Name: Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie à fluorescence bicolore pour visualiser la fusion virale au niveau particule unique. Cette technique permet d'analyser en temps réel la cinétique de l'hémifusion et la formation de pores membranaires.

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Le travail a été soutenu par des subventions du NIH AI57159 (au SCH) et AI72346 (pour AMvO). SCH est un Howard Hughes Medical Institute.

Fonctionnalisation lamelle de verre La bicouche planaire utilisé dans le dosage de fusion est pris en charge sur un film hydraté de dextrane. Dextran agit comme une entretoise entre la bicouche planaire et la surface du verre. Cela empêche les composants de la membrane de devenir collé sur la surface du verre et fournit également l'espace dans lequel le contenu d'une particule virale peut s'échapper lors de la fusion. Lamelles de verre sont fonctionnalisés par traitement avec une résine époxy silane, ce qui nous permet de dextrane chimiquement obligataire sur le verre (Elender, et al. 1996). <ol><li> Disposez des lamelles de 25 mm dans un support de coloration céramique, et placez le support dans un bocal ou un gobelet. </li><li> Remplissez le récipient avec une solution à 10% de la verrerie de laboratoire de qualité détergent. Placer le récipient dans un nettoyeur à ultrasons pendant 30 minutes. </li><li> Rincer le contenant et le porte-lamelle à l'eau déminéralisée, et remplir avec de l'hydroxyde postassium 1M. Retourner le récipient au sonicateur de bain pour un autre 30 minutes. </li><li> Répétez cette procédure de nettoyage utilisant de l'acétone et l'éthanol. </li><li> Rincez le coverlips dans l'eau et à sec. </li><li> Enfin, nettoyez les lamelles avec un décapant plasma d'oxygène pour trois minutes. </li><li> L'étape de nettoyage dernière s'oxyde en surface, rendant le verre uniformément hydrophile et réactive dans les étapes suivantes silanisation. </li><li> Préparer une solution à 0,2% de 3-glycidoxypropyltriméthoxysilane silane dans l'isopropanol. Plonger les lamelles dans cette solution pendant cinq minutes. </li><li> Jeter la solution de silane et rincer la fois des lamelles de plusieurs dans l'isopropanol. </li><li> Les lamelles sont maintenant recouvertes d'une couche de silane, mais ils doivent être guéries pour permettre au silane pour coller de façon covalente sur le verre. Placez les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius pendant une heure. </li><li> Alors que les lamelles sont de séchage, peser 500 dextrane et préparer un 30% p / v de solution. Le préchauffage de l'eau va faciliter la dissolution. Nous allons utiliser environ 1 ml de cette solution par lamelle. Une fois que le dextrane a dissous, defoam la solution dans un dessiccateur à vide. </li><li> Lorsque les lamelles silanisées avez fini de séchage, les retirer de la grille de céramique et de les arranger à plat sur l'intérieur d'une boîte de congélation en plastique. Utiliser une pipette de 1 ml pour couvrir la surface supérieure de chaque lamelle avec ~ 1 ml de la solution de dextrane. Fermez la boîte de congélateur et laisser dans un endroit tranquille pour 24-36 heures. </li><li> Bien saisir les lamelles avec une pince en plastique, verser l'excédent de dextrane et de les remplacer dans le rack en céramique. Rincer la lamelles de plusieurs dans l'eau, et laissez les lamelles à tremper dans l'eau pendant 48 heures. Le pot peut être doucement agitée sur un agitateur de table. </li><li> Sécher les lamelles dans un four réglé à 80 degrés Celsius et conserver dans un dessiccateur à vide. </li></ol> Préparation des liposomes Bicouches lipidiques supportées sont formées par adsorption de liposomes à une lamelle de dextrane fonctionnalisé. Le fusible adsorbé liposomes avec eachother jusqu'au ruptures de membrane et se répand sur la surface plane. <ol><li> Une formulation typique liposome utilisé dans le dosage se compose de 1,2, dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1-oléoyl-2-palmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC), le cholestérol, le cerveau bovin disialoganglioside (GD 1a), et N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyle) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine dans un rapport de 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Tous les composants sont stockés dans le chloroforme ou le chloroforme et des solutions de méthanol. </li><li> Préparer un mélange contenant deux micromoles de lipides par le transfert de volumes de chaque composant dans un tube à essai en