Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Les lamelles de recouvrement utilisées dans ce test sont fonctionnalisées avec de la dextrine, puis incorporées dans des cellules d’écoulement microfluidique. Ensuite, chaque cellule d’écoulement est incubée avec une suspension de liposomes, qui fusionnent pour former une bicouche lipidique au-dessus de la dextrine hydratée. Sous le microscope à fluorescence, le virus marqué au fluoro quatre et la streptavidine marquée à la fluorescéine sont ajoutés et le virus est autorisé à s’arrimer à la bicouche.

Un afflux de tampon acide initie la fusion virale avec la bicouche et une caméra numérique enregistre les changements de fluorescence tout au long du test. Bonjour, je m’appelle Daniel Floyd et je travaille dans le laboratoire d’Anine Vanian au Département de Chimie Biologique et de Pharmacologie Moléculaire de l’Université Harvard. Aujourd’hui, je vais vous montrer une méthode pour visualiser la cinétique de fusion virale au niveau de la particule unique.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la façon dont le virus se rend aux cellules hôtes. Alors commençons. Commencez ce protocole en préparant les bordereaux de protection fonctionnalisés à la dextrine.

La première étape consiste à sonicer les lamelles dans des solutions de détergent à 10 %, d’une molaire d’hydroxyde de potassium acétone et de sonicate d’éthanol à 100 % pendant 30 minutes par solution. Et rincer à l’eau déminéralisée entre les ations. Après la dernière sonication, rincez les lamelles de couverture à l’eau, puis séchez-les dans l’incubateur à 80 degrés Celsius.

Ensuite, placez les lamelles dans un décapant au plasma d’oxygène pendant trois minutes. Cette étape oxyde la surface des lames, rendant le verre uniformément hydrophile et réactif dans les étapes de siloisation suivantes. Ensuite, plongez les lamelles dans une solution fraîche de 0,2 % d’oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy dans de l’isopropanol et incubez pendant cinq minutes.

Rincez ensuite les lamelles plusieurs fois avec de l’isopropanol. Placez les lamelles recouvertes de Slan à 80 degrés Celsius pendant une heure. Pour durcir, cette étape permet à la bande de se lier de manière covalente au verre.

Après le durcissement, disposez les lamelles à plat à l’intérieur d’une boîte de congélation en plastique. Recouvrez la surface supérieure de chaque lamelle avec environ un millilitre d’une solution de dextrine. 30 % de poids par volume dans l’eau.

Fermez la boîte de congélation et laissez les lamelles dans un endroit calme pendant 24 à 36 heures. Le lendemain, videz l’excès de dextrine, saisissez les lamelles de couverture avec une pince en plastique et remettez-les dans le support en céramique. Rincez-les plusieurs fois à l’eau et laissez-les tremper dans l’eau pendant 48 heures.

Le récipient peut être doucement agité sur un rotateur de table, sécher le couvercle dans un four réglé à 80 degrés Celsius et stocker dans un dessiccation sous vide jusqu’à ce que vous soyez prêt pour l’étape suivante. Revêtement des lamelles de recouvrement avec un mélange de liposomes pour former une bicouche de rabotage. L’étape suivante consiste à préparer les liposomes pour former la bicouche lipidique dans le capot, à combiner tous les lipides dissous dans le chloroforme dans un tube à essai en verre.

La formulation liposomale comprend un côté dia ganglia, qui lie les particules virales et un lipide biotinylé, qui se lie à la fluorescéine, indicateur de pH conjugué à la streptavidine. Ensuite, évaporez le solvant sous un courant d’argon ou d’azote gazeux. Et retirez le solvant restant en laissant le tube à essai dans un dessiccation sous vide pendant deux heures.

Mettre en suspension le film lipidique séché dans un tampon HNE de 400 microlitres. Transférez ensuite la suspension dans un micro-tube à centrifuger en plastique. Congelez la suspension dans un bain d’azote liquide et décongelez-la dans un bain d’eau chaude.

Répétez ce cycle de congélation-décongélation quatre fois après les cycles de congélation-décongélation. Utilisez un extrudeur de lipides équipé d’un filtre à membrane de 100 nanomètres pour extruder la suspension lipidique. 25 fois après l’extrusion, la suspension doit apparaître plus transparente.

Conservez les liposomes à température ambiante et utilisez-les le jour de la préparation. Maintenant que les lipides sont prêts à partir, préparez la cellule d’écoulement microfluidique. Tout d’abord, prenez une lame de quartz de 20 x 20 x 3 millimètres et utilisez une meule de diamant pour percer deux trous d’un millimètre sur les côtés opposés.

Découpez un carré de 20 millimètres dans une feuille de ruban adhésif double et à l’aide d’une lame de rasoir. Découpez une section de 15 x deux millimètres à partir du centre. Décollez un côté du support du ruban et collez le ruban sur la glissière du terrain.

Collez l’autre côté à une lamelle fonctionnalisée, maintenant coupée à des longueurs de 20 centimètres de tubes en polyéthylène, et insérez-les dans les trous de la glissière en quartz. Enfin, scellez la cellule d’écoulement avec de la colle époxy en cinq minutes. Étalez la colle sur les côtés de la glissière en quartz pour la coller à la lamelle.

