammes de CDNA 40 microlitres, 2,5 x tampons d’amorçage aléatoires et de l’eau sans nucléases pour atteindre un volume total de 86 microlitres. Mélangez bien et centrifugez brièvement, puis incubez la réaction à cent degrés Celsius dans un thermocycleur pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, transférez immédiatement la réaction dans une boue de bain de glace pendant 10 minutes.

Ensuite, sortez l’exo ADN polymérase du congélateur et placez-le sur de la glace. Ajoutez ensuite dans le tube de réaction, 10 microlitres du mélange 10 X-D-C-T-P Deux microlitres du SI 3D CTP millimolaire et deux microlitres de l’ADN polymérase XO cleanout bien mélangés et centrifugez brièvement. Enfin, incubez la réaction à 37 degrés Celsius pendant 16 heures et un thermocycleur lorsque l’étiquetage est terminé.

Procédez au nettoyage et précipitez l’ADNC étiqueté. Pour commencer à nettoyer l’ADNC étiqueté. Placez une colonne MicroCon dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez 300 microlitres zéro 0,1 XSSC à la colonne, puis ajoutez la réaction d’étiquetage. Centrifuger la colonne à 16, 100 G pendant 10 minutes à quatre degrés SIU. Notez que le flux peut être rose clair.

Jetez le flux et ajoutez encore 300 microlitres de 0,1 XSSE à la colonne. Répétez ensuite la centrifugation à 16,100 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Encore une fois, jetez le flux et ajoutez 300 microlitres supplémentaires T 0.1 XSSC à la colonne maintenant centrifuger à 16, 100 G pendant 12 minutes à quatre degrés Celsius après ce dernier lavage.

Le flux doit être dégagé et l’ADNC étiqueté en rose est visible sur la colonne. Encore une fois, jetez le flux de ce lavage final pour échapper au CD NA étiqueté. Ajoutez 100 microlitres d’eau sans nucléase dans la colonne. Sortez la colonne du microtube de centrifugation et inversez-la inversée dans un nouveau tube.

Ensuite, centrifugez la colonne inversée à 2 300 G pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Le CDNA marqué est dissous dans l’eau au fond du tube. Vérifiez l’ADNC mentionné à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop ND 1000 conformément aux instructions du fabricant.

Calculer la concentration d’ADN et évaluer l’incorporation du colorant comme décrit dans le protocole écrit ci-joint. Si l’ARNC est suffisamment marqué, mettez six microgrammes dans un nouveau tube pour précipiter le mélange CD NA étiqueté en naut 0,1 x volume de trois molaires d’acétate de sodium à pH 5,2 et un x volume. Isopropanol incubant à l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.

En gardant à l’esprit, toutes les étapes jusqu’à présent ont été réalisées dans un environnement lumineux minimal. Centrifugez ensuite l’échantillon à 16, 100 G pendant 20 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, jetez soigneusement le NATANT SUP sans déranger la pastille d’ADN, qui est rose.

Enfin, lavé en ajoutant 500 microlitres, 70 % d’éthanol et mélangé par une centrifugeuse à inversion douce à 16, 100 G pendant cinq minutes. À température ambiante, retirez le supinate, retournez le tube et laissez sécher la pastille pendant cinq minutes. Le CDNA labellisé est prêt pour l’hybridation.

Avant de commencer l’hybridation, allumez le système d’hybridation Nimble Gen et laissez-le s’équilibrer à 42 degrés Celsius. Commencez par dissoudre la pastille CD NA étiquetée dans cinq microlitres d’eau sans nucléase dans la pastille dissoute. Ajoutez les composants d’hybridation du kit d’hybridation Roche Nimble Gen, le tampon d’hybridation, l’hybride A et l’oligo d’alignement pour un volume total de 18 microlitres, comme indiqué dans le protocole écrit ci-joint.

Mélangez bien et tournez brièvement le tube pour recueillir le contenu au fond. Ensuite, dénaturez le CDNA étiqueté en plaçant le tube à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez immédiatement le tube vers le système d’hybridation Nimble Gen jusqu’à ce que les matrices soient prêtes.

Notez que les microréseaux nécessitent une manipulation et un stockage soigneux. Les matrices Nimble Gen de Roche sont stockées dans l’obscurité avec un dessiccant à température ambiante. Chargez le réseau dans l’outil d’alignement du mélangeur de précision.

Le PMA T charge un mélangeur X sur le PMA T et retire la bande adhésive à l’aide d’une pince. Une fois le réseau et le mélangeur chargés, fermez le PMA T en toute sécurité. Ensuite, dégagez le réseau et le mélangeur du PMA T en appliquant une pression sur le mélangeur à travers le trou du PMA T.

Enfin, utilisez un braieur pour appliquer une pression autour de l’extérieur du mélangeur afin de vous assurer que le réseau est scellé et d’éliminer les bulles. Ensuite, placez le complexe de mélangeur de réseau sur le système d’hybridation à réchauffer, pour charger l’échantillon d’ADNC sur le réseau. Utilisez le perpet de déplacement lentement et avec une pression constante.