verre. Évaporer le solvant sous un courant d'argon ou d'azote gazeux. Retirez le solvant restant en laissant le tube à essai dans un dessiccateur à vide pendant deux heures. </li><li> Remettre le film lipidique séché dans 400 microlitres de tampon HNE (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Transférer la suspension dans un microtube plastique. Gel de la suspension dans un bain d'azote liquide et de dégel dans un bain d'eau tiède. Répétez ce cycle gel / dégel à quatre reprises. </li><li> Assembler une extrudeuse de lipides avec un filtre en polycarbonate de 100 nm à membrane, et d'extruder la suspension lipidique 25 fois. La suspension doit apparaître à être plus transparent après l'extrusion. </li><li> Les liposomes doit être utilisée le jour où ils sont préparés. Elles peuvent être stockées à température ambiante jusqu'à utilisation. </li></ol> Microfluidiques préparation cellulaire de flux Une cellule simple flux microfluidique est faite par adhésif double sandwich entre une diapositive de quartz et d'une lamelle fonctionnalisée. <ol><li> Obtenir une diapositive 20x20x3 mm à quartz. Utilisez une fraise diamantée de forer deux trous de 1 mm sur les côtés opposés. </li><li> Couper un carré de 20 mm à partir d'une feuille de ruban adhésif double, et en utilisant une lame de rasoir, couper une section de 15 x 2 mm du centre. </li><li> Retirez un côté du support de bande, et faire adhérer le ruban à la pintez glisser. Respecter l'autre côté à une lamelle fonctionnalisée. </li><li> Coupez deux longueurs de 20 cm de tube en polyéthylène et les insérer dans les trous de la lame de quartz. </li><li> Sceau de la cellule d'écoulement avec de la colle époxy 5 minutes. </li><li> Quand la colle a durci, le premier de la cellule d'écoulement et les tubes avec du tampon. </li><li> Une bicouche lipidique soutenue peut être formé à ce stade par le dessin d'environ 80 microlitres de la suspension de liposomes dans les canaux. </li></ol> L'étiquetage des particules de virus <ol><li> H3N2 de la grippe A (X-31) est généralement utilisé pour le dosage de la fusion, mais d'autres souches de grippe et autres virus ont été utilisés avec succès. </li><li> Le virus est étiqueté avec un maximum de deux colorants fluorescents différents pour permettre la détection des hemifusion et des pores de formation. </li><li> Dissoudre sulforhodamine B (SRB) dans un tampon HNE pour faire une solution à 20 mM. Combinez 20 microlitres de la solution de colorant avec 10 microlitres de la suspension virale, et laisser à température ambiante pendant 20 heures. Durant cette période, le colorant va lentement s'accumuler à l'intérieur des particules virales. </li><li> Retirer l'excès de teinture en passant la suspension de virus de la grâce à une colonne PD-10 dessalage. Si suffisamment de matériel viral est utilisé, une bande de couleur peut être vu dans la colonne. Cette bande contient le virus étiquetés et peuvent être perçus comme il est élue. </li><li> Si aucune bande n'est visible, collecter des fractions de 200 microlitre et déterminer quelles fractions contiennent le virus étiquetés en mesurant l'absorption 565 nm sur un spectrophotomètre. Le virus doit éluer dans un volume total d'environ 0,8 ml. </li><li> Etiquette de l'enveloppe virale en ajoutant 13 microlitres d'un formamide 2 mM de diméthyle (DMF) solution de rhodamine octadécyle 110 (Rh110C18) à la suspension SRB virus marqués. </li><li> Incorporer la suspension en attachant le tube d'un rotateur de laboratoire et de laisser pendant 3 heures. </li><li> Purifier le virus de l'excès Rh110C18 utilisant une colonne PD-10 dessalage comme décrit précédemment. </li></ol> Configuration de microscope L'expérience est réalisée sur un microscope à fluorescence équipé d'un objectif de haute NA immersion adapté à la microscopie de réflexion totale de fluorescence interne. Les 488 et 568 nm de lignes d'un laser argon / krypton sont utilisés pour exciter le virus Rh110C18 et SRB étiquetés. L'imagerie simultanée de chaque étiquette est accomplie en divisant l'émission de fluorescence verte et rouge avec un miroir dichroïque et indépendante se concentrant sur les images moitiés séparées d'une caméra CCD d'électrons se multiplier. La réalisation du test Exécution de l'essai de fusion implique un assemblage progressif des composants biochimiques au sein de la cellule de flux: l'assemblage de la bicouche lipidique plane, l'amarrage de particules de virus étiquetés, de revêtement de la surface à la fluorescéine, et l'initiation de la réaction avec un tampon de