Utilisez deux autres gouttes de colle pour sceller la connexion entre le tube et la lame de quartz. Une fois la colle durcie, amorcez la cellule d’écoulement et le tube avec un tampon HNE. Ensuite, pour créer la bicouche lipidique supportée, prenez la suspension de liposomes extrudés et aspirez environ 80 microlitres dans les canaux la veille de l’expérience de fusion.

Commencez à étiqueter les particules virales pour étiqueter l’intérieur viral en rouge. Combinez 20 microlitres de soufre rumine ou de solution SRB fraîchement préparée avec 10 microlitres de suspension virale et laissez à température ambiante pendant 20 heures. Le lendemain, retirez l’excès de colorant en faisant passer la suspension virale dans une colonne de dessalage 10 et en diluant avec 800 microlitres de tampon HNE.

La colonne doit avoir une bande de couleur évidente, qui contient le virus étiqueté. Récupérez cette fraction lors de l’étape ellucienne, étiquetez ensuite l’enveloppe virale en vert en ajoutant 13 microlitres de décalcomanie Octa, RUMINE un 10 ou RH un 10 C 18 à la suspension virale marquée SRB. Agitez la suspension en fixant le tube à un rotateur de laboratoire et laissez reposer pendant trois heures.

Ensuite, retirez l’excès d’HR un 10 C 18 à l’aide d’une colonne de dessalage 10. Comme auparavant, le virus est prêt pour le test de fusion. Effectuez le test de cinétique de fusion à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique.

Un laser à krypton Argonne excite les quatre fluoros dans la membrane virale et à l’intérieur. Un miroir dichroïque divise ensuite les émissions de fluorescence rouge et verte et focalise indépendamment les images sur des moitiés distinctes d’une caméra CCD ou d’un dispositif à couplage de charge multipliant les électrons. Montez la lamelle sur la platine du microscope et fixez le tube de sortie à un tire-seringue réglé pour un débit de 100 microlitres par minute.

Nettoyez les canaux d’écoulement des liposomes en excès en faisant couler 300 microlitres de HNE. Concentrez le microscope et ajustez la puissance du laser pour éclairer la surface avec 350 watts par centimètre carré de lumière de 488 nanomètres pour exciter la flore rouge, quatre et 70 watts par centimètre carré de lumière de 568 nanomètres pour exciter la flore verte. Quatre. Maintenant que le microscope est prêt, pompez le virus marqué dilué de un à cent dans la cellule d’écoulement.

Au fur et à mesure que le virus se diffuse à la surface inférieure du canal d’écoulement, les particules commencent à s’ancrer. Adhérant sur le côté des ganglions DIA, incorporé dans les lamelles de protection, bicouche plane. Lorsque la densité des particules ancrées atteint environ plusieurs centaines de particules par champ de vision, commencez à s’écouler dans une solution de deux microgrammes par millilitre.

La streptavidine streptocoque marquée à la fluorescéine, un fluorophore sensible au pH car la streptavidine marquée se lie aux molécules lipidiques couplées à la biotine dans la bicouche. Un fond vert pâle apparaît à nouveau, lavez le canal d’écoulement avec 300 microlitres de HNE. Maintenant que les virus se sont amarrés et que la surface bicouche est recouverte de fluorescéine, il est temps de commencer le test.

Choisissez une zone d’imagerie, faites la mise au point du microscope et préparez la caméra CCD pour l’acquisition d’images en accéléré. Réglez le temps d’exposition sur 100 millisecondes et collectez des images à une fréquence de 10 hertz. Amorcez la fusion membranaire virale en faisant couler un tampon acide de citrate de sodium.

Au fur et à mesure que le pH baisse, la fluorescence de la fluorescéine diminue, indiquant le moment de l’acidification. La caméra CCD enregistre les données tout au long du test, que l’on peut utiliser pour déterminer le temps de fusion des hémiments et de mauvaise formation, comme documenté par la caméra CCD. Après la baisse du pH, il y a des éclats de fluorescence verte lorsque les membranes virales et planes fusionnent, que les lipides se mélangent et que le colorant vert de l’enveloppe virale est dilué dans la membrane plane.

En revanche, il y a une décroissance de la fluorescence rouge après la chute du pH lorsque les membranes virales et lipidiques forment des pores, permettant au colorant rouge de l’intérieur viral de s’échapper dans l’espace aqueux sous la bicouche plane et hors de vue, ces tendances peuvent également être visualisées par des instantanés fluorescents avant et pendant la fusion. Tracez également graphiquement les trajectoires d’intensité de fluorescence de chaque particule comme le montre cet exemple, la fusion Hemi est définie comme le point où la pente de l’intensité de fluorescence verte est à son apogée de formation de pores comme le point où la désintégration de la fluorescence rouge se produit. Combinez les données de plusieurs expériences pour générer des histogrammes de temps de fusion des hémicycles et de formation des pores, comme indiqué ici, en utilisant le temps de la baisse du pH comme t est égal à zéro pour synchroniser les données de différentes expériences.

Je viens de vous montrer un moyen de mesurer la cinétique de fusion virale au niveau d’une seule particule. Lors de cette procédure. Assurez-vous d’utiliser des lamelles propres afin d’avoir une bicouche homogène et fluide.

Essayez également de minimiser la quantité de lumière que vous utilisez pendant l’imagerie par fluorescence afin de minimiser les dommages photologiques. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.