Ajoutez 15 microlitres de l’échantillon étiqueté dans l’orifice de remplissage au centre du mélangeur. Essuyez tout excès d’échantillon des orifices et scellez-les avec des bandes adhésives. Fermez ensuite le loquet.

Commencez maintenant à mélanger la solution d’hybridation à l’aide du programme B sur le système d’hybridation Nimble Gen. Laisser la puce s’hybrider pendant 16 à 20 heures Après l’hybridation, la micropuce sera lavée et scannée lorsque l’hybridation sera presque terminée. Préparez-vous à l’imagerie en allumant le scanner gene picks 4 000 B et laissez-le se réchauffer pendant environ 15 minutes.

Ensuite, préparez les tampons de lavage un A, un B deux et trois comme indiqué dans le protocole écrit ci-joint. Tampon de lavage d’avant-guerre un A à 42 degrés Celsius, mais laissez les autres tampons à température ambiante. Lorsque le tampon de lavage un A s’est réchauffé, versez-le dans un plat.

Immergez un support coulissant dans le tampon de lavage un B.Retirez maintenant le complexe de mélangeur array du système d’hybridation Nimble Gen et glissez-le dans le gabarit. Commencez le lavage en immergeant l’ensemble dans le tampon de lavage préchauffé un A et retirez délicatement le mélangeur en le décollant de la glissière. Retirez ensuite le tableau du gabarit et agitez pendant 15 secondes dans le tampon de lavage un A. Transférez rapidement le réseau dans un support à glissières immergé dans le tampon de lavage un B et agitez vigoureusement le support à glissières pendant deux minutes.

Transférez ensuite la grille coulissante dans le tampon de lavage deux et agitez pendant une minute. Enfin, transférez la grille coulissante dans le tampon de lavage trois et agitez pendant 15 secondes. Terminez les rondelles en transférant le réseau dans la centrifugeuse de séchage sur lames et essorez-le pendant deux minutes après la centrifugation.

Scannez la matrice immédiatement car le D est sensible à la lumière et à l’ozone, démarrez la numérisation en chargeant le code-barres de la matrice dans le scanner de matrice Gene Picks 4 000 B. Dans la boîte de dialogue de réglage matériel, le laser de 532 nanomètres a une valeur PMT fixée à 500, réglé la puissance à 100 % de la taille des pixels à cinq microns, les lignes à la moyenne à un et la position de mise au point à zéro micron. Une fois la configuration terminée, prévisualisez le tableau.

Choisissez une zone à numériser, puis numérisez-la. Une fois le balayage terminé, vérifiez l’histogramme de l’image. Idéalement, un compte normalisé de E moins cinq devrait se situer à la limite de saturation de 65 000, ce qui signifie qu’environ un à 2 % des caractéristiques sont saturées.

Si le nombre normalisé est inférieur à un E moins cinq, augmentez le gain PMT et balayez à nouveau la lame. Si les comptes normalisés sont supérieurs à un E moins cinq, diminuez le gain PMT et balayez à nouveau la lame, enregistrez l’image et utilisez un programme d’analyse de données pour la normalisation des données et le calcul des valeurs d’intensité. La réaction de marquage produit régulièrement au moins 10 microgrammes d’ADNC marqué.

L’incorporation du colorant peut être calculée à l’aide d’un rapport de colorant de base simple où le rapport nucléotide/SI trois est égal au rapport A deux 60 à cinq 50 multiplié par 23 point 15. Une bonne réaction aboutira à une valeur comprise entre 50 et 80. Dans le cas d’une hybridation acceptable, un à 2 % des caractéristiques saturées auront un rendement.

Un E moins cinq comptes normalisés à la limite de saturation de 65 000. Avec la valeur PMT définie, la qualité de l’hybridation proche de 500 peut également être évaluée qualitativement en visualisant l’image numérisée de la puce et en évaluant l’intensité des oligos alignés sur d’autres caractéristiques de la puce. L’image numérisée doit également être évaluée pour détecter des taches particulières ou de la poussière dans la zone du réseau.

Dans l’analyse ultérieure, un nuage de points peut être utilisé pour imager vos données d’analyse afin de déterminer les niveaux relatifs d’expression génique dans les échantillons et d’identifier les gènes qui sont exprimés de manière différentielle. Les gènes qui sont exprimés de manière différentielle s’écarteront considérablement de la ligne de meilleur ajustement dans une procédure complémentaire. Nous vous avons montré comment extraire l’ARN d’embryons de poisson-zèbre pour synthétiser c CD NA. Ici, nous venons de vous montrer comment marquer et hybrider CD NA sur une plateforme microray oligonucléotidique pour étudier les profils globaux d’expression génique.

Lorsque vous effectuez cette procédure, n’oubliez jamais d’utiliser un CD NA de haute qualité et évitez d’exposer le colorant du site trois à un éclairage direct. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.