faible pH (figure 1A) . <ol><li> Montez le flux de cellules sur la platine du microscope, et attacher le tube de sortie d'une pompe seringue mis à couler à un taux de 40 microlitres par minute. </li><li> Effacer les canaux d'écoulement des liposomes en excès en circulant dans 300 microlitres de HNE. </li><li> Focus du microscope et d'ajuster la puissance du laser pour illuminer la surface avec 350 W / cm 2 de 488 nm et la lumière 70 W / cm 2 de 568 nm de lumière. Si vous utilisez un 1,45 NA 60x objectif à immersion d'huile, mettre les intensités laser à 100 Watts et 20 Watts micro micro, respectivement. </li><li> Pompe virus marqués (dilué 1 / 100) dans une cellule d'écoulement. Comme le virus se diffuse à la surface inférieure du canal d'écoulement, les particules vont commencer à coller à la ganglioside incorporé dans la bicouche lipidique. </li><li> Quand une densité adéquate de particules virales à quai a été atteint (jusqu'à environ 1000 particules par champ de vision). Mettre le tuyau d'admission à une solution contenant deux microgrammes par millilitre fluorescéine streptavidine marquée. La streptavidine marquée se lient à la biotine couplée molécules lipidiques dans la bicouche, et éventuellement un fond vert sombre sera visible. </li><li> Laver le canal d'écoulement avec 300 microlitres de HNE. </li><li> Choisissez une zone d'imagerie, la focalisation du microscope et de préparer la caméra CCD d'acquisition d'images de temps écoulé. Réglez le temps d'exposition de 100 ms et recueillir des images à une cadence de 10 Hz. </li><li> Initier la fusion en s'écoulant dans un tampon acide contenant 10 mM citrate de sodium et 140 mM de NaCl. Le pH du tampon doit être ajustée pour être en dessous du pH critique du virus étant dosé. X-31 fusibles à des pH inférieur à 5,5. </li></ol> Les résultats représentatifs Figure 1B montre des instantanés de bicouche virions amarré avant et pendant la fusion. Chaque tache de diffraction limitée représente une particule virale individuels. Rouge et vert de fluorescence ont été séparément imagée sur les moitiés supérieure et inférieure d'une caméra CCD, permettant l'observation simultanée de l'enveloppe virale et les étiquettes de contenu. Il ya généralement deux fois plus nombreuses taches dans le canal vert par rapport àle rouge, et cela reflète le faible efficacité de l'étiquetage par le colorant contenu par rapport à l'étiquette de l'enveloppe. La fluorescence de fond verte émise par la surface liée fluorescéine disparaît à l'arrivée du tampon citrate et permet la détermination de l'heure de début de la réaction de fusion. Des événements sont détectés comme Hemifusion éclats de fluorescence verte que l'Rh110C18 trempé dans l'enveloppe virale se diffuse à travers la tige hemifusion et se dilue dans la membrane planaire. Un nuage en expansion vers l'extérieur fluorescente peut être vu autour des particules hemifused, démontrant la libre diffusion du colorant gras acyle liés à la membrane plane. Formation de pores est observé que la désintégration de la fluorescence rouge du SRB piégés à l'intérieur des particules virales. L'ouverture d'un pore de fusion permet à la teinture de s'échapper dans l'espace ci-dessous la bicouche aqueuse planaire et hors de la région d'observation. Trajectoires d'intensité de fluorescence de chaque particule, tracée à partir des intensités intégrées des particules individuelles, de faciliter la détermination du rendement et de temps de formation de pores et de hemifusion (Fig. 1C). Les heures des événements Hemifusion et la formation des pores sont déterminés comme le point où la pente maximale d'une rafale Rh110C18 signal de fluorescence ou la carie survient SRB. Dans une expérience réussie, environ 50 pour cent des particules marquées avec des signaux Rh110C18 dequenching rendement, et 30 pour cent des particules de SRB étiquetées donnent le signal utilisable. Parmi les particules marquées à la fois avec les colorants, environ 10 pour cent montrent deux signaux de mélange et la formation des lipides pores. Fig. 2A-C montre la distribution des pores et des temps hemifusion formation de lag d'une expérience typique. Fig.2D-F montre distributions cas d'épreuves combinées à partir de cinq expériences réalisées dans les mêmes conditions. Même avec un nombre modeste d'observations, la forme des histogrammes est apparente. Parce que chaque expérience est synchronisé par la détection du temps de chute du pH, des expériences multiples peuvent être combinés et des informations détaillées sur la limitation du débit des étapes intermédiaires peuvent être obtenues. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Figure 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Figure 1"> Figure 1. Conception expérimentale. A) Les particules virales sont étiquetés avec deux colorants fluorescents pour suivre la cinétique de formation de pores et de hemifusion fusion. La fluorescence est recueillie par un objectif de microscope haute-NA et imagée sur une caméra CCD. B) les images de fluorescence avant (à gauche) et pendant (à droite) la fusion des particules virales individuelles. Moitié supérieure et inférieure de chaque image correspond à la fluorescence rouge et vert, respectivement, de la même zone ~ 50 x 100 mm 2 de la bicouche en charge. C) L'intensité de fluorescence du traceur rouge SRB contenu viral (tracé supérieur), le vert Rh110C18 la membrane (au milieu de traces) de teinture, et le capteur de pH fluorescéine (trace inférieure) de fournir les heures exactes sont écoulés entre la diminution du pH, hemifusion, et la fusion. S'il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Figure 2"> Figure 2. Cinétique de fusion du virus marqué par fluorescence. Les distributions du temps écoulé entre la chute du pH et hemifusion (A, D) et la formation de pores (B, E). La montée et la décomposition des distributions indiquent la présence de plusieurs étapes intermédiaires. La transition entre hemifusion et l'ouverture d'un pore de fusion des particules individuelles est exponentiellement distribués, ce qui suggère une seule étape limitante. Panneaux AC montrent les résultats d'une expérience unique. DF panneaux sont compilés à partir de cinq expériences distinctes effectuées dans les mêmes conditions. S'il vous plaît <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

Préparation du fluide et continu bicouches lipidiques supportées peut être difficile. Des traces de contamination de défauts matériels ou de surface permettra d&#39;éviter la propagation de bicouches. Nettoyage soigneux et dépôt d&#39;une couche uniforme de dextrane sont essentiels. Imagerie prolongée des particules de virus peuvent blanchir les marqueurs fluorescents ou les amener à devenir inactivé. Photo-dommages de ce type est bien connu dans la bio-imagerie et des champs molécule unique...

<table><tbody><tr><td>Carrés de verre de couverture Corning, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Plaques en silice fondue</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Support de coloration</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-glycédoxypropyl)triméthoxysilane</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioléoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycéro-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oléoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycéro-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadécanyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycéro-3-phosph&amp;#8211;éthanolamine, sel de triéthylammonium (biotine-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine conjuguée à la fluorescéine</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Disialoganglioside GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt; extrait du cerveau de bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrudeuse</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Filtres membranaires en polycarbonate de 0,1 micron</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Disques de drainage de 10 mm (supports membranaires)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de la sulforhodamine B</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 110 octadécyle (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Voir&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 pour le protocole de synthèse</td></tr><tr><td>Colonnes de désalinisation PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Objectif Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Ar/Kr Innova 70C Spectrum</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

La fusion membranaire est une étape essentielle lors de l&#39;entrée des virus enveloppés dans les cellules. Dosages de fusion conventionnel généralement un rapport sur un grand nombre d&#39;événements de fusion, ce qui rend difficile pour l&#39;analyse quantitative de la séquence des étapes moléculaires impliqués. Nous avons développé une étude in vitro, deux couleurs de fluorescence test pour contrôler la cinétique des particules du virus de la fusion simple avec une bicouche cible sur un support sensiblement fluide. Particules virales de la grippe sont incubés avec un fluorophore lipophile pour tache verte de la membrane et un fluorophore rouge hydrophile pour colorer l&#39;intérieur virale. Nous déposons une bicouche lipidique contenant du ganglioside sur la surface du verre dextrane-functionilized d&#39;une cellule d&#39;écoulement, incuber les particules virales sur la bicouche planaire et l&#39;image de la fluorescence d&#39;une 100 x 100 um 2 zone, contenant plusieurs centaines de particules, sur un capteur CCD caméra. En imagerie à la fois la fluorescence rouge et verte, nous pouvons simultanément surveiller le comportement de la teinture de membrane (vert) et le contenu aqueux (rouge) des particules. Après abaissement du pH à une valeur inférieure au pH de fusion, les particules vont fusionner avec la membrane. Hemifusion, la fusion de l&#39;feuillet externe de la membrane virale avec le feuillet externe de la membrane cible, sera visible comme un changement soudain dans la fluorescence verte d&#39;une particule. Lors de la fusion subséquente des deux autres tracts distal un pore sera formé et le fluorophore rouge émettant dans la particule virale sera publié sous la membrane cible. Cet événement donnera lieu à une diminution de la fluorescence rouge des particules individuelles. Enfin, la fluorescence d&#39;un fluorophore intégrés sensibles au pH qui est incorporé dans la membrane cible des rapports sur l&#39;heure exacte de la chute du pH. De trois à fluorescence en temps des traces, tous les événements importants (chute du pH, de lipides de mixage sur hemifusion, mélanger le contenu à la formation de pores) peut maintenant être extraite d&#39;une manière simple et pour chaque particule individuellement. En recueillant les temps écoulé pour les différentes transitions pour de nombreuses particules individuelles dans les histogrammes, nous pouvons déterminer la durée de vie des intermédiaires correspondantes. Même intermédiaires cachés qui n&#39;ont pas une observable directement fluorescentes peuvent être visualisés directement à partir de ces histogrammes.

Nous présentons une<em&gt; In vitro,</em&gt; Deux couleurs dosage par fluorescence pour visualiser la fusion des particules de virus unique avec une bicouche cibles fluide. Par l&#39;étiquetage des particules virales avec les fluorophores différentielle tacher la membrane virale et son intérieur, nous sommes en mesure de contrôler la cinétique de formation de pores et de hemifusion.

Méthode pour la mesure de la cinétique de fusion virale au niveau particule unique

La fusion membranaire est une étape essentielle lors de l'entrée des virus enveloppés dans les cellules. Les essais de fusion conventionnels rendent généralement compte d'un grand nombre de fusion...

Les lamelles utilisées dans ce test sont fonctionnalisées avec de la dextrine, puis intégrées dans des cellules d'écoulement microfluidiques. Ensuite, chaque cellule d'écoulement est incubée avec une suspension de liposomes, qui fusionnent pour former un bicouche lipidique au-dessus de la dextrine hydratée. Au microscope à fluorescence, un virus marqué avec un fluorophore quadrichromique et une streptavidine marquée à la fluorescéine sont ajoutés, et l'on permet au virus de s'ancrer à la bicouche.Un afflux de tampon acide déclenche la fusion virale avec la bicouche, et une caméra numérique enregistre les changements de fluorescence tout au long du dosage. Bonjour, je suis Daniel Floyd, et je travaille dans le laboratoire d'Anine Vanian au Département de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire de l'Université Harvard. Aujourd'hui, je vais vous présenter une méthode permettant de visualiser la cinétique de fusion virale au niveau de la particule unique.Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier la manière dont le virus parvient aux cellules hôtes. Commençons donc. Commencez ce protocole en préparant les lamelles fonctionnalisées au dextrane.La première étape consiste à soniquer les lamelles dans des solutions de détergent à 10 %, de potasse alcoolisée à un molaire, et d'éthanol à 100 %, pendant 30 minutes par solution. Rincez à l'eau déionisée entre chaque étape. Après la dernière sonication, rincez les lamelles à l'eau, puis faites-les sécher dans l'incubateur à 80 degrés Celsius.Ensuite, placez les lamelles dans un décapeur à plasma d'oxygène pendant trois minutes. Cette étape oxyde la surface des lamelles, rendant le verre uniformément hydrophile et réactif lors des étapes suivantes de silanisation. Ensuite, immergez les lamelles dans une solution fraîche de 0,2 % gly oxypropyl triméthoxypropyl triméthoxysilane dans l'isopropanol et incubez pendant cinq minutes.Ensuite, rincez plusieurs fois les lamelles avec de l'isopropanol. Placez les lamelles recouvertes de SLAN à 80 degrés Celsius pendant une heure. Cette étape de durcissement permet au SLAN de se lier covalemment au verre.Après polymérisation, disposer les lamelles à plat à l'intérieur d'une boîte plastique pour congélateur. Recouvrir la surface supérieure de chaque lamelle d'environ un millilitre de solution de dextrine, à 30 % poids par volume dans l'eau.Fermer la boîte de congélation et laisser les lames dans un endroit calme pendant 24 à 36 heures. Le jour suivant, verser l’excès de dextrine, saisir les lames avec des pinces en plastique et les remettre dans le support en céramique. Les rincer plusieurs fois à l’eau et les laisser tremper dans l’eau pendant 48 heures.Le récipient peut être doucement agité sur un rotateur de table, puis les lames couvre-objets sont séchées dans une étuve réglée à 80 degrés Celsius et stockées dans un dessiccateur sous vide jusqu’à ce que vous soyez prêt pour l’étape suivante. Enduire les lames couvre-objets avec un mélange de liposomes afin de former une bicouche plane. L’étape suivante consiste à préparer les liposomes pour former la bicouche lipidique sous hotte : mélanger tous les lipides dissous dans le chloroforme dans un tube à essai en verre.La formulation de liposomes comprend un side dia ganglia, qui se lie aux particules virales, et un lipide biotinylé, qui se lie à l'indicateur de pH conjugué à la streptavidine, la fluorescéine. Ensuite, évaporez le solvant sous un courant de gaz argon ou azote. Puis éliminez le solvant résiduel en laissant le tube à essai dans un dessiccateur sous vide pendant deux heures.Resuspendre le film lipidique sec dans 400 microlitres de tampon HNE. Transférer ensuite la suspension dans un tube microcentrifuge en plastique. Congeler la suspension dans un bain d'azote liquide et la décongeler dans un bain d'eau tiède.Répétez ce cycle de congélation-décongélation quatre fois après les cycles de congélation-décongélation. Utilisez un extrudeur à lipides équipé d'un filtre membranaire de 100 nanomètres pour extruder la suspension lipidique. Après 25 passages d'extrusion, la suspension doit apparaître plus transparente.Conservez les liposomes à température ambiante et utilisez-les le jour de leur préparation. Maintenant que les lipides sont prêts, préparez la cellule d'écoulement microfluidique. Commencez par prendre une lame de quartz de 20 par 20 par 3 millimètres et utilisez une fraise en diamant pour percer deux trous d'un millimètre de diamètre sur des côtés opposés.Découpez un carré de 20 millimètres sur une feuille de ruban adhésif double face à l'aide d'une lame de rasoir. Découpez une section de 15 sur 2 millimètres au centre. Retirez un côté du support du ruban et fixez le ruban sur la lame porteuse.Fixez l'autre côté sur un lamelle fonctionnalisé, maintenant découpé en morceaux de 20 centimètres de longueur de tube en polyéthylène, puis insérez-les dans les trous de la lame de quartz. Enfin, scellez la cellule d'écoulement avec de la colle époxy de prise rapide (cinq minutes). Appliquez la colle autour des bords de la lame de quartz afin de l'assembler au lamelle.Utilisez deux gouttes de colle supplémentaires pour sceller la connexion entre le tube et la lame de quartz. Une fois la colle polymérisée, purgez la cellule d'écoulement et le tube avec du tampon HNE. Ensuite, pour créer le bicouche lipidique supportée, prenez la suspension de liposomes extrudés et introduisez environ 80 microlitres dans les canaux la veille de l'expérience de fusion.Commencez par marquer les particules virales afin de colorer en rouge l'intérieur viral. Mélangez 20 microlitres de solution de sulfur rhamine fraîchement préparée, ou SRB, avec 10 microlitres de la suspension virale et laissez agir à température ambiante pendant 20 heures. Le jour suivant, éliminez l'excès de colorant en faisant passer la suspension virale à travers une colonne de désalinisation PD 10 et en diluant avec 800 microlitres de tampon HNE.La colonne doit présenter une bande colorée bien visible, contenant le virus marqué. Recueillir cette fraction lors de l'étape d'ellucianisation suivante, puis marquer l'enveloppe virale en vert en ajoutant 13 microlitres d'Octa decal, RUMINE one 10 ou RH one 10 C 18 à la suspension virale marquée au SRB. Agiter la suspension en fixant le tube sur un rotateur de laboratoire et laisser pendant trois heures.Ensuite, éliminez l'excès de RH one 10 C 18 à l'aide d'une colonne de désalinisation PD 10. Comme précédemment, le virus est maintenant prêt pour le test de fusion. Réalisez le test cinétique de fusion en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'un objectif à immersion huile de grande ouverture numérique.Un laser au krypton d'Argonne excite les fluorochromes présents dans la membrane virale et à l'intérieur du virus. Un miroir dichroïque sépare ensuite les émissions de fluorescence rouge et verte et focalise indépendamment les images sur deux moitiés distinctes d'une caméra CCD à multiplication électronique ou dispositif à couplage de charge. Montez la lame couvre-objet sur la platine du microscope et reliez le tube de sortie à une pompe à seringue réglée sur un débit de 100 microlitres par minute.Éliminer les liposomes excédentaires des canaux d'écoulement en faisant circuler 300 microlitres de HNE. Focaliser le microscope et régler la puissance du laser afin d'illuminer la surface avec 350 watts par centimètre carré de lumière à 488 nanomètres pour exciter la flore rouge, et 70 watts par centimètre carré de lumière à 568 nanomètres pour exciter la flore verte. Maintenant que le microscope est prêt, injecter le virus marqué, dilué au centième, dans la cellule d'écoulement.Alors que le virus diffuse vers la surface inférieure du canal d'écoulement, les particules commencent à s'amarrer. Elles adhèrent au côté des ganglions DIA, intégrés dans les lames couvre-objets, formant une bicouche plane. Lorsque la densité des particules amarrées atteint environ plusieurs centaines de particules par champ de vision, commencez à faire circuler une solution de deux microgrammes par millilitre.La streptavidine marquée à la fluorescéine, une fluorophore sensible au pH, se lie aux molécules lipidiques couplées à la biotine dans le bicouche. Un fond vert pâle réapparaît ; rincez le canal d'écoulement avec 300 microlitres de HNE. Maintenant que les virus sont ancrés et que la surface du bicouche est recouverte de fluorescéine, il est temps de commencer le test.Choisissez une zone d'imagerie, mettez au point le microscope et préparez la caméra CCD pour l'acquisition d'images en laps de temps. Réglez le temps d'exposition à 100 millisecondes et enregistrez des images à une fréquence de 10 hertz. Déclenchez la fusion membranaire des virus en faisant circuler un tampon citrate de sodium acide.Lorsque le pH diminue, la fluorescence de la fluorescéine s'atténue, indiquant précisément le moment de l'acidification. La caméra CCD enregistre les données tout au long du test, ce qui permet de déterminer le moment de l'hémifusion et de la formation déficiente, tel que documenté par la caméra CCD. Après la chute du pH, des éclats de fluorescence verte apparaissent lorsque les membranes virale et plane fusionnent, que les lipides se mélangent et que le colorant vert présent dans l'enveloppe virale se dilue dans la membrane plane.En revanche, on observe une décroissance de la fluorescence rouge après la chute de pH, lorsque les membranes virale et lipidique forment des pores permettant au colorant rouge présent à l'intérieur du virus de s'échapper dans l'espace aqueux situé sous la bicouche plane et de disparaître du champ de vision ; ces tendances peuvent également être visualisées par des clichés fluorescents avant et pendant la fusion. Tracer également les trajectoires d'intensité de fluorescence pour chaque particule, comme illustré dans cet exemple. La fusion hémisphérique est définie comme le point où la pente de l'intensité de fluorescence verte est maximale, et la formation du pore comme le point où commence la décroissance de la fluorescence rouge. Combiner les données provenant de plusieurs expériences afin de générer des histogrammes des temps de latence de la fusion hémisphérique et de la formation du pore, comme indiqué ici, en prenant le moment de la chute de pH comme t égal zéro afin de synchroniser les données issues d'expériences différentes.Je viens de vous montrer une méthode permettant de mesurer la cinétique de fusion virale au niveau de la particule unique. Lors de cette procédure, assurez-vous d'utiliser des lamelles propres afin d'obtenir une bicouche homogène et fluide.Essayez également de minimiser la quantité de lumière utilisée pendant l'imagerie en fluorescence afin de réduire au minimum les dommages photo-induits